糖化血紅蛋白檢測方法與研究進展

摘要：檢驗糖化血紅蛋白已經(jīng)成為了糖尿病監(jiān)控檢測的標準診斷方式，對糖尿病患者早期的篩查和確診起到了不可替代的作用。近年出現(xiàn)了很多與糖化血紅蛋白檢測方法相關(guān)的文獻和研究，并根據(jù)不同的檢測原理對其方法進行了科學系統(tǒng)的分類，本文對此進行研究和總結(jié)。

關(guān)鍵詞：糖化血紅蛋白；檢測方法；研究進展

糖化血紅蛋白是血紅蛋白和血液中葡萄糖緩慢、連續(xù)的非酶促不可逆反應(yīng)的產(chǎn)物，它不會受到暫時性血糖的作用和影響。因此，糖化血紅蛋白對于高血糖，尤其是血糖波動比較大的糖尿病患者具有很高的診斷價值，屬于長期控制血糖水平的重要指標，患者血液中糖化血紅蛋白的含量能夠反映其在過去2、3個月的平均血糖水平，反映糖尿病患者體內(nèi)糖代謝水平的病情控制程度。

1 糖化血紅蛋白的來源

糖化血紅蛋白是血紅蛋白和血液中葡萄糖緩慢、連續(xù)的非酶促不可逆反應(yīng)的產(chǎn)物，而HbA1c結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，約占糖化血紅蛋白的65%左右。合成糖化血紅蛋白的不可逆性使得它可以在患者體內(nèi)蓄積，并貫穿在紅細胞的整個生命周期中，同時受到紅細胞葡萄糖濃度的影響，兩者形成正比，所以血液中的葡萄糖濃度越高，與血紅蛋白反映產(chǎn)生的糖化血紅蛋白也就越高，因此糖化血紅蛋白的檢測結(jié)果具有很強的說服力和穩(wěn)定性，準確反映患者在2、3個月時間內(nèi)對血糖病情的控制情況，在臨床上有很高的參考價值。

2 糖化血紅蛋白的檢測方法

早在1968年，Rahbar就已經(jīng)證實了HbA1c是糖尿病患者的紅細胞中存在的一種異常的血紅蛋白，它與糖尿病有著非常密切的聯(lián)系。如今，檢測糖化血紅蛋白的方法已經(jīng)超過了30種，可以根據(jù)性質(zhì)與原理的不同類型。

2.1糖化、非糖化血紅蛋白電荷的差異

2.1.1離子交換HPLC法 這種方法是當前分析檢測HbA1c的標準方法，原理是依據(jù)pH7.0基礎(chǔ)上HbA1c不帶正電荷，非糖基化的HbA帶正電荷，可以通過弱酸性陽離子離子交換層析將其與其他HbAlb、HbAla等區(qū)分開，同樣根據(jù)這個原理目前也已經(jīng)開發(fā)了專業(yè)的儀器檢測分析糖化血紅蛋白，對全血中的HbA1c直接進行測定，檢測的結(jié)果不會受到異型血紅蛋白和衍生物的影響，檢測精密度很好，標本的檢測速度也非?？?，適合大批量標準同時進行測定。這種儀器在美國糖尿病控制及并發(fā)癥實驗研究中使用過，但是由于儀器過于昂貴，在當前我國基層醫(yī)院和實驗室中很難得到普及。

2.1.2電泳方法 電泳方法的原理是血紅蛋白A的β鏈，因為發(fā)生糖基化導致所帶電荷幾乎消失，在電場中涌動比較緩慢，而糖化血紅蛋白顯示為紅色，因此電泳結(jié)束以后可以直接通過對比顏色或是掃描的方式得到糖化血紅蛋白占Hb的比例。采用毛細管電泳對HbA1c進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它不會受到糖化血紅蛋白變異體的影響。電泳方法使用比較穩(wěn)定，具有較好的重現(xiàn)性，簡單且快捷，但是當前并沒有實現(xiàn)商品化價值，儀器也比較昂貴。

2.1.3等電聚焦方法 這種方法屬于一種比較新的方法，是通過在凝膠上形成一個由正極到負極遞增的pH梯度，溶血液中各組分成的HbA、HbC、HbF等移動到各自的等電點pH位置上，從而形成相對集中的帶條，分離的效果比常規(guī)的電泳方式要好得多，會由于成分不同而經(jīng)過精密光密度儀掃描處理以后做精確的定量。這種方法不會受到太多干擾物的影響，檢測的效果比較好，但是儀器的價格比較高，也很難在基層單位的常規(guī)檢測中得到很好的普及。

2.1.4微柱法 每組的電荷性質(zhì)與數(shù)量都不相同，與離子交換劑的交換吸附能力也不相同，所以這種性質(zhì)就成為了微柱法所采用的原理。當前在國外的很多公司都采用這種產(chǎn)品，它可以全自動分離血紅蛋白的變異體與亞型，測定糖化血紅蛋白的同時可以自動扣除各種干擾物質(zhì)的作用，保證了結(jié)果的準確性與可靠性，同時價格上也比較便宜，滿足了很多基層醫(yī)院使用的條件。但是手工微柱進行操作容易產(chǎn)生誤差，重復性也不夠好，且受到外界的影響比較大。

