鍶污染土壤中耐鍶菌株的篩選

趙雅平，張生棟,*，陳曉明，丁有錢，宋 游，張 燕

1.中國原子能科學(xué)研究院 放射化學(xué)研究所，北京 102413；2.西南科技大學(xué) 核廢物與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621010

鍶污染土壤中耐鍶菌株的篩選

趙雅平1，張生棟1,*，陳曉明2，丁有錢1，宋 游1，張 燕1

1.中國原子能科學(xué)研究院 放射化學(xué)研究所，北京 102413；2.西南科技大學(xué) 核廢物與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621010

通過固體培養(yǎng)基平板中鍶的梯度變化，從某鍶污染土壤中篩選出了26株細(xì)菌和20株放線菌。在含鍶的液體培養(yǎng)基中，按照細(xì)菌對(duì)鍶的吸附率和耐受性不同，對(duì)細(xì)菌和放線菌開展了進(jìn)一步的篩選，并得到了四株對(duì)鍶有較好耐受性的細(xì)菌。四株菌在24 h內(nèi)的生長(zhǎng)倍數(shù)超過30倍，對(duì)鍶的吸附率皆超過20%。它們的最佳生長(zhǎng)條件為pH=6.0～7.5、溫度為20～40 ℃、鍶初始質(zhì)量濃度在0～2.0 g/L范圍內(nèi)。微生物的16S rDNA鑒定結(jié)果表明這四株菌皆為芽孢桿菌屬。

污染土壤；耐鍶性；細(xì)菌

自20世紀(jì)中葉以來，全球范圍內(nèi)多次的核試驗(yàn)和核事故，使放射性核素不可避免地進(jìn)入到了環(huán)境(大氣、水體和土壤)中。其中，核素90Sr半衰期長(zhǎng)，在環(huán)境和生態(tài)中均有較大的遷移性，能夠快速通過土壤而進(jìn)入地下水中。Sr的化學(xué)性質(zhì)與生命必需元素Ca相似，是典型的親骨性元素，進(jìn)入人體后，超過99%的90Sr會(huì)滯留于骨骼和牙齒中，易引起三致(致畸、致癌、致突變)變化[1]。

通常，受到放射性污染的土壤，可以根據(jù)放射性核素濃度的強(qiáng)弱、環(huán)境化學(xué)特性、沉積特性以及放射性半衰期的長(zhǎng)短等特點(diǎn)，采用不同的方法去除其中的放射性核素[2]。在低放射性污染土壤的治理中，包括植物修復(fù)[3-4]、微生物修復(fù)[1,5-6]及其聯(lián)合修復(fù)[7-8]的生物修復(fù)法越來越受到重視，尤其是微生物修復(fù)法是真正意義上的“綠色修復(fù)技術(shù)”。微生物修復(fù)土壤的機(jī)理主要是指微生物通過絡(luò)合、沉積、氧化、還原、甲基化和脫甲基化等作用吸收和轉(zhuǎn)化重金屬，一方面可以減緩或阻礙重金屬在土壤中的擴(kuò)散和遷移，另一方面可以改變金屬毒性，從而形成對(duì)重金屬的解毒機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)對(duì)污染土壤修復(fù)的目的。

放射性核素與微生物的相互作用研究已取得了一些重要進(jìn)展[5,9-10]，但是尋找和篩選對(duì)目標(biāo)放射性核素有抗性并具有較強(qiáng)吸收能力的微生物仍是一個(gè)十分重要的研究方向。已有研究表明，對(duì)核素90Sr有吸附作用的微生物包括細(xì)菌[11-12]、酵母[13-14]、真菌[15]和藻類[16]等。Ngwenya等[11]利用硫酸鹽還原菌(SRB) 提取核電站廢水中的Sr，結(jié)果表明，厚度0.2 μm的細(xì)胞膜可吸附大約65%的Sr2+。Khani等[17]研究了死菌體Aspergillus terreus對(duì)廢水中鍶離子的吸附，最大吸附容量可達(dá)406 mg/g。

