NMR結(jié)合GC-MS技術(shù)分析魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成

徐彤硯 董亞飛 楊文鴿 徐大倫 張進杰 樓喬明

NMR結(jié)合GC-MS技術(shù)分析魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成

徐彤硯 董亞飛 楊文鴿 徐大倫 張進杰 樓喬明

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

利用NMR結(jié)合GC-MS技術(shù)對魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成分析。1H NMR結(jié)果表明，魷魚肝臟總脂脂肪酸中，多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量比約為7∶5，n-3型多不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的35%；13C NMR結(jié)果表明，魷魚肝臟總脂以甘油三酯（71.87%）為主，其次是游離脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），膽固醇（1.13%）和膽固醇酯（0.73%）含量較低，魷魚肝油中的DHA和EPA主要以游離形式存在，分別占DHA總量和EPA總量的61.24%和63.11%；GC-MS結(jié)果顯示，魷魚肝臟總脂脂肪酸主要為C16∶0、C18∶1、C20∶1、EPA和DHA，多不飽和脂肪酸的含量高達38.80%，且EPA和DHA占脂肪酸總量的31.50%，表明魷魚肝臟具有較高的營養(yǎng)價值及開發(fā)前景。

魷魚肝臟 NMR GC-MS 油脂 脂肪酸

魷魚屬軟體動物門（Mollusk），頭足綱（Cephalopods），十腕目（Decapoda），又名“槍烏賊”、“柔魚”，具有生長周期短、繁殖力強等特點，是世界上最具開發(fā)潛力的海產(chǎn)品之一。目前我國魷魚的年捕獲量約為80萬t，占據(jù)世界魷魚捕獲量的36%左右，是我國重要的遠洋捕撈品種。近年來隨著魷魚加工產(chǎn)量的日益擴大，加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物也逐年遞增，這些副產(chǎn)物大部分直接被加工成經(jīng)濟價值較低的魚粉和飼料，有的甚至直接丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費。魷魚肝臟是魷魚加工的主要副產(chǎn)物，約占魷魚總重的15%～20%，魷魚肝臟脂質(zhì)含量高，富含EPA和DHA等多不飽和脂肪酸，具有抗動脈硬化，降血壓和降血脂的功效，可以作為多不飽和脂肪酸的重要膳食來源［1-2］。因此，魷魚肝臟如能得到進一步精深加工，不僅可以減少資源浪費和環(huán)境污染，還能獲得良好的經(jīng)濟價值和社會效益。

核磁共振（NMR）是一種新型無損檢測技術(shù)，具有快速、準確、前處理簡單、不破壞樣品、重復(fù)性高等優(yōu)點，通過核磁共振技術(shù)不僅能判斷樣品的純度，還能測定樣品中不同組分所占的含量［3］。關(guān)于核磁共振技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)分析油脂組分的研究報道很多，如Lech等［4］利用1H譜和13C譜分析了防護林土壤中不同脂質(zhì)組分的含量，Vidal等［5］利用1H譜分析了養(yǎng)殖鱸魚和野生鱸魚的脂質(zhì)組成差異，Davey等［6］利用1H譜實現(xiàn)了微藻中三酰甘油的快速檢測和定量，郭無瑕等［1］和高娟等［2］利用GC-MS技術(shù)分析了魷魚肝臟脂質(zhì)的脂肪酸組成。目前，將NMR技術(shù)結(jié)合GC-MS技術(shù)分析油脂組成的研究鮮見報道。因此，本研究采用NMR技術(shù)分析魷魚肝臟油脂組成，并結(jié)合GC-MS技術(shù)對魷魚肝臟油脂的脂肪酸組成進行分析鑒定，以便進一步了解魷魚肝臟油脂的組成，為肝臟油脂品質(zhì)鑒定及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮魷魚肝臟：寧波豐群食品有限公司。

37種脂肪酸甲酯混標：美國Sigma公司；氯仿、甲醇、正己烷、氘代氯仿、氯化鈉、無水硫酸鈉、濃硫酸等分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

AVANCEⅢ400 MHZ核磁共振譜儀：德國Bruker公司；7890A型氣相色譜儀：美國Agilent儀器有限公司；M7-80EI型質(zhì)譜儀：北京普析通用儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：西安安泰儀器科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 油脂提取