2.2血紅蛋白上糖化基團結(jié)構(gòu)的特點

2.2.1親和層析法 該方法采用硼酸能夠可逆結(jié)合含有順位二醇基的化合物特性，血紅蛋白在發(fā)生糖化反應(yīng)之后，因為結(jié)合的葡萄糖含有順位二醇基，硼酸能夠與糖化血紅蛋白相結(jié)合，沒有糖化的血紅蛋白就不能與其結(jié)合而被洗脫流出柱子，再采用較高濃度的含順位二醇基復合物或者是葡萄糖溶液將其結(jié)合到柱子上的糖化血紅蛋白完全洗脫出來，成功分離。其優(yōu)勢是不會受到異常Hb的影響，操作比較簡單和快捷，而且密度高，價格優(yōu)惠。因為血液中存在的糖類都能與血紅蛋白發(fā)生作用從而相結(jié)合，所以最后測定出來的結(jié)果不是單一HbA1c含量，而是樣品中所有糖化血紅蛋白的含量。在長期的研究實驗中，其檢測結(jié)果與高效液相等方法測定上結(jié)果都與高度有一定的關(guān)系，所以檢測的結(jié)果對糖尿病患者的檢測結(jié)果比較準確，是理想的檢測指標。

2.2.2酶法 酶法是利用果糖基反應(yīng)的特點，能夠特異性作用于糖基化小肽，于是產(chǎn)生H2O2，再利用辣根過氧化物酶與之結(jié)合反應(yīng)出色原先色。這一原理的利用，血液樣品中的血紅蛋白會先被蛋白酶水解，產(chǎn)生糖基化的小肽在辣根過氧化物酶的作用下會與特定的色原產(chǎn)生顯色反應(yīng)。這種方法在操作上比較簡單方便，不會受到變異血紅蛋白的影響，同時還能應(yīng)用與自動生化分析儀，重復性與特異性都非常好。此外，利用酶法還能直接對樣品HbA1c的百分含量進行測定，與其他方法相比，減少了測定樣品血紅蛋白總量的步驟，與HPLC法和免疫法相比有良好的相關(guān)性。

2.3抗原抗體反應(yīng)

2.3.1免疫比濁法 這種方法是利用抗體與抗原的特異性反應(yīng)，抗HbA1c的多克隆抗體或是單克隆抗體可以特異性地對HbA1cβ鏈N-末端最后4-6個氨基酸進行識別，對樣品中HbA1c含量以及血紅蛋白的含量進行測定，最后通過計算得出HbA1c占紅蛋白的百分數(shù)。其優(yōu)勢在于花費的時間較短，操作簡單，成本較低，重復性較好，缺點是容易受到黃疸等樣本因素的影響，在抗交叉污染方面較差，線性范圍也比較小。此外，還發(fā)現(xiàn)變異血紅蛋白會對檢測的結(jié)果產(chǎn)生影響，結(jié)果出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況比較多。

2.3.2膠乳凝集法 膠乳凝集法是一種間接凝集的試驗，因為膠乳可以吸附蛋白分子，所以樣品的總血紅蛋白以及HbA1c都可以被膠乳非特異性吸附，在加入HbA1c特異性單抗以后，因為抗體和抗原特異性結(jié)合而產(chǎn)生凝集。通過測定透射吸光度始終的變化反映出凝集量，通過標準曲線對其進行定量。其優(yōu)勢在于特異性比較強，重復性也比較好，進行的時間較短，而且還可以將其與自動化分析儀結(jié)合進行批量檢測。但是缺點就是測定的結(jié)果容易受到樣品中如三酰甘油、葡萄糖或是膽紅素物質(zhì)的干擾等。

2.3.3離子捕獲法 離子捕獲法也可以說成是化學發(fā)光法，糖化血紅蛋白與相對應(yīng)的抗體結(jié)合以后會以熒光標志物通過帶負電的多聚陰離子復合物吸附到帶正電荷的纖維表面，再通過多次的清洗，對其熒光前后的強度變化情況進行測定，于是測定出糖化血紅蛋白的濃度。該方法在操作上比較簡單，重復性好，并且具有很高的敏感度以及特異度，通過與自動化儀器的完美結(jié)合，在檢測批量標準的應(yīng)用中使用非常普遍。

2.4免疫傳染器法 免疫傳染器法的原理是結(jié)合場效應(yīng)管傳感器和免疫檢測，先將抗體固定在電極的表面，電極放入到處理過的血清當中，表面固定的抗體特異性結(jié)合血清中糖化血紅蛋白或是血紅蛋白形成抗體或抗原復合物，使得電極表面界面的形勢發(fā)生改變，于是引起場效應(yīng)管閾值電壓產(chǎn)生變化，等到測出糖化血紅蛋白或者是血紅蛋白的濃度和傳感器輸出的信號成正比關(guān)系以后，檢測得到實現(xiàn)。其優(yōu)點是體積較小，響應(yīng)很快，操作比較簡單，靈敏度高，其應(yīng)用的前景被看好。

