不同葉齡楓香葉中總黃酮含量差異比較

摘要：為測(cè)定不同葉齡楓香（Liquidambar formosana Hance）葉總黃酮的含量，取不同葉齡的楓香葉，用80%乙醇以料液比1∶10超聲提取，以蘆丁為參照物，采用三氯化鋁比色法，在波長(zhǎng)421 nm處用分光光度法測(cè)定其吸光度，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算幼嫩葉、成熟葉和落葉不同葉齡的葉片總黃酮含量。結(jié)果表明，幼嫩葉、成熟葉和落葉的總黃酮含量分別為2.66%、3.27%、0.31%。高效液相色譜測(cè)定結(jié)果顯示，不同葉齡的楓香葉片黃酮類成分基本相同，但含量存在差異，其中落葉中黃酮含量最低。對(duì)嫩葉和成熟葉而言，成熟葉總峰面積要高于嫩葉峰面積約40%。因此，楓香葉中總黃酮含量與葉齡有關(guān)，成熟葉含量最高，嫩葉次之，落葉含量最低。在同等條件下，楓香葉處于成熟期時(shí)黃酮含量相對(duì)較高。在不考慮其他因素影響的情況下，成熟楓香葉是提取楓香天然黃酮的最佳資源。

關(guān)鍵詞：楓香（Liquidambar formosana Hance）；葉片；不同葉齡；總黃酮；含量

中圖分類號(hào)：Q949.751.4+83 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）16-4203-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.033

楓香樹（Liquidambar formosana Hance）屬金縷梅科（Hamamelidaceae），主要分布在中國(guó)秦嶺以及淮河以南各地，廣西壯族自治區(qū)百色市、梧州市等地有豐富的楓香樹資源。楓香葉具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛的功效，內(nèi)服可用于治療腸炎、痢疾、胃痛，外用可治療毒蜂螫傷、皮膚濕疹等。在廣西的民間盛大節(jié)日，楓香葉還用作五色糯米飯的原料。楓香葉中化學(xué)成分復(fù)雜，含有黃酮類、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多糖、單寧等大分子化合物[1，2]，其中黃酮類是重要的活性成分之一，也是五色飯中重要的色素之一。研究表明，楓香葉中黃酮類色素具有多種藥理活性，是一種良好的氧自由基清除劑和免疫調(diào)節(jié)劑，在心血管疾病、糖尿病、腫瘤的防治等方面具有較好的作用[3-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，楓香葉中除葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和花色素苷等不同色素與葉色有關(guān)外[6]，楓香葉在不同生長(zhǎng)期的黃酮含量也呈動(dòng)態(tài)變化[7]，推測(cè)黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化與楓香葉色的多變有關(guān)聯(lián)。然而查閱文獻(xiàn)所知，未見有不同葉齡（幼嫩葉、成熟葉和落葉）楓香葉黃酮含量變化的研究報(bào)道。為此，課題組通過(guò)測(cè)定不同葉齡楓香葉的黃酮含量，揭示不同葉齡的楓香葉所含黃酮的差異性，以期為楓香葉作為天然食品色素原料開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 甲醇、三氟乙酸（TFA）為色譜純，冰醋酸、醋酸鈉、無(wú)水三氯化鋁、無(wú)水乙醇、石油醚為分析純，均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)（批號(hào)：100080-200707）；色譜用水為娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器 BP211D分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；WD-9415E超聲波清洗器（北京市六一儀器廠）；722S可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；PHSJ-4A pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；戴安U3000高效液相色譜儀，帶ODS-A C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm（戴安中國(guó)有限公司）。

