318例中國漢族非綜合征性耳聾患者基因突變譜分析①

王屹，陳蕾，劉志忠，張海燕，馬娟

318例中國漢族非綜合征性耳聾患者基因突變譜分析①

王屹1,2，陳蕾1,2，劉志忠1,2，張海燕3，馬娟3

目的應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)對先天性非綜合征性耳聾患者進行耳聾基因篩查。方法采集2015年10月～2016年4月318份先天性非綜合征性耳聾患者抗凝靜脈全血，應(yīng)用多重聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和MALDI-TOFMS的方法進行中國人常見的四個耳聾基因GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體12Sr RNA共20個位點的突變檢測。結(jié)果共檢出GJB2基因突變111例(34.9%)，其中235delC的突變攜帶率最高(25.47%)；SLC26A4基因突變43例(13.5%)；GJB3基因突變3例(0.94%)；線粒體12Sr RNA基因突變12例(3.77%)。結(jié)論確定不同非綜合征性耳聾人群相關(guān)基因突變譜，對于建立先天性耳聾患者理想的基因篩查方法意義十分重要。

非綜合征性耳聾；基因突變；基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時間質(zhì)譜

[本文著錄格式]王屹，陳蕾，劉志忠，等.318例中國漢族非綜合征性耳聾患者基因突變譜分析[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2016,22(12):1451-1454.

CITED AS:Wang Y,Chen L,Liu ZZ,et al.Mutation spectra of genes in 318 Chinese Han population w ith nonsyndrom ic hearing loss[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(12):1451-1454.

聽力受損是目前最常見的神經(jīng)感覺性障礙，世界范圍內(nèi)兒童發(fā)病率約為1‰[1]。耳聾是我國第一大殘疾，聽力殘疾者約2800萬，占總殘疾人口的1/3。根據(jù)原衛(wèi)生部發(fā)布的《中國出生缺陷防治報告(2012)》[2]，我國每年新發(fā)先天性聽力障礙3.5萬例，其中遺傳因素所致的耳聾約占60%，加上遲發(fā)型耳聾和藥物性耳聾患者，每年新增的聽力障礙兒童超過6萬。遺傳因素所致的耳聾中，77%～99%是常染色體隱性遺傳，表現(xiàn)為典型的語前聾；大約10%～20%是常染色體顯性遺傳，其余病例與X-性連鎖和線粒體遺傳相關(guān)。

遺傳性耳聾又分為綜合性和非綜合征性耳聾(nonsyndrom ic hearing loss,NSHL)，以聽力受損為唯一癥狀的非綜合征性耳聾大約占70%。從上世紀90年代開始，耳聾相關(guān)基因研究日益增加。2014年非綜合征性耳聾定位已經(jīng)超過170個基因座，涉及90個基因，到2016年涉及的基因近110個[3-5]。部分基因異常所致耳聾并非先天性的，而是嬰兒出生之后逐步形成或者使用藥物不當所致。因此，新生兒出生時單純進行聽力篩查難以排除此類致聾因素，還需輔以基因檢測[6-8]。通過對基因的識別可以及早干預(yù)、預(yù)防先天性耳聾出生缺陷，控制藥物致聾風險，預(yù)防或者延緩耳聾的發(fā)生發(fā)展。

目前的研究表明，與中國人遺傳性耳聾最為密切相關(guān)的耳聾基因為GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體12Sr RNA。本研究收集318份山東臨沂和湖北宜昌的耳聾患者全血血樣，通過應(yīng)用多重聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)結(jié)合飛行時間質(zhì)譜對樣本GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體12Sr RNA四個基因20個常見突變位點進行檢測。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2015年10月～2016年4月湖北宜昌特殊教育學校、山東臨沂特殊教育中心耳聾患者的全血血樣。

納入標準：無其他遺傳性疾病耳聾；非綜合征性耳聾。

排除標準：外傷性耳聾、存在其他基因相關(guān)疾病及綜合性耳聾。

所有研究對象為漢族人，且均對本項研究簽署知情同意書。采集耳聾患者外周血2m l，乙二胺四乙酸(ethylene diam ine tetraacetic acid,EDTA)抗凝。

1.2 突變分析

應(yīng)用核酸提取試劑(上海百傲科技服份有限公司)進行全血樣本DNA的提取。提取的DNA樣本保存于-20℃。應(yīng)用耳聾相關(guān)基因檢測試劑盒(微陣列芯片-飛行時間質(zhì)譜法)(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)。DNA樣本進行PCR，反應(yīng)條件為：95℃30 s，56℃30s；72℃60 s，45個循環(huán)；最后72℃300 s。PCR擴增后，加入蝦堿酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)消化，延伸；將裝有延伸混合物、SAP酶消化產(chǎn)物的PCR管/孔置于PCR擴增儀內(nèi)。用樹酯進行純化，將純化產(chǎn)物進行靶板點樣，并應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時間質(zhì)譜(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)進行樣本的相關(guān)基因突變分析。