本工作擬從某鍶加工廠附近的污染土壤中提取、分離和純化出若干株耐鍶細(xì)菌和放線菌，并通過進(jìn)一步的篩選得到對(duì)鍶有較高耐受性和吸附性的細(xì)菌菌株，同時(shí)進(jìn)行菌株的鑒定與特定條件下菌株的生長(zhǎng)行為研究，為進(jìn)一步開展耐鍶菌株對(duì)放射性90Sr的吸附研究提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

土壤樣品，鍶污染土壤來自某地鍶加工廠附近0～15 cm深度的表層污染土壤，按照五點(diǎn)法取樣，之后將土壤樣品混合。培養(yǎng)基：(1) LB細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉 15～20 g，加水至1 000 mL，pH=7.0～7.2；(2) 高氏放線菌培養(yǎng)基: 可溶性淀粉20 g，KNO31.0 g， NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.5 g， FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20.0 g，加水至1 000 mL， pH=7.2～7.4。硝酸鍶，分析純，西隴化工股份有限公司。

ZWY-2102C型全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；AC-CS12型垂直流雙面操作潔凈工作臺(tái)，北京世安科林凈化技術(shù)有限公司；TGL-10C型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；能量色散X射線熒光光譜儀，25 mm2SDD探測(cè)器，中國原子能科學(xué)研究院；JEM-6360LV型掃描電鏡，日本日立公司JEOL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土壤的理化性質(zhì)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)中稱取三份土壤樣品，烘干后用恒重法測(cè)量土壤中的含水率，之后將樣品放入馬弗爐灼燒，并計(jì)算有機(jī)相損失率。灼燒后的樣品研磨至粉末狀，用X-射線熒光法測(cè)其中的化合物含量。稱5 g土壤至25 mL蒸餾水中，150 r/min、振蕩30 min后測(cè)定其pH值。

1.2.2 土壤中微生物的分離、初篩和純化方法 稱取5.0 g土壤，加入到45 mL帶玻璃珠的滅菌蒸餾水中，并置于150 r/min、37 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。稀釋土壤液為10-1、10-2和10-3三個(gè)梯度的土壤懸液[18]。分別涂布0.1 mL土壤懸液到細(xì)菌和放線菌的固體培養(yǎng)基平板上，平行樣3個(gè)。細(xì)菌和放線菌固體培養(yǎng)基中硝酸鍶的質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 g/L。待菌生長(zhǎng)出來后，挑取單個(gè)的菌，反復(fù)進(jìn)行三線式培養(yǎng)純化，直至獲得純培養(yǎng)菌株，分別接種于LB和高氏培養(yǎng)基斜面上，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 耐鍶細(xì)菌菌株的復(fù)篩 將純培養(yǎng)的細(xì)菌菌株接種于50 mL的液體LB細(xì)菌培養(yǎng)基中，150 r/min和37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，之后通過測(cè)定600 nm處的吸光度值(optical density 600, OD600)的辦法，配制出OD600值為0.8的種子液。配制種子液菌量為10%(體積分?jǐn)?shù))、鍶質(zhì)量濃度為2.0 g/L的菌液100 mL，置于150 r/min、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)0時(shí)刻和24 h后分別取樣，用測(cè)光密度的方法測(cè)菌濃度。將菌液在8 000 r/min條件下離心5 min后取上清液，并稀釋25倍后用X射線熒光法分析其中的鍶濃度。

1.2.4 耐鍶放線菌菌株的復(fù)篩 將純培養(yǎng)的菌株接種于50 mL的放線菌培養(yǎng)基中，150 r/min和33 ℃條件下培養(yǎng)72 h。配制含0.03 g/L菌量、鍶質(zhì)量濃度為2.0 g/L的菌液100 mL，置于150 r/min、33 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。實(shí)驗(yàn)0時(shí)刻和96 h后分別取樣，菌液在75 ℃干燥箱中烘干至恒重，通過測(cè)菌干重的方法確定放線菌的生長(zhǎng)量，鍶濃度的測(cè)量同1.2.3節(jié)。

1.2.5 耐鍶菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 分別加OD600為0.8的種子液10 mL到四份90 mL 的LB空白培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。每隔一定的時(shí)間取出樣品4 mL測(cè)其中的菌濃度。實(shí)驗(yàn)中的取樣時(shí)間分別為30 min、1、3、5、7、9、11、13、24、33.5、48、57、72、81、96、144 h。

