多粘芽孢桿菌中2，3—丁二醇脫氫酶的克隆和表達(dá)

摘要：將來自于多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）中的2，3-丁二醇脫氫酶基因plaC在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，該基因的表達(dá)產(chǎn)物主要是生成內(nèi)消旋型2，3-丁二醇，其氧化2，3-丁二醇的最適溫度是50 ℃，最適pH為10，而還原乙偶姻的最適溫度為60 ℃，最適pH為6。

關(guān)鍵詞：多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；2，3-丁二醇脫氫酶；乙偶姻

中圖分類號：Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4172-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.024

由于兩個手性碳原子的存在，2，3-丁二醇有3種異構(gòu)體形式：D-（-）（左旋）、L-（+）（右旋）、meso （內(nèi)消旋）。每種微生物常常合成兩種構(gòu)型的2，3-丁二醇，如Aeromonas hydrophila和Bacillus subtilis可以生成meso-2，3-丁二醇和D-（-）-2，3-丁二醇；Klebsiella pneumoniae以及Serratia marcescens則生成meso-2，3-丁二醇和L-（+）-2，3-丁二醇（以前者為主）[1，2]。研究人員在研究相關(guān)微生物的基礎(chǔ)上提出了多種2，3-丁二醇構(gòu)型的形成機(jī)制，如Ui等[3，4]最早提出了三酶催化假說，認(rèn)為兩種2，3-丁二醇脫氫酶和乙偶姻外消旋酶可產(chǎn)生3種構(gòu)型的2，3-丁二醇；而Ui等[5，6]提出了肺炎克雷伯氏菌中的2，3-丁二醇異構(gòu)體形成模型，該模型認(rèn)為乙偶姻外消旋酶是不存在的，是通過三種2，3-丁二醇脫氫酶催化而成。除了復(fù)雜的代謝途徑導(dǎo)致了2，3-丁二醇異構(gòu)體混合物形成之外，微生物培養(yǎng)條件的改變也是導(dǎo)致2，3-丁二醇異構(gòu)體形成的重要因素，Nakashimada等[7]、Ui等[8]發(fā)現(xiàn)pH和氧的供需也會影響2，3-丁二醇構(gòu)型的形成。

以上各種模型和假說表明微生物細(xì)胞中2，3-丁二醇異構(gòu)體形成機(jī)制的復(fù)雜性和多樣性，一定程度上為研究多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）中2，3-丁二醇異構(gòu)體的形成機(jī)制指明了一定的方向。

本研究致力于克隆多粘芽孢桿菌中存在的2，3-丁二醇脫氫酶基因，并且對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，為探索和揭示多粘芽孢桿菌中2，3-丁二醇異構(gòu)體形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為將來生產(chǎn)光學(xué)純2，3-丁二醇打下堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 多粘芽孢桿菌NR1為實驗室自行篩選，大腸桿菌（Escherich coli）Top10購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，質(zhì)粒pET28a為實驗室保存。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內(nèi)切酶、連接酶及Taq酶均購自TaKaRa公司。抗生素及其他生化試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和抗生素 LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5；氯化鈉10；蛋白胨10；抗生素貯存母液濃度 （mg/mL）：氨芐青霉素100；卡那霉素50。

1.2 方法

1.2.1 2，3-丁二醇脫氫酶基因plaC的克隆 根據(jù)多粘芽孢桿菌的2，3-丁二醇脫氫酶基因序列設(shè)計引物，引物分別帶有相應(yīng)的酶切位點以及保護(hù)堿基，以多粘芽孢桿菌NR1基因組DNA為模板，用引物plaCf和plaCr以高保真Primestar聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，回收后與制備好的pET28a載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上篩選重組子，得到重組載體pET28a-plaC。

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET28a-plaC轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21。從平板上挑取單菌落接種于50 mL的LB培養(yǎng)基（含50 μg卡那霉素）中37 ℃培養(yǎng)過夜。次日以1%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接入200 mL的LB培養(yǎng)基之中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)2 h左右，當(dāng)OD600達(dá)到0.5左右時，加入IPTG至終濃度為 1 mmol/L，在30 ℃搖床上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 h以上。

1.2.3 2，3-丁二醇脫氫酶酶活力單位的定義以及酶活力的測定 從兩方面測定2，3-丁二醇脫氫酶酶活，一種是以2，3-丁二醇作為底物，以NAD+為輔酶，根據(jù)NAD+在整個反應(yīng)過程中引起OD340的增加值來測定；另一個是以乙偶姻作為底物，以NADH為輔酶，根據(jù)NADH在整個反應(yīng)過程中導(dǎo)致的OD340的降低來測定（表1）。

在最適溫度、最適pH下1 min還原1 μmol NAD+的酶量或者1 min將1 μmol的NADH氧化成NAD+的酶量為一個酶活單位，反應(yīng)體系見表2。

