黑麥多酚提取工藝及體外清除亞硝酸鹽研究

郝教敏 楊文平 李紅玉 楊珍平 韓雪梅

黑麥多酚提取工藝及體外清除亞硝酸鹽研究

郝教敏1楊文平2李紅玉3楊珍平4韓雪梅1

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，太谷 030801）
（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2，唐山 063000）
（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處3，太谷 030801）
（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院4，太谷 030801）

為優(yōu)化黑麥多酚提取工藝，并評(píng)價(jià)其體外清除亞硝酸鹽能力，試驗(yàn)比較了水和乙醇對(duì)黑麥多酚得率的影響，確定乙醇為提取劑；進(jìn)一步采用單因素試驗(yàn)和三元二次正交試驗(yàn)，分析乙醇濃度、乙醇用量、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)黑麥多酚得率的影響并優(yōu)化工藝參數(shù)；最后對(duì)黑麥多酚體外清除亞硝酸鹽能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液提取黑麥多酚的最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇用量59 mL（即料液比1∶11.8），54℃水浴48 min，得率2.10 mg／g；三因素對(duì)黑麥多酚得率的主效應(yīng)是乙醇用量（X3）＞提取溫度（X1）＞提取時(shí)間（X2）；交互效應(yīng)為X1X3＞X2X3＞X1X2；黑麥多酚具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽能力，當(dāng)提取液用量超過5 mL時(shí)，清除率可達(dá)84%以上。

黑麥 黑麥多酚 提取工藝 亞硝酸鹽 清除率

天然植物抗氧化劑相比人工合成的抗氧化劑更安全、健康和無毒，已引起人們的廣泛關(guān)注并成為當(dāng)今食品科學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)。植物多酚是植物體內(nèi)復(fù)雜酚類次生代謝物，具有多元酚結(jié)構(gòu)［1］，是一類具有獨(dú)特生理活性和藥理活性的天然產(chǎn)物，主要存在于植物的皮、根、莖、葉和果實(shí)中。研究表明，植物多酚具有抗氧化、抗病毒、抗輻射、抗癌、抑菌、抑制心腦血管疾病等生物活性功能［2-4］，對(duì)清除亞硝酸鹽也有一定的作用［5］，在食品、制藥、生化及日化等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。黑麥又稱裸麥、黑小麥，為禾本科黑麥屬1年生草本植物，富含淀粉、膳食纖維（可達(dá)13%～19%）［6］、脂肪、蛋白質(zhì)、B 族維生素和磷、鉀等多種重要營(yíng)養(yǎng)素及多種生物活性物質(zhì)［7-8］，

具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用，開發(fā)和利用潛力較大。但有關(guān)黑麥多酚的提取工藝及清除亞硝酸鹽能力的研究甚少。本研究采用水浴浸提法，通過單因素試驗(yàn)和三元二次正交試驗(yàn)分析了黑麥多酚提取的主要影響因素，并優(yōu)化了提取的工藝條件，同時(shí)，考察了黑麥多酚清除亞硝酸鹽的能力。為黑麥深加工及黑麥多酚的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)原料

黑麥（Secale cereale L.，禾本科，黑麥屬）籽粒，引自加拿大的“黑引1號(hào)”品種，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.1.2 試劑

無水碳酸鈉、無水乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；水合沒食子酸：成都市科龍化工試劑廠；福林酚、對(duì)氨基苯磺酸、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉等均為分析純。

1.1.3 儀器

FZ102微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；721可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；TDL-4離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

將去雜去劣篩選干凈的黑麥籽粒，按一定的比例加水潤(rùn)濕，一段時(shí)間后，用植物組織粉碎機(jī)按14%出麩率進(jìn)行粉碎，過篩，風(fēng)干。將風(fēng)干后的黑麥粉收入容器中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取水合沒食子酸40 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，移入棕色瓶。再從棕色瓶中吸取10 mL，定容到100 mL，得質(zhì)量濃度0.040 mg／mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。分別吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液于25 mL比色管中，各管分別加蒸餾水至3.5 mL，再分別加入1 mL福林酚試劑，靜置3 min，用5%（m／V）碳酸鈉溶液定容至刻度25 mL，搖勻，靜置15 min（避光）后，以0.0管的溶液為空白，于765 nm處測(cè)定吸光值。以吸光度值為橫坐標(biāo)，沒食子酸的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 黑麥多酚的提取和測(cè)定

準(zhǔn)確稱取黑麥粉5.0 g，按一定料液比加入提取劑，于一定溫度下水浴浸提一定時(shí)間，室溫下靜置28 h，過濾，得浸提液。取浸提液1 mL于25 mL比色管中，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，以不加浸提液的空白處理作參比，于765 nm處測(cè)定吸光值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得浸提液中沒食子酸的毫克數(shù)，按照公式計(jì)算黑麥多酚得率（mg／g）。