2 結(jié)果

共收集先天性非綜合征性耳聾患者318例，其中男性173例，女性145例；0～13歲145例，14～25歲173例，平均(14±4.8)歲；山東臨沂市158例，湖北宜昌市160例。

本研究共檢測四個基因包括20個位點的突變情況。318例耳聾患者中，GJB2基因突變的比例最高，有111例(34.9%)；SLC26A4基因突變次之，有43例(13.5%)；GJB3基因突變的有3例(0.94%)；線粒體12Sr RNA突變的有12例(3.77%)。見表1。

表1 四個耳聾基因突變的檢測結(jié)果〔n(%)〕

GJB2基因中，235delC位點雜合突變43例(13.52%)，純和突變38例(11.95%)；其次為299_ 300delAT，雜合突變24例(7.55%)，純和突變1例(0.31%)；176_191del16位點的雜合突變?yōu)?例，未檢測到純和突變。其余兩個位點167delT、35delG未檢測到突變。

SLC26A4基因中，突變水平最高的是IVS7-2，共29例(9.12%)，其中雜合突變?yōu)?8例(5.66%)，純和突變?yōu)?1例(3.46%)；其次為2168A＞G位點，檢測到5例(1.57%)雜合突變，其中2027T＞A、281C＞T兩個位點在318例患者中未檢測到突變。

GJB3基因中，538C＞T和547G＞A的突變比例均較低，分別檢測到1例(0.31%)和2例(0.63%)。

線粒體12Sr RNA基因中，1555A＞G的同質(zhì)突變比例最高，共9例(2.83%)，檢測到1例異質(zhì)突變(0.31%)。見表2。

有23例患者同時檢測到GJB2基因的兩個位點突變，有5例患者同時有SLC26A4基因的兩個突變位點，2例患者同時出現(xiàn)GJB2基因和SLC26A4的突變位點。

表2 四個耳聾基20個突變位點檢測結(jié)果〔n(%)〕

3 討論

分子生物學方法是目前遺傳性耳聾診斷的主要手段，目前國內(nèi)外建立了很多耳聾基因的篩查方法，但無論是被人們認為是金標準的Sanger測序，還是其他如多限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)基因芯片技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)等技術(shù)，都存在檢測效率低、成本高的問題。傳統(tǒng)序列方法對于不明確突變熱點的疾病篩查往往無效。飛行時間質(zhì)譜技術(shù)以其高靈敏度、高特異性、高準確度、多重基因檢測的優(yōu)勢得到全球醫(yī)學界的認可，成為分子診斷行業(yè)繼PCR技術(shù)、芯片技術(shù)、測序技術(shù)之后最新得到美國食品和藥物管理局認可的基因診斷平臺。本研究應(yīng)用多重PCR技術(shù)結(jié)合MALDI-TOFMS技術(shù)檢測國人常見的四種基因20個位點的突變情況。

GJB2是1997年報道的第一個導致常染色體隱性遺傳耳聾的基因[9]，編碼連接蛋白26(connexin 26, Cx26)，是耳蝸縫隙連接的重要蛋白。該基因突變所致的耳聾臨床表現(xiàn)為先天性重度以上感音神經(jīng)性耳聾，治療以人工耳蝸移植效果較好。耳聾基因GJB2的突變率在高加索人種常染色體隱性遺傳非綜合征性耳聾中大約占50%，世界其他地區(qū)明顯低于該水平[10-11]。其中C.35delG突變在大部分高加索人種的攜帶頻率最高，大約占GJB2基因突變的70%[12]。

中國人GJB2基因突變常見突變位點為235delC、299-300delAT、176_191del16、35delG、167delT。本研究對318例先天性非綜合征性耳聾患者血液樣本進行分析，GJB2的突變攜帶率為34.9%，其中235delC的突變攜帶率占GJB2基因突變的76.57%。235delC突變是包括中國漢族人在內(nèi)的亞洲人群最常見的突變類型[13-14]。Meng等應(yīng)用目標區(qū)域測序技術(shù)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷遺傳性耳聾1例，經(jīng)臨床分子遺傳學確診為GJB2基因復(fù)合雜合突變致聾[15]。本研究中有24例(7.55%)發(fā)生GJB2基因復(fù)合雜合突變。

SLC26A4基因又稱Pendrin基因，編碼蛋白質(zhì)Pendrin(陰離子氯/碘)轉(zhuǎn)運跨膜蛋白。該基因突變引起的耳聾已明確為常染色體隱性遺傳，對于耳聾人群中非綜合征性前庭導水管擴張(enlarged vestibular aqueduct,EVA)具有顯著的預(yù)測意義[16]。常見突變位點為281C＞T、589G＞A、IVS7-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、IVS15-5G＞A、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G。