1.1.3 樣品的采集 楓香葉于2015年3月底采自廣西河池市羅城縣郊區(qū)。在同棵楓樹上剪取長(zhǎng)約30 cm的帶有幼嫩葉和成熟葉片的枝條若干，取上部3片剛展開的葉片定為幼嫩葉，取中下部3片成熟的葉片定為成熟葉[8]，同時(shí)在同株楓樹下?lián)烊∏鍧崯o(wú)腐敗的新鮮落葉（以下稱落葉），都于室溫條件下自然陰干，備用。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.72 mg，用甲醇充分溶解后，移至10 mL容量瓶中，定容，配成0.572 mg/mL溶液；取0.572 mg/mL溶液4 mL，用甲醇定容至10 mL，配成0.228 8 mg/mL的蘆丁溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品提取 楓香葉總黃酮提取方法參照文獻(xiàn)[9]的方法并略有改動(dòng)，將干燥的楓香葉幼嫩葉、成熟葉、落葉分別用粉碎機(jī)粉碎，分別稱取1.001 6、1.000 8、1.002 6 g于錐形瓶中，加入石油醚（料液比為1∶20）超聲提取15 min，減壓抽濾，每份樣品反復(fù)提取3次，除去葉綠素，再將濾渣加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液（料液比為1∶10）超聲提取60 min，趁熱減壓抽濾，反復(fù)提取3次，用少許80%乙醇洗滌濾渣后合并濾液，旋干后，所得固體用甲醇充分溶解，移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，作為楓香葉樣品待測(cè)液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精確稱取0.022 88 g蘆丁，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，配成0.228 8 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取該濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入2 mL 0.1 mol/L無(wú)水三氯化鋁溶液，再加入1 mL pH 5.2的醋酸鈉-冰醋酸緩沖液，用甲醇定容至10 mL，充分搖勻后，移入試管中，在40 ℃條件下水浴顯色10 min，再以空白試劑為參比在421 nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁用量-吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

1.2.4 樣品總黃酮含量的測(cè)定 精確吸取楓香葉幼嫩葉提取液0.1 mL、成熟葉提取液0.4 mL、落葉提取液0.5 mL各3份，分別置于10 mL容量瓶，按“1.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，分別取平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品總黃酮的含量。

1.2.5 HPLC黃酮成分分析 樣品處理同“1.2.2”項(xiàng)。色譜條件：流動(dòng)相為甲醇∶水（加0.3%TFA）=35%∶65%，檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.00 mL/min，梯度洗脫程序?yàn)椋孩倭鲃?dòng)相甲醇∶水=35%∶65%，流速始終保持在1.00 mL/min，在10 min內(nèi)使水的體積分?jǐn)?shù)從65%下降到60%；②在10 min內(nèi)使水的體積分?jǐn)?shù)從60%下降到50%；③在15 min內(nèi)使水的體積分?jǐn)?shù)從50%下降到20%；④在20 min內(nèi)使水的體積分?jǐn)?shù)從20%下降到0；并保持5 min。此時(shí)，主要色譜峰達(dá)到基線分離，3類樣品的各組分完全分離。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2003軟件處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作圖。應(yīng)用DPS系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

試驗(yàn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=0.452 1x+0.019 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。其中y是吸光度數(shù)值，x是0.228 8 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的用量。由圖1可知，蘆丁對(duì)照品在0.004 576 ～0.027 456 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有著良好的線性關(guān)系。

2.2 楓香葉總黃酮含量

對(duì)楓香葉幼嫩葉、成熟葉和落葉3種樣品提取液進(jìn)行測(cè)定，得到的平均吸光度值分別為0.562、0.540、

0.322，RSD分別為0.18%、0.11%、0.18%。依回歸方程分別計(jì)算出幼嫩葉、成熟葉和落葉中總黃酮的含量，并對(duì)3類葉齡葉片總黃酮含量進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見圖2。從圖2可見，楓香葉總黃酮的含量與葉齡有關(guān)，以成熟葉最高，為3.27%；嫩葉次之，為2.66%；落葉最低，僅0.31%。原因可能是楓香葉的色素類物質(zhì)含量較多，由于長(zhǎng)期暴露于外界環(huán)境中，容易受強(qiáng)光和紫外線干擾正常的生理過(guò)程，并且植物細(xì)胞在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氧自由基等有害物；而楓香在長(zhǎng)期的自然選擇與進(jìn)化的過(guò)程中，黃酮類化合物豐富這一性狀被固定了下來(lái)，并且黃酮類物質(zhì)是活性氧的清除劑，可保護(hù)楓香免受或減輕強(qiáng)光及紫外線造成的傷害，所以楓香嫩葉中由于生理活性物質(zhì)含量多，總黃酮含量也就較高[10]。當(dāng)楓香葉由嫩葉走向成熟時(shí)，盡管紫外線等外界刺激略減，但是葉中的蛋白質(zhì)開始逐漸水解，得到的產(chǎn)物苯丙氨酸、絡(luò)氨酸和纈氨酸等是合成黃酮類物質(zhì)的前體物，因而成熟葉的總黃酮含量進(jìn)一步升高。近于落葉時(shí)，由于前體物減少，加上代謝活動(dòng)降低，營(yíng)養(yǎng)成分多已流失，造成總黃酮含量劇減。