黑麥多酚得率＝提取液中沒食子酸的質(zhì)量／mg／樣品的質(zhì)量／g

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 提取劑選擇

準(zhǔn)確稱取5.0 g黑麥粉10份，分別裝入10個(gè)干凈的錐形瓶?jī)?nèi)，其中5個(gè)瓶?jī)?nèi)依次加入體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液40、50、60、70、80 mL；其余5 個(gè)瓶?jī)?nèi)分別加入相應(yīng)體積的蒸餾水，40℃水浴30 min后取出，靜置，過濾，后續(xù)步驟參照1.2.3操作。重復(fù)3次。

1.2.4.2 單因素試驗(yàn)及三元二次正交回歸設(shè)計(jì)

根據(jù)1.2.4.1的試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇為提取劑，設(shè)乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、乙醇用量（mL）、浸提溫度（℃）及浸提時(shí)間（min）4個(gè)單因素試驗(yàn)（表1）。依單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定3個(gè)主要影響因素，采用三元二次正交回歸設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。同時(shí)將正交組合中獲得的最大濃度黑麥多酚粗提液，稀釋100倍待用。

1.2.5 亞硝酸鹽清除率測(cè)定

采用對(duì)氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺分光光度法。準(zhǔn)確量取2份5μg／mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用溶液2 mL，置于50 mL容量瓶中；1份作空白對(duì)照，1份加入一定量的黑麥多酚稀釋液，搖勻，反應(yīng)一定時(shí)間；然后分別加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL，搖勻，靜置5 min；再分別加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，用蒸餾水定容至刻度線，靜置15 min；以蒸餾水作參比，于540 nm處測(cè)得吸光度。

亞硝酸鹽清除率＝［（A2-A1）／A2］×100%

式中：A1為黑麥多酚稀釋液與2%亞硝酸鈉溶液的混合液的吸光度值；A2為空白對(duì)照的吸光度值。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計(jì)與分析方法

對(duì)所得數(shù)據(jù)用Excel軟件整理制表，用Sigma-Plot10.0繪圖軟件制圖，用SAS9.1.3 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析、Duncan＇s多重比較、RSREG回歸分析、G3D過程分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 水提取劑與50%乙醇提取劑對(duì)黑麥多酚提取效果的影響

由圖1可以看出，在同一料液比下，50%乙醇提取的黑麥多酚得率更高。說明黑麥多酚得率與溶劑的極性有關(guān)，可能的原因是多酚在植物體內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖等以氫鍵和疏水鍵形式形成穩(wěn)定的化合物，而有機(jī)溶劑具有氫鍵斷裂的作用，因此乙醇溶劑更利于黑麥多酚的溶出。故選擇乙醇提取劑進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1 提取劑對(duì)黑麥多酚得率的影響

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖2可以看出，4個(gè)單因素對(duì)黑麥多酚得率均有顯著的影響（P＜0.05），且除浸提溫度外均符合開口向下的拋物線模型。其中，50%乙醇溶液提取的黑麥多酚得率最高，這可能與黑麥多酚所攜帶的酚羥基（-OH）數(shù)量有關(guān)，數(shù)量越多，極性越強(qiáng)。當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)，提取劑以乙醇相為主，極性較強(qiáng)；當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)，提取劑以水相為主，極性較弱，這2種情況下可能均難以將黑麥多酚完全浸提出來。當(dāng)50%乙醇溶液的用量達(dá)到60 mL（即料液比1∶12）時(shí)，黑麥多酚得率最大，表明樣品中的多酚可能已完全分布到提取劑中；繼續(xù)提高乙醇溶液用量，反而抑制了黑麥多酚在溶劑中的分散溶出。在20～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，多酚得率呈明顯上升趨勢(shì)（P＜0.05），這是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加速，氫鍵更易斷裂，多酚的滲透、溶解、擴(kuò)散速度也加快，因而酚類物質(zhì)更易于從原料中溶出［9-10］；當(dāng)溫度達(dá)到60℃，溶劑蒸發(fā)加快，在一定程度上抑制了多酚的溶解；進(jìn)一步提高溫度，伴隨溶劑的快速蒸發(fā)，發(fā)生淀粉糊化、蛋白質(zhì)變性、多糖等物質(zhì)溶出生成膠體物質(zhì)等，導(dǎo)致提取液渾濁度增加，吸光值陡升。在前3個(gè)因素選擇確定的基礎(chǔ)上，以浸提50 min時(shí)黑麥多酚得率最大，表明此時(shí)黑麥多酚已全部溶出；繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，可能會(huì)引起多酚類物質(zhì)分解氧化等［6］。