1.2.6 不同pH條件下耐鍶菌株的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 將液體LB培養(yǎng)基分別配制pH為2、4、6、7和8的體系。實(shí)驗(yàn)中配制菌液10%、鍶質(zhì)量濃度為2.0 g/L的樣品100 mL，在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。0時(shí)刻和24 h后，分別取樣分析其中的菌濃度，方法同1.2.3節(jié)。

1.2.7 不同溫度下耐鍶菌株的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 配制菌量為10%、鍶質(zhì)量濃度為2.0 g/L的樣品100 mL，分別在不同溫度條件下，即10、20、37、45 ℃，150 r/min的條件下進(jìn)行24 h的菌株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。0時(shí)刻和24 h后，分別取樣分析其中的菌濃度，方法同1.2.3節(jié)。

1.2.8 不同初始鍶濃度下耐鍶菌株的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 配制菌量為10%，初始鍶質(zhì)量濃度分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L 的菌液100 mL，在37 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。0時(shí)刻和24 h后，分別取樣分析其中的菌濃度，方法同1.2.3節(jié)。

1.2.9 菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將試管斜面上培養(yǎng)的菌株委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核酸序列的測(cè)定，將所測(cè)得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌株的16S rDNA序列進(jìn)行搜索，選取同源性較高的典型菌株的16S rDNA序列作為參比對(duì)象，再用CLUSTALX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并計(jì)算供試菌株與參與菌株之間的序列相似性，通過MEG4.0軟件構(gòu)建供試菌與參比菌之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.10 掃描電鏡樣品的制備與測(cè)量 將菌體放入3%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛固定液中，室溫固定24 h；用磷酸緩沖液漂洗樣品3～4次，之后用1%的鋨酸溶液固定2 h；再用磷酸緩沖液、不同體積分?jǐn)?shù)梯度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、100%)對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理；脫水后的樣品放入醋酸異戊酯中；最后樣品經(jīng)臨界點(diǎn)法干燥；噴金鍍膜后，即可觀察。

2 結(jié)果和討論

2.1 土壤的理化性質(zhì)

土壤類型為紫色土壤。稱重法分析表明，土壤含水率為11.2%，有機(jī)相和易揮發(fā)成分含量為7.5%，土壤酸度為pH=6.4，為偏酸性土壤。用X射線熒光法分析土壤中的主要化合物成分列入表1。由表1可知，每克土壤中元素鍶的含量為6.2 mg，這比天然土壤中鍶的平均含量0.3 mg/g要高了約20倍。

表1 土壤中的主要成份和含量

Table 1 Main composition and content in the soil

化合物w/%化合物w/%SiO266.54Al2O315.27Fe2O311.44K2O3.26TiO21.52CaO0.69SrO0.60MgO0.25SO30.11BaO0.11

土壤的pH值、水分、空氣、溫度、團(tuán)聚體、礦質(zhì)元素和有機(jī)質(zhì)等因素都會(huì)影響土壤中菌種的活性和穩(wěn)定性。其中pH 值和有機(jī)質(zhì)是比較關(guān)鍵的兩個(gè)因素，前者影響微生物活性，后者是微生物的營養(yǎng)源，同時(shí)土壤pH 值又會(huì)對(duì)有機(jī)質(zhì)有影響進(jìn)而干擾土壤微生物的活性。一般來說，pH值在中性范圍內(nèi)時(shí)土壤微生物活性最強(qiáng)，在強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性范圍內(nèi)其活性受到限制[19]。本工作中的土壤為弱酸性土壤，其中鍶含量較高，說明其中生長(zhǎng)的微生物都是耐弱酸并對(duì)鍶元素有一定耐受性的菌種。

2.2 菌株的分離和純化

將土壤懸液涂布在含鍶的平板上，細(xì)菌生長(zhǎng)4 d、放線菌生長(zhǎng)14 d后，觀察平板上菌株的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，隨著固體培養(yǎng)基中鍶濃度的增加，菌落變得干燥，面積或體積減小的趨勢(shì)很明顯，說明由于培養(yǎng)基中鍶含量的增加，抑制了細(xì)菌或放線菌的生長(zhǎng)；同時(shí)也提供了其它耐鍶菌株生長(zhǎng)的空間，因此有些種類的菌株開始在含較高鍶濃度的平板上出現(xiàn)。選取在鍶質(zhì)量濃度0.5 g/L以后出現(xiàn)在平板上的菌作為耐鍶的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行三線式培養(yǎng)，經(jīng)過反復(fù)純化，最終得到細(xì)菌26株、放線菌20株。