2.3 不同葉齡楓香葉HPLC分析

試驗(yàn)得到的不同葉齡楓香葉HPLC分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，在最佳的色譜條件下，楓香葉黃酮類化合物成分各個(gè)色譜峰的分離效果較好，各峰之間能較好地達(dá)到基線分離。在相同色譜條件下，同質(zhì)量不同葉齡的楓香葉所得到的色譜峰的數(shù)量與高度差異很大，以落葉的色譜峰最低，成熟葉和嫩葉的相對(duì)較高。然而，成熟葉總的峰面積要高于嫩葉峰面積的40%（計(jì)算峰面積之和條件①保留時(shí)間在2.5～60 min；②最小峰面積>10 mAU/min），說(shuō)明成熟葉的總黃酮含量最高。

黃酮類化合物是一類特殊的色素，由于存在桂皮?；捅郊柞；?，在紫外可見區(qū)域有280 nm和340 nm左右的特征吸收。因此，常采用340 nm來(lái)判斷黃酮化合物存在與否。由圖3可知，在標(biāo)記的23個(gè)色譜峰中，除2、3、5、15、20和21這6個(gè)外，其余的色譜峰在各類楓香葉中均有分布，說(shuō)明楓香葉不同葉齡的黃酮類成分基本相同，但含量存在明顯差異。其中，落葉的各個(gè)色譜峰所示的各個(gè)黃酮類化合物含量均很低，色譜峰6、7、8、9、10、12、18代表的黃酮類化合物在嫩葉和成熟葉中含量很高。此外，隨著楓香葉從生長(zhǎng)到衰老，色譜峰2、3、19、20所代表的黃酮類化合物含量消失，而色譜峰17代表的黃酮類化合物逐漸增加，說(shuō)明在不同葉齡中黃酮類化合物存在此消彼長(zhǎng)的現(xiàn)象?？傊?，在同等條件下，當(dāng)楓香葉處于嫩葉期和成熟期時(shí)，所含的黃酮類成分含量也相對(duì)較高。

3 小結(jié)

廣西壯族自治區(qū)擁有豐富的楓香樹資源，且楓香葉內(nèi)總黃酮含量較高；盡管其藥用價(jià)值很高，可作為天然抗氧化劑利用現(xiàn)階段的開發(fā)還比較少?，F(xiàn)在民間主要用作園林觀賞植物使用，少量用作民俗五色飯色素的來(lái)源，多數(shù)成為自生自滅之物。試驗(yàn)使用超聲提取法提取楓香3種不同葉齡葉片（幼嫩葉，成熟葉和落葉）的總黃酮，運(yùn)用紫外可見分光光度法測(cè)定其含量，發(fā)現(xiàn)3種楓香葉總黃酮含量高低排序?yàn)槌墒烊~、幼嫩葉、落葉，表明葉齡差異性是楓香葉總黃酮含量不同的主要原因。進(jìn)一步用HPLC揭示出成熟葉中黃酮類化合物含量遠(yuǎn)高于其嫩葉和落葉，說(shuō)明不同葉齡的黃酮含量差異很大，這與落葉的營(yíng)養(yǎng)成分流失有關(guān)。胡敬志等[6]曾測(cè)定不同月份楓香葉總黃酮的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含量在2.58%～5.73%波動(dòng)。本試驗(yàn)測(cè)得楓香葉的成熟葉中總黃酮含量最高達(dá)到3.27%，與此報(bào)道相似。因此，在不考慮其他因素的情況下，若以提取黃酮類色素為目的時(shí)，選擇成熟葉為最佳。

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