2.5床邊檢測 床邊檢測在當前國內(nèi)的使用中可用于POCT，并成為它的標準定量方法，包括根據(jù)硼酸和HbA1c親和性相結(jié)合的原理，也就是硼酸特異性與HbA1c結(jié)合后呈現(xiàn)藍色，而那些沒有進行糖化反應(yīng)的血紅蛋白則不能與之結(jié)合且呈現(xiàn)紅色，根據(jù)兩種復合物光強度不同的情況就可以對HbA1c定量。另外一種則是根據(jù)免疫反應(yīng)原理利用熒光分析儀對含有HbA1c熒光染料分子斑點進行檢測以后換算成HbA1c的百分含量。這種方法適用于床邊檢測，使用便捷且速度較快，但是在準確度與精密度方面與其他的方法相比較差。

3 結(jié)語

綜上所述，如果從精度上選擇，HPLC是最為理想的一種方法，但是這種方法試驗的條件比較高，且儀器價格昂貴，在基層醫(yī)院普遍使用的可能性不大。而目前我國采用比較多的方法是手工微柱法，但它受到很多因素的干擾，容易出現(xiàn)誤差。因此，要找到最為理想的糖化血紅蛋白檢測方法還需要一定的時間和努力。早在2010年NGSP的評價報道中，出現(xiàn)了8款POCT的產(chǎn)品，這8款中有2款通過了最終的評價。因此必須結(jié)合國內(nèi)外的精華，使得研究結(jié)果在全球范圍內(nèi)都具備一定的可比性，才能有助于糖化血紅蛋白檢測方法使用價值的挖掘和推廣。

參考文獻：

[1]董彩文，李永麗.糖化血紅蛋白檢測方法的最新研究進展[J].輕工科技，2014，11（12）.

[2]李麗娟.糖化血紅蛋白與糖尿病篩查及非糖尿病人群心血管疾病等危險因素的研究[J].南方醫(yī)科大學，2013，12（01）.

[3]胡進訪.糖化血紅蛋白檢測方法學的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2014，12（13）.

[4]王麗娟，李玉鳳.不同糖化血紅蛋白檢測方法在臨床中的應(yīng)用探討[J].中國醫(yī)刊，2013，8（01）.

[5]陳富，梁藝華.兩種糖化血紅蛋白檢測系統(tǒng)的方法學比對和偏倚評估[J].實用醫(yī)學雜志，2013，11（02）.

[6]蔡玉，溫和.糖化血紅蛋白檢測方法研究進展[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，1（30）.

[7]吳迪梅，楊萍.血糖、糖化清蛋白、糖化血紅蛋白的檢測方法與臨床應(yīng)用[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，3（15）.

[8]王淑霞.變異血紅蛋白對糖化血紅蛋白兩種檢測方法的干擾[J].中國醫(yī)藥科學，2015，4（15）.

[9]王中東.探討兩種不同糖化血紅蛋白檢測方法的相關(guān)性[J].社區(qū)醫(yī)學雜志，2015，11（09）.

[10]唐世博，曹利民.糖化血紅蛋白檢測方法研究進展[J].北京生物醫(yī)學工程，2011，11（28）.

[11]秦艷萍.糖化血紅蛋白檢驗及臨床應(yīng)用研究進展[J].白求恩軍醫(yī)學院學報，2013，12（09）.

[12]吳海平.2家公司的糖化血紅蛋白檢測試劑盒的比對研究[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2012，13（11）.

[13]趙銳，吳麗琴.糖化血紅蛋白檢測方法的研究進展[J].實用醫(yī)技雜志，2014，2（15）.

[14]吳媛媛.糖化血紅蛋白在檢測中的臨床意義[J].新世界，2015，3（21）.

[15]盧玲玲.糖化血紅蛋白的單克隆抗體制備及鑒定[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2015，10（15）.

[16]李碧，雷斌.糖化血紅蛋白的檢測意義及常用方法比較[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2015，5（3）.

[17]王瑩.淺談糖化血紅蛋白檢測在診斷方面的價值[J].當代醫(yī)藥論叢，2013，11（15）.

[18]趙翠玲.不同糖化血紅蛋白檢測方法在臨床中的應(yīng)用探討[J].中國醫(yī)刊，2013，8（01）.

[19]張民.糖化血紅蛋白檢測的臨床應(yīng)用[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2015，4（30）.

[20]American Diabetes Association.Implications of the United Kingdom Prospective Diabetes Study[J].Diabetes Care，2011，12（17）.

[21]American Diabetes Association.Standards of medical care for patients with diabetes mellitus[J].Diabetes Care，2013，26（07）.

編輯/蔡睿琳