細(xì)菌的特點(diǎn)是表面光滑、濕潤，菌液呈粘狀，顏色以乳黃、乳白或半透明為主，形狀是圓形或不規(guī)則形狀，多以扁平為主，少部分是凸起或山包狀。放線菌表面干燥，呈粉末狀居多，也有茸毛狀，菌落上多有射線狀紋路，或周邊有齒狀，形狀有圓形或不規(guī)則形狀，有凸起，立體感強(qiáng)，顏色有白色、乳黃、亮黃、黑色、綠色等多種顏色。

2.3 土壤菌株的耐鍶性篩選

2.3.1 細(xì)菌的復(fù)篩 實(shí)驗(yàn)中，將培養(yǎng)24 h的菌液取樣分析，以得到過程中菌的濃度生長(zhǎng)情況和對(duì)鍶的吸附效果。26株細(xì)菌在24 h前后菌濃度的生長(zhǎng)變化和對(duì)鍶的吸附率結(jié)果示于圖1、2。圖1顯示26株細(xì)菌在2.0 g/L的鍶溶液中培養(yǎng)24 h后，菌濃度的增長(zhǎng)倍數(shù)超過30倍的有6種：L4、L6、L10、L14、L16和L18。圖2表明，在以上的6種菌中對(duì)鍶的吸附率相對(duì)較高的菌為L(zhǎng)4、 L10、L14和L18，吸附率分別為26.0%、24.0%、24.1%和17.7%。

ρ0(Sr)=2.0 g/L圖1 細(xì)菌生長(zhǎng)24 h后菌濃度的增長(zhǎng)倍數(shù)Fig.1 Magnification of bacteria concentrations in 24 h

圖2 細(xì)菌生長(zhǎng)24 h后對(duì)鍶的吸附率Fig.2 Adsorption rate of Sr with the growth of bacteria in 24 h

2.3.2 放線菌的復(fù)篩 放線菌是在34 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，作為一個(gè)生長(zhǎng)周期。培養(yǎng)前后菌濃度生長(zhǎng)倍數(shù)和對(duì)鍶的吸附率的結(jié)果示于圖3、4。由圖3、4可知，在20種放線菌中，菌濃度增長(zhǎng)倍數(shù)最大的菌是G12，增長(zhǎng)了28倍；對(duì)鍶吸附率最大的菌是G3，吸附率為12%。

圖3 放線菌生長(zhǎng)96 h后菌的增長(zhǎng)倍數(shù)Fig.3 Magnification of actinomyces concentrations in 96 h

圖4 放線菌生長(zhǎng)96 h后對(duì)鍶的吸附率Fig.4 Adsorption rate of Sr with the growth of actinomyces in 96 h

從以上對(duì)細(xì)菌和放線菌的篩選結(jié)果來看，細(xì)菌相對(duì)于放線菌有較好的生長(zhǎng)速率和對(duì)鍶更高的吸附率。尤其菌株L4、 L10、L14和L18在2.0 g/L的鍶溶液中，生長(zhǎng)勢(shì)態(tài)良好，對(duì)鍶既有較高的耐受性也有較大的吸附率。因此，最終選擇菌株L4、L10、L14和L18為有較好鍶耐受性的菌株。

2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線

在150 h內(nèi)分別跟蹤了菌株L4、L10、L14和L18的生長(zhǎng)情況，結(jié)果示于圖5。由圖5可知：在細(xì)菌生長(zhǎng)的前12 h，是指數(shù)增長(zhǎng)期，之后生長(zhǎng)速率放慢；在生長(zhǎng)的33 h附近，體系中菌濃度達(dá)到最大，之后菌的生長(zhǎng)到達(dá)平臺(tái)期或消亡期。四株菌株中，L14 繁殖速率快，菌的生命周期也較長(zhǎng)；L4和L10的生長(zhǎng)速率雖然不同，但它們的生長(zhǎng)過程很近似，幾乎同步時(shí)間到了菌濃度最大處，之后菌濃度逐漸減少；L18最先到達(dá)生長(zhǎng)濃度最大值，凋亡速率也是明顯快于其它幾株菌。