圖2 各因素對(duì)黑麥多酚得率的影響

2.3 正交回歸試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，進(jìn)一步采用三元二次正交設(shè)計(jì)（表2），分析提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）、乙醇用量（X3）及其交互作用對(duì)黑麥多酚得率的影響，以獲得最佳工藝。

表2 三元二次正交設(shè)計(jì)的因素水平編碼、試驗(yàn)組別及試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

采用SAS9.1.3軟件RSREG過程對(duì)表2三因素編碼水平與多酚得率指標(biāo)進(jìn)行Y＝B0+∑BjXj+∑BijXiXj+∑BjjX2j的回歸分析，得多酚得率指標(biāo)（Y）對(duì)試驗(yàn)因素X1～X3編碼間的回歸方程：

對(duì)回歸模型（1）進(jìn)行方差分析與F檢驗(yàn)可知，F(xiàn)擬合＝89.89（P ＜0.000 1），達(dá)到極顯著水平；回歸方程的決定系數(shù)R2＝0.992 6，說明模型方程差異顯著，且擬合較好。因此可以用該模型分析各工藝參數(shù)對(duì)黑麥多酚得率的影響。

對(duì)回歸模型（1）的偏回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)表明，三因素的的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.001），其中二次項(xiàng)（Xj2）均為負(fù)效應(yīng)，再次表明三因素對(duì)多酚得率的影響均符合開口向下的拋物線模型。

對(duì)三因素主效應(yīng)作顯著性檢驗(yàn)表明，三因素對(duì)多酚得率的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.001），且作用順序依次為乙醇用量＞提取溫度＞提取時(shí)間。

采用降維法將式（1）中的某一因子Xj固定在“0”編碼水平，獲得多酚得率與另外兩因子的偏回歸模型見式（2）、式（3）、式（4）。

通過SAS軟件的G3D過程分析得出，水浴醇提黑麥多酚時(shí)，提取溫度的作用大于提取時(shí)間的作用；乙醇用量的作用大于提取溫度的作用，也大于浸提時(shí)間的作用。當(dāng)溫度較低、時(shí)間較短時(shí)，提高溫度，延長(zhǎng)時(shí)間，有利于加快分子運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)多酚物質(zhì)充分溶出，多酚得率提高；當(dāng)溫度較低、乙醇用量較少時(shí)，適當(dāng)提高溫度，加大乙醇用量，有利于促進(jìn)多酚物質(zhì)向溶劑溶出、擴(kuò)散；當(dāng)這些因素達(dá)到一定程度后，繼續(xù)提高溫度，延長(zhǎng)時(shí)間，或增加溶劑用量，反而會(huì)降低多酚得率。

由SAS軟件RSREG過程中三因素典型性分析結(jié)果可知，提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和乙醇用量（X3）分別為54℃（對(duì)應(yīng)編碼值0.358）、48 min（對(duì)應(yīng)編碼值-0.072）和59 mL（對(duì)應(yīng)編碼值-0.024）時(shí)，黑麥多酚得率最大，值為2.10 mg／g。經(jīng)實(shí)測(cè)驗(yàn)證該最佳工藝的提取得率為2.09 mg／g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007。所以該模型較好地反映了各因素對(duì)黑麥多酚得率的影響。

2.4 黑麥多酚對(duì)亞硝酸鹽的清除能力分析

將正交組合中獲得的最大濃度黑麥多酚粗提液（0.244 mg／mL）稀釋100 倍后，進(jìn)行亞硝酸鹽清除能力測(cè)定（圖3）。結(jié)果表明，黑麥多酚稀釋液對(duì)亞硝酸鹽具有明顯的清除作用（P＜0.05）；當(dāng)其用量為5 mL時(shí)，清除率達(dá)84.30%；繼續(xù)增加用量，對(duì)亞硝酸鹽清除率變化不大，這可能是由于黑麥多酚與亞硝酸鹽之間的反應(yīng)已達(dá)到相對(duì)飽和狀態(tài)所致。

圖3 黑麥多酚對(duì)亞硝酸鹽的清除能力

3 討論

3.1 黑麥多酚水浴浸提工藝探討

水浴浸提法提取植物多酚，常用的溶劑有水、甲醇、乙醇、丙酮，考慮到甲醇和丙酮的毒性較大，所以本研究?jī)H比較了水和乙醇溶液的多酚提取效果，并確定乙醇溶液為提取劑。根據(jù)多酚來源不同，浸提劑種類及濃度、浸提溫度及時(shí)間等提取條件和主要影響因素均有所不同［11-13］。本研究結(jié)果表明，影響黑麥多酚得率的主效應(yīng)是乙醇用量＞提取溫度＞提取時(shí)間，而且三因素之間亦存在明顯的互作效應(yīng)。當(dāng)50%乙醇用量、提取溫度、提取時(shí)間的最適條件分別為59 mL（即料液比1∶11.8）、54 ℃、48 min 時(shí)，多酚得率最大（2.10 mg／g）。乙醇溶劑提取多酚，操作簡(jiǎn)單易行，提取率相對(duì)較高，所得產(chǎn)品更安全，成本較低，因此可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 黑麥多酚清除亞硝酸鹽能力及其物質(zhì)組成探討