參照Folch法［7］提取，取10 g新鮮魷魚肝臟勻漿，加70 mL甲醇，振蕩30 min后加140 mL氯仿，浸提24 h后過濾，濾液中加40 mL 0.9%的氯化鈉溶液，振蕩靜置分層后，分離下層氯仿層，用無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，得到魷魚肝臟總脂。

1.2.2 核磁共振

取總脂20 mg，加0.6 mL氘代氯仿，轉(zhuǎn)移至核磁管中用于核磁共振分析，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標，采用標準的一維氫譜脈沖程序和氫去耦的碳譜脈沖程序分別采集氫譜和碳譜。采集氫譜的參數(shù)為：探針溫度298 k，波譜頻率400.23 MHz，采點數(shù)12 082，譜峰寬度8 223.68 Hz；采集碳譜的參數(shù)為：探針溫度298 k，波譜頻率100.64 MHz，采點數(shù)32 768，譜峰寬度24 038.46 Hz。

1.2.3 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg油脂，加入1 mL 5%的濃硫酸-甲醇溶液，于70℃水浴加熱1 h，冷卻后加1 mL正己烷，靜置分層，取上層清液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后用于GC-MS分析。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm），進樣量1 μL，不分流模式，進樣口溫度250℃，檢測器溫度250℃，柱流量為1 mL／min。升溫程序為50℃保持1 min，以20℃／min升至200℃，再以3℃／min升至230℃，保持15 min，

最后以3℃／min升至240℃，保持13 min，整個過程用時50 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，離子源溫度250℃，掃描周期2.84 次／s，質(zhì)量掃描范圍m／z50～500 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振譜圖分析

2.1.1 氫譜分析

核磁共振譜峰積分和濃度成正比，因此可以根據(jù)特征譜峰計算油脂中不同組分所占的含量［8］。如圖1所示，化學位移為0.94～0.97 ppm的譜峰為n-3型多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）的-CH3信號，而0.82～0.89 ppm的譜峰為除n-3 PUFA外所有脂肪酸的-CH3信號，通過比較兩者的譜峰積分可得n-3 PUFA與其他脂肪酸的比例，由此可得n-3 PUFA占脂肪酸總量的35%?；瘜W位移為2.25～2.33 ppm和2.34～2.40 ppm的譜峰分別為飽和脂肪酸（SFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）的-CH2-COOH信號，由此可得PUFA和SFA的含量比為7∶5。

圖1 魷魚肝臟總脂氫譜譜峰

2.1.2 碳譜分析

核磁共振氫譜譜峰化學位移分散度低，同核耦合產(chǎn)生裂分影響分辨率，并且不能觀察不含氫的碳基團，而采用碳譜能得到更加精細的譜峰，能夠提供結(jié)構(gòu)鑒定的重要信息，因此是分析油脂常用的方法［9-11］。試驗對魷魚肝臟總脂進行了13C NMR分析，并將部分譜峰歸屬列于表1，總脂碳譜譜圖如圖2、圖3所示。由圖2可知，甘油三酯、游離脂肪酸、膽固醇、膽固醇酯和磷脂的特征譜峰化學位移分別為61.99、180～177、71.69、73.67 和61.05 ppm。通過比較特征譜峰的積分得到不同組分的含量，其結(jié)果如表2所示，魷魚肝臟總脂以三酰甘油（71.87%）為主，其次是游離脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），膽固醇（1.13%）和膽固醇酯（0.73%）含量較低。此外，圖3中化學位移為129.41和127.57 ppm的譜峰代表游離型DHA的C4和C5信號，化學位移為129.30 ppm的譜峰代表酯型DHA的C5信號；化學位移為128.94和128.70 ppm的譜峰代表游離型EPA的C5和C6信號，而128.86和128.82 ppm 代表酯型EPA的C5和C6信號。因此可以根據(jù)譜峰積分得到酯型DHA和EPA與游離型DHA和EPA分別所占的含量，從而可知游離型DHA占DHA總量的61.24%，游離型EPA占EPA總量的63.11%，說明魷魚肝臟油脂中的DHA和EPA主要以游離形式存在。

圖2 魷魚肝臟總脂13 C NMR全譜峰

圖3 魷魚肝臟總脂碳譜局部譜峰（132～127 ppm）

表1 魷魚肝臟總脂碳譜譜峰歸屬

表2 魷魚肝臟油脂各組分含量及其化學位移

2.2 魷魚肝臟脂肪酸組成分析

魷魚肝臟總脂經(jīng)甲酯化處理后，采用GC-MS對其脂肪酸組成進行分析，其總離子流色譜圖如圖4所示。通過標準品對照和數(shù)據(jù)庫檢索對其脂肪酸進行定性，并按峰面積歸一化方法進行定量，其結(jié)果列于表3。