1.2.4 酶反應(yīng)最適pH的測定 用不同pH的緩沖液配制底物，共4種不同的100 mmol/L的緩沖液體系：HAc-NaAc（pH 4.0～5.8），磷酸緩沖液（pH 5.8～7.5），Tris-HCl（pH 7.5～8.6）和甘氨酸-NaOH（pH 9～12），稀釋酶液至合適的濃度，然后根據(jù)上述方法在最適溫度下測定2，3-丁二醇脫氫酶氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻的活性，每個試驗重復(fù)3次。

1.2.5 酶反應(yīng)最適溫度的測定 在最適pH，分別測定稀釋到合適濃度的酶液在不同溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）條件下氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻的活性，每個試驗重復(fù)3次。

1.2.6 酶動力學(xué)常數(shù)Km的測定 根據(jù)所測定的反應(yīng)類型選擇其對應(yīng)的最適溫度、最適pH。測氧化2，3-丁二醇反應(yīng)使用100 mmol/L緩沖液、4 mmol/L的NAD+，反應(yīng)體系中含有光學(xué)純2，3-丁二醇的濃度為5～100 mmol/L。測還原乙偶姻反應(yīng)使用100 mmol/L緩沖液、0.2 mmol/L的NADH，反應(yīng)體系中含1～10 mmol/L的（3R/3S）-乙偶姻。

1.2.7 酶的底物特異性研究 各光學(xué)純2，3-丁二醇和乙偶姻購自Sigma公司，其他醇和雙乙酰購自國藥公司，其中測定各種醇的氧化反應(yīng)體系和條件與測定2，3-丁二醇氧化反應(yīng)相同，而測定雙乙酰的反應(yīng)體系和條件與測定乙偶姻的還原反應(yīng)相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 2，3-丁二醇脫氫酶基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

通過PCR技術(shù)從多粘芽孢桿菌基因組中克隆到plaC基因，將其成功插入到pet28a表達(dá)載體上，將篩選得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖1，可以看出該酶在大腸桿菌中成功表達(dá)。

2.2 2，3-丁二醇脫氫酶的最適反應(yīng)溫度

使用純化所得到的重組酶蛋白plaC在不同的溫度下測定酶活性，分別測定酶氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻的最適反應(yīng)溫度。由圖2可以看出，重組酶plaC氧化2，3-丁二醇的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，當(dāng)溫度高于80 ℃時，酶活性急劇下降。該酶還原乙偶姻（圖3）的最適反應(yīng)溫度是60 ℃，在70 ℃時，酶有超過60%的相對活性，而當(dāng)溫度超過80 ℃時，酶的活性逐漸下降。

2.3 2，3-丁二醇脫氫酶的最適反應(yīng)pH

根據(jù)不同的緩沖體系配制緩沖液，pH 4～12，測定重組酶plaC氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻反應(yīng)的最適pH（圖4、圖5）。由圖4、圖5可以看到，重組酶plaC氧化2，3-丁二醇的最適反應(yīng)pH為10，當(dāng)pH為11時，酶有超過60%的相對活性，pH到12之后，酶的活性會急劇下降。該酶還原乙偶姻的最適反應(yīng)pH為6，pH為7時，酶有70%的相對活性，pH超過7之后，酶活性會急劇下降，pH到9之后，該酶幾乎沒有還原乙偶姻的能力。

2.4 酶動力學(xué)常數(shù)Km的測定

按照方法中反應(yīng)體系測定酶動力學(xué)參數(shù)，得到結(jié)果見表3。按照表3中反應(yīng)體系，加入1 mg/L的純酶，測得2，3-丁二醇脫氫酶plaC相對于meso-2，3-butanediol的Km為3.42 mmol，Acetoin的Km為3.60 mmol。

2.5 酶的底物特異性研究

在最適溫度和最適pH下，分兩個方向測定該酶的底物特異性，一種是測定每個酶氧化醇類物質(zhì)的底物特異性，另一種是還原乙偶姻類物質(zhì)的底物特異性。結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，脫氫酶plaC的最適底物是內(nèi)消旋-2，3-丁二醇，幾乎沒有催化L-2，3-丁二醇和D-2，3-丁二醇的能力，結(jié)合該酶催化相應(yīng)構(gòu)型2，3-丁二醇的Km值，可以判斷plaC是內(nèi)消旋型2，3-丁二醇脫氫酶。

3 小結(jié)與討論

將多粘芽孢桿菌中的2，3-丁二醇脫氫酶plaC在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，該基因的表達(dá)產(chǎn)物主要是生成內(nèi)消旋型2，3-丁二醇，其氧化2，3-丁二醇的最適溫度是50 ℃，最適pH是10，而還原乙偶姻的最適溫度為60 ℃，最適pH為6。以上結(jié)果表明發(fā)酵條件的改變會導(dǎo)致生產(chǎn)的2，3-丁二醇不同構(gòu)型比例發(fā)生變化，此研究為進(jìn)一步揭示多粘芽孢桿菌中不同構(gòu)型的2，3-丁二醇形成機(jī)制和工業(yè)化生產(chǎn)光學(xué)純2，3-丁二醇奠定了良好的基礎(chǔ)。

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