亞硝酸鹽是生成亞硝胺的前體物質(zhì)，而亞硝胺（也稱N-亞硝基化合物）具有強(qiáng)致癌性［14］，故亞硝酸鹽的存在危害人體的健康。據(jù)資料表明，上市的各類熟肉制品的合格率平均僅為60.4%～87.0%，添加天然無毒的物質(zhì)清除亞硝酸鹽已成為當(dāng)今一個(gè)熱門研究課題［15］。Tsai等［16］和Huang 等［17］研究表明綠茶、中草藥、紅薯葉提取物都具有清除亞硝酸鹽的作用。本研究結(jié)果顯示，黑麥多酚具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽能力，且隨著用量的增加清除率增大。前人研究表明，黑麥中含有阿魏酸、黃酮、烷基間苯二酚、木質(zhì)素（也叫木酚素）、植物甾醇類等生理活性物質(zhì)［7-8，18］，其中的阿魏酸對(duì)于過氧化氫、超氧自由基、羥基自由基、過氧化亞硝基具有強(qiáng)烈的清除作用［19-20］；烷基間苯二酚（ARs）僅麥類中含量較高，能夠清除自由基和抗脂質(zhì)氧化；木質(zhì)素分子中常含有醇羥基、酚羥基、甲氧基、亞甲二氧基、羧基及內(nèi)酯等基團(tuán)，因而也具有這些功能基團(tuán)的性質(zhì)和反應(yīng)。此外，黑麥多酚中還包含生育酚、麥黃酮等。本文作者通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-C18柱），也初步判斷黑麥多酚包含有阿魏酸、綠原酸、麥黃酮等物質(zhì)成分。因此，后續(xù)研究將著重于黑麥多酚物質(zhì)成分的定性及定量檢測(cè)。

4 結(jié)論

黑麥多酚水浴浸提的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶11.8、54 ℃水浴48 min，多酚得率2.10 mg／g。經(jīng)實(shí)測(cè)驗(yàn)證該最佳工藝的多酚得率為2.09 mg／g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007。黑麥多酚提取液對(duì)亞硝酸鹽有明顯的清除作用，隨著多酚用量的增加，清除率快速增加，可達(dá)84%以上。

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Extraction Process of Rye Polyphenols and Its Scavenging Capability to Nitrite in vitro

Hao Jiaomin1Yang Wenping2Li Hongyu3Yang Zhenping4Han Xuemei1
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801）
（College of Life Science，North China University of Science and Technology2，Tangshan 063000）
（Department of Science and Technology，Shanxi Agricultural University3，Taigu 030801）
（College of Agriculture，Shanxi Agricultural University4，Taigu 030801）

In order to optimize the extraction process of rye polyphenols and to evaluate scavenging capability to nitrite in vitro，ethanol was ascertained as an extracting solvent by comparing the effects of distilled water with ethanol on the extraction yield of rye polyphenols.Then，single-factor experiment and ternary quadratic orthogonal design were adopted to analyze the effects of ethanol concentration，ethanol volume，extraction temperature and extraction time on the yield of rye polyphenols and to optimize extraction process parameters.In final，the scavenging rate of rye polyphenols to nitrite in vitro was determined.Results showed that optimum process parameters of 50%ethanol-water solution extracting rye polyphenols were as followed：ethanol volume 59 mL （i.e.，the ratio of material and solvent was1∶11.8），extracted in the water bath for 48 min at 54 ℃，and the yield of rye polyphenols was2.10 mg／g.The major effects of three factors on the yield of rye polyphenols were ethanol volume（X3）＞extraction temperature（X1）＞extraction time（X2），the mutual effects between two factors were X1X3＞X2X3＞X1X2.Rye polyphenols had a stronger scavenging capacity to nitrite，and the scavenging rate reached above 84%when the dosage of extracting solution was more than 5 mL.

Rye（Secale cereale L.），rye polyphenols，extraction process，nitrite，scavenging rate

S512.5；TS21

A

1003-0174（2016）11-0118-06

山西省科技攻關(guān)（20110311001-4），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校育種基金（2014yz2-8）

2015-01-28

郝教敏，男，1974年出生，副教授，天然植物活性成分在肉制品中的應(yīng)用

楊珍平，女，1973年出生，教授，植物資源學(xué)及植物生理生態(tài)