▲——L4，*——L10， ■——L14，●——L18圖5 菌株L4、L10、L14和L18的生長(zhǎng)曲線圖Fig.5 Magnification of bacteria concentration of L4, L10, L14 and L18 strains

2.5 不同pH條件下耐鍶菌株的生長(zhǎng)

不同初始pH條件下，各個(gè)菌株在含鍶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，菌濃度的生長(zhǎng)倍數(shù)示于圖6。由圖6可知：在pH=2.0和pH=4.0的初始酸度條件下，菌株幾乎不生長(zhǎng)；在pH=6.0和pH=8.0的初始條件下，菌的生長(zhǎng)受到抑制；在pH為6.0～7.5范圍內(nèi)為菌的最佳生長(zhǎng)條件。

■——L4，●——L10，▲——L14，*——L18圖6 在不同初始pH值時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)24 h后的生長(zhǎng)倍數(shù)Fig.6 Magnification of bacteria concentration after 24 h in different initial pH values

不同的微生物都有自己最合適的生長(zhǎng)酸范圍。微生物生長(zhǎng)的pH環(huán)境會(huì)影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，進(jìn)而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而導(dǎo)致菌種的生長(zhǎng)活性。在生物吸附過程中，pH會(huì)影響微生物膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，影響生物官能團(tuán)的活性和金屬離子間的競(jìng)爭(zhēng)，是影響生物吸附的最重要條件。

2.6 不同溫度下耐鍶菌株的生長(zhǎng)

■——L4，●——L10，▲——L14，*——L18圖7 不同溫度下細(xì)菌培養(yǎng)24 h后的生長(zhǎng)倍數(shù)Fig.7 Magnification of bacteria concentration after 24 h at different temperatures

不同實(shí)驗(yàn)溫度下，各個(gè)菌株在含鍶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，菌濃度的生長(zhǎng)倍數(shù)示于圖7。由圖7可知，這四株菌在小于20 ℃和高于40 ℃的生長(zhǎng)環(huán)境里，生長(zhǎng)速率嚴(yán)重受阻，以至于在10 ℃和45 ℃的環(huán)境里會(huì)快速死亡，說明這四株菌都不耐低溫和高溫。

溫度是影響微生物生長(zhǎng)的最重要因素之一。通常，溫度變化會(huì)影響酶促反應(yīng)速率，即影響酶活性。同時(shí)溫度影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，溫度高流動(dòng)性大，有利于物質(zhì)的運(yùn)輸；溫度低，不利于物質(zhì)運(yùn)輸，因此溫度的變化會(huì)影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。這些都是最終影響細(xì)胞的合成和繁殖的重要因素。在微生物中，有一類是嗜冷或嗜熱微生物，這與它們體內(nèi)存在耐冷或耐熱的酶、核酸或脂肪含量等有關(guān)。

2.7 不同初始鍶濃度下耐鍶菌株的生長(zhǎng)

培養(yǎng)基體系中初始鍶濃度不同時(shí)，24 h后各菌株菌濃度的變化示于圖8。由圖8可知，當(dāng)體系中鍶的初始質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)，對(duì)菌生長(zhǎng)的抑制作用很??；隨著初始鍶濃度的增加，抑制效應(yīng)越來越明顯；尤其當(dāng)初始鍶質(zhì)量濃度大于8 g/L時(shí)，各個(gè)菌都停止生長(zhǎng)。通過趨勢(shì)的變化可以發(fā)現(xiàn)，雖然菌株L14和L18在低濃度鍶(<2.0 g/L)時(shí)生長(zhǎng)的很旺盛,但當(dāng)鍶濃度增大，兩種菌株的生長(zhǎng)則很快停滯；相比來說，菌株L4對(duì)大濃度鍶則更有耐受性。

2.8 耐鍶菌株的16S rDNA 全序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

16S rDNA普遍存在于原核生物細(xì)胞之中，為蛋白質(zhì)合成的必要場(chǎng)所，其生理功能重要而恒定。細(xì)菌的16S rRNA結(jié)構(gòu)的保守性能夠反映生物物種的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索，16S rDNA可以通過PCR法擴(kuò)增獲得，從而得到菌株DNA序列的堿基對(duì)譜圖。