圖4 魷魚肝臟總脂脂肪酸組成的GC-MS總離子流色譜圖

表3 魷魚肝臟總脂脂肪酸組成

如表3所示，從魷魚肝臟總脂中共鑒定出25種脂肪酸，主要為C16∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-11、DHA和EPA。其中，多不飽和脂肪酸（PUFA，38.80%）＞單不飽和脂肪酸（MUFA，32.96%）＞飽和脂肪酸（SFA，28.24%），SFA 以C16∶0（18.19%）和C18∶0（4.79%）為主，MUFA 以C18∶1n-9（8.20%）和C20∶1n-11（7.42%）為主。PUFA 與SFA 的含量比為6.9∶5，n-3 PUFA占脂肪酸總量的34%，這與核磁共振氫譜所得結(jié)果無顯著差異（P＞0.1）。魷魚肝臟總脂中n-3 PUFA主要為DHA和EPA，兩者總量高達31.50%，高于鰩魚（28.29%）［16］、墨魚（30.19%）［17］和鱈魚（21.60%）［18］。EPA 和DHA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、提高免疫力、抑制炎癥和促進嬰幼兒大腦發(fā)育等生理功效［19］。魷魚肝臟總脂中富含EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸，表明其具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，可以作為EPA和DHA等功能性脂肪酸的重要膳食來源。

3 結(jié)論

3.11H NMR結(jié)果表明，在魷魚肝臟總脂脂肪酸中，多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量比約為7∶5，n-3型多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的35%；13C NMR結(jié)果表明，肝臟總脂以三酰甘油（71.87%）為主，其次為游離脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），膽固醇（1.13%）和膽固醇酯（0.73%）含量較低；肝油中DHA和EPA主要以游離形式存在，分別占DHA總量和EPA總量的61.24%和63.11%。

3.2 GC-MS結(jié)果顯示，魷魚肝臟總脂脂肪酸以C16∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-11、DHA 和EPA 為主，多不飽和脂肪酸的含量高達38.80%，EPA和DHA占脂肪酸總量的31.50%，表明魷魚肝臟油脂具有較高的營養(yǎng)價值和開發(fā)前景，可以作為n-3型多不飽和脂肪酸的重要膳食來源。

3.3 利用NMR結(jié)合GC-MS技術(shù)能更全面地分析油脂組成，為油脂的品質(zhì)鑒定及加工利用提供理論依據(jù)。

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Analysis of Lipids and Fatty Acids Compositions of Squid Liver by NMR and GC-MS

Xu Tongyan Dong Yafei Yang Wenge Xu Dalun Zhang Jinjie Lou Qiaoming
（School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）

NMR spectroscopy，in conjunction with GC-MStechniques，was used to study the compositions of lipids and fatty acids of squid liver oil.The results of 1H NMR indicate that the content ratio of PUFA and SFA was 7∶5 in total fatty acids of squid liver oil，and n-3 PUFA accounts for 35%of the total fatty acids.The 13C NMR demonstrates that the main constituent of total lipids of squid liver was triglycerides（71.87%），followed by free fatty acids（20.98%）and phospholipids （5.29%），the contents of cholesterols （1.13%）and cholesterol esters（0.73%）were low，DHA and EPA mainly exist in free from in squid liver oil，the contents of free DHA and EPA were 61.24%and 63.11%in total DHA and EPA，respectively.The results of GC-MS show that the main fatty acids were C16∶0，C18∶1，C20∶1，EPA and DHA in squid liver oil.PUFA accounts for 38.80%and the total content of EPA and DHA add up to 31.50%，indicating that the lipids of squid liver have high nutritional values and development prospects.

squid liver，NMR，GC-MS，lipids，fatty acids

TS251.9

A

1003-0174（2016）11-0140-05

國家自然科學基金（31201283），“水產(chǎn)”浙江省重中之重學科開放基金（xkzsc1531），寧波市自然科學基金（2012A610136）

2015-04-01

徐彤硯，女，1993年出生，碩士，食品工程

樓喬明，男，1981年出生，博士，講師，食品科學