大前庭導水管(enlarged vestibular aqueduct,EVA)綜合征在亞洲人群的發(fā)病與SLC26A4基因突變密切相關(guān)，在亞洲人群尤其是中國人中風險增加[17]。其中最常見的突變位點在韓國和日本為p.H723R，而在中國大陸和臺灣則為IVS7-2A＞G[18]。本研究中SLC26A4突變的比例為13.4%，其中IVS7-2A＞G位點的總突變率為9.12%，純合突變占SLC26A4突變的37.93%，雜合突變占62.07%，復(fù)合雜合突變占24.13%。這與2004年報道的284例中國人SLC26A4突變的比例為18.66%基本接近，高于歐洲人群(3.5%)。攜帶SLC26A4基因2條等位基因突變的患者表現(xiàn)為前庭水管擴大，攜帶SLC26A4基因單條等位基因突變的患者30%會表現(xiàn)為前庭水管擴大；凡是引起顱內(nèi)與內(nèi)耳的通道異常擴大、顱腔與內(nèi)耳的通道異常擴大，以及引起顱內(nèi)壓變化的因素，如輕度的頭部碰撞、感冒等，都能引起EVA綜合征患兒聽力下降。

GJB3基因編碼縫隙連接蛋白31(Cx31)，其錯義突變538C＞T被認為與語后高頻聽力下降有關(guān)[19]，常見突變位點：538C＞T、547G＞A。GJB3基因突變在中國人群中攜帶率低(＜3%)。本研究中，GJB3基因突變率為0.94%，均為雜合突變。

線粒體12Sr RNA的突變通過改變線粒體DNA的空間結(jié)構(gòu)，形成新的與氨基糖甙類抗生素結(jié)合位點而導致對此類藥物敏感而致聾?？赏ㄟ^母親傳給后代，后代中女性可將突變基因繼續(xù)傳給下一代。主要突變位點為1555A＞G[20]、1494C＞T[21]。本研究中，線粒體12Sr RNA基因突變率為3.77%，多為同質(zhì)突變，僅有1例異質(zhì)突變。

本研究應(yīng)用四個基因20個突變位點的檢測體系，發(fā)現(xiàn)在318例患者中，約50%患者攜帶耳聾致病基因。隨著對耳聾基因的深入研究，將會在越來越多的先天性耳聾患者中發(fā)現(xiàn)遺傳背景，從而更好地在其生活、婚育等方面給予指導。高通量的檢測技術(shù)也將為我國大群體的耳聾患者提供更多有價值的指導。

在318例中國漢族人中，GJB2基因突變水平最高，達34.9%，235delC的突變攜帶率最高(25.47%)，與國內(nèi)報道相關(guān)地區(qū)中國人的突變譜[22-25]基本一致。不同非綜合征性耳聾人群中確定相關(guān)基因突變譜對于為先天性耳聾患者建立理想的基因篩查方法十分重要。

志謝

感謝北京益新博創(chuàng)生物科技公司的技術(shù)支持，以及中國殘疾人藝術(shù)團、臨沂市特殊教育中心、宜昌市特殊教育中心的社會支持。

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M utation Spectra of Genes in 318 Chinese Han Population w ith Nonsyndrom ic Hearing Loss

WANG Yi1,2,CHEN Lei1,2,LIU Zhi-zhong1,2,ZHANG Hai-yan3,MAJuan3
1.Beijing Bo'aiHospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;2.CapitalMedicalUniversity Schoolof Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;3.Bioyong Technologies Inc.,Beijing 100086,China

ObjectiveTo define themutation spectra of deafness gene in 318 Chinese Han population w ith nonsyndromic hearing loss (NSHL).MethodsFrom October,2015 to April,2016,anticoagulant venousw hole blood of 318 patients w ith NSHL w ere collected.The genes including GJB2,SLC26A4,GJB3 and 12Sr RNA were detected w ith polymerase chain reaction(PCR)and Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-FightMass Spectrometry(MALDI-TOFMS).ResultsAmong these patient,111 cases(34.9%)had GJB2mutations,in which themutation carrying rate of 235delC w as the highest(25.47%),43 cases(13.5%)had SLC26A4mutations,3 cases(0.94%) had GJB3mutations,and 12 cases(3.77%)hadmitochondria 12Sr RNAmutations.ConclusionDefinition ofmutation spectrum among differentpopulationswith NSHL is important for developmentof optimalgenetic screening services for congenitalhearing impairment.

nonsyndrom ic hearing loss;genemutation;M atrix Assisted LaserDesorption/Ionization Time-Of-FightMass Spectrometry

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.12.019

R246.81

A

1006-9771(2016)12-1451-04

2016-08-02

2016-10-02)

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(“863”計劃)項目(No.2014AA020901)。

1.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市100068；2.首都醫(yī)科大學康復(fù)醫(yī)學院，北京市100068；3.北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司，北京市100086。作者簡介：王屹(1980-)，女，漢族，山西大同市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：耳聾基因檢測在疾病防控中的應(yīng)用研究。通訊作者：劉志忠，男，博士，主任技師。E-mail:lzzlzb@126.com。