將得到的菌株L4、L10、L14和L18的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLASTN核酸序列查詢庫中的序列比較，結(jié)果顯示，這四株菌的16S rDNA與芽孢桿菌屬菌株的16S rDNA的序列高度同源。用CLUSTAL X選取同源性較高的典型菌株的序列進(jìn)行相似性分析，最后得到了4株菌的生長(zhǎng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)示于圖9。由圖9可知，菌株L4、L14 與L18在同一支，它們的同源性更為緊密一些。菌株L4 與蠟狀芽孢桿菌亞種NR 121761、蘇云金芽孢桿菌NR 043403的進(jìn)化距離最為接近，同源性可達(dá)99%。菌株L10與沙芬西芽孢桿菌KM 817280、短小芽孢桿菌KC692169的進(jìn)化同源性也達(dá)到99%。

(a)——L4，(b)——L10，(c)——L14，(d)——L18圖8 不同初始鍶濃度下各個(gè)菌株的生長(zhǎng)情況Fig.8 Magnification of bacteria concentration in different initial concentration of Sr

圖9 菌株L4、L10、L14和L18的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.9 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of bacteria strain L4, L10, L14 and L18

2.9 菌株的形貌觀察

菌株L4、L10、L14和L18的掃描電鏡結(jié)果示于圖10。由圖10可知，菌株L4、L10和L18是柱狀形貌，并且菌生長(zhǎng)到一定程度會(huì)自行分裂為若干短柱狀菌體，因此長(zhǎng)度為1～10 μm不等；菌株L14也是由長(zhǎng)菌體逐級(jí)分裂成的，但菌體形貌更為圓潤，為橢圓形，長(zhǎng)度上也較短。

3 結(jié) 論

(1) 從鍶污染土壤中分離、純化及篩選出了四株有較高耐鍶性及對(duì)鍶吸附率較好的菌株：L4、L10、L14、L18。

(2) 四個(gè)耐鍶菌株在純的培養(yǎng)基體系中的指數(shù)生長(zhǎng)期為0.5 d，最大菌濃度出現(xiàn)在1.5 d。在含鍶體系中，四個(gè)菌株的最佳生長(zhǎng)條件為pH=6.0～7.5、溫度為20～40 ℃、鍶初始質(zhì)量濃度在0～2.0 g/L。

(3) 四株菌的16S rDNA的全序列測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，它們都屬于芽孢桿菌屬，形貌觀察結(jié)果表明它們都是柱狀菌。

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(a)——L4，(b)——L10，(c)——L14，(d)——L18圖10 菌株的掃描電鏡圖(×10 000)Fig.10 SEM of four bacteria(×10 000)

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Screening of Microorganism From Contaminated Soil

ZHAO Ya-ping1, ZHANG Sheng-dong1,*, CHEN Xiao-ming2,DING You-qian1, SONG You1, ZHANG Yan1

1.China Institute of Atomic Energy, P. O. Box 275(26), Beijing 102413, China；2.Nuclear Wastes and Environmental Safety Laboratory,Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China

Through the method of changing Sr concentration in solid medium gradually, 26 strains bacteria and 20 strains actinomyces were isolated from the strontium contaminated soil. Four strains of strontium-resistance bacteria have been selected by the further studies in liquid culture. Magnifications of four bacteria concentration are all more than 30 times and adsorption rates of Sr are more than 20%. The study results show that the bacteria’s optimum growth condition are pH=6.0-7.5,θ=20-40 ℃,ρ0(Sr)=0-2.0 g/L. Identification results show that the microorganism are all subject to Bacillus according to analysis results of 16S rDNA.

contaminated soil; strontium-resistance; bacteria

2015-04-16；

2015-05-13

趙雅平(1977—)，女，甘肅蘭州人，博士，副研究員，核燃料循環(huán)與材料專業(yè)

*通信聯(lián)系人：張生棟(1966—)，男，甘肅景泰人，研究員，核燃料循環(huán)與材料專業(yè)，E-mail: zhangsd@ciae.ac.cn

X591

A

0253-9950(2016)06-0371-07

10.7538/hhx.2016.YX.2015031