骨髓間充質(zhì)干細胞細胞周期同步化的方法及對向神經(jīng)細胞分化的影響①

李曼麗，趙文，高鈺丹，段紅梅，楊朝陽，李曉光,

骨髓間充質(zhì)干細胞細胞周期同步化的方法及對向神經(jīng)細胞分化的影響①

李曼麗1，趙文2，高鈺丹2，段紅梅1，楊朝陽2，李曉光1,2

目的分析不同處理條件下細胞同步化于G0/G1時期的效果以得到最佳的同步化條件，并研究同步化對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在堿性成纖維細胞因子(bFGF)的作用下分化為神經(jīng)細胞的影響。方法分離培養(yǎng)成年大鼠BMSCs，5%、1%、0.5%、0.1%、0胎牛血清(FBS)分別處理24 h、48 h。PI染色后經(jīng)流式細胞儀檢測細胞周期各時相細胞所占比例，與正常培養(yǎng)條件(10%FBS)處理下對比。得到最佳處理條件后，bFGF處理3 d、7 d，免疫熒光細胞化學(xué)方法檢測Nestin和Tuj-1的表達。結(jié)果成年大鼠BMSCs原代提取，經(jīng)傳代后，細胞形態(tài)為長梭形。不同處理條件下G1/G0期細胞比例均高于正常培養(yǎng)條件，1%FBS處理48 h時G1/G0期細胞比例為(94.274±0.468)%，達最高峰(F=39.91,P＜0.001)。bFGF誘導(dǎo)3 d后，細胞周期同步化后的Nestin+細胞數(shù)顯著高于未同步化的細胞數(shù)[(80.3±2.4)%vs.(12.1±1.5)%](F=28.25,P＜0.001)；bFGF誘導(dǎo)7 d后，同步化后的Tuj-1+細胞數(shù)顯著高于未同步化的細胞數(shù)[(74.8±3.2)%vs.(19.3±2.5)%](F=17.95,P＜0.001)。結(jié)論1%FBS處理48 h是將BMSCs同步化于G0/G1期的最佳條件。細胞周期同步化于G0/G1期能夠提高BMSCs向神經(jīng)細胞分化的比例。

骨髓間充質(zhì)干細胞；細胞周期；同步化；血清饑餓法；神經(jīng)分化；大鼠

[本文著錄格式]李曼麗，趙文，高鈺丹，等.骨髓間充質(zhì)干細胞細胞周期同步化的方法及對向神經(jīng)細胞分化的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2016,22(12):1399-1403.

CITED AS:LiML,ZhaoW,Gao YD,etal.Cell cycle synchronization Methods of bonemarrow mesenchymalstem cellsand itseffect on neuraldifferentiation[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(12):1399-1403.

骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymal stem cells, BMSCs)來源于骨髓，是骨髓中區(qū)別于造血干細胞的具有多向分化潛能，能夠向骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)，甚至跨越胚層向神經(jīng)組織分化的細胞[1-8]。Woodbury等發(fā)現(xiàn)，在特定誘導(dǎo)條件下，來源于成年鼠和人的BMSCs可以分化為神經(jīng)元[9-10]。由于其來源廣泛并具有多向分化潛能，已經(jīng)成為基因治療或組織工程[11-14]的細胞資源。但是，骨髓中BMSCs含量極少，占骨髓有核細胞總數(shù)的0.001%～0.1%，故在有限的細胞數(shù)量中提高細胞分化比例成為組織工程及細胞體內(nèi)、體外實驗的重中之重。

細胞進入或退出細胞周期與細胞命運息息相關(guān)[15]。G0/G1期是細胞進入或退出細胞周期的關(guān)鍵時期。細胞周期關(guān)鍵的限制位點在G1期末期。如果細胞通過這一限制點，將幾乎無一例外地完成細胞周期。而如果通過某些抑制手段來阻斷細胞周期使其停留在G1期，則能促進分化[16]。相較于物理和化學(xué)方法將BMSCs細胞周期阻滯在G0/G1期，血清饑餓法對于細胞的傷害較小。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblastgrow th factor,bFGF)，又稱FGF-2，具有促進神經(jīng)組織生長發(fā)育、血管生成、創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)等作用[17]。有研究利用bFGF結(jié)合多聚賴氨酸成功將BMSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)絲蛋白(nerve fibers,NF)陽性的神經(jīng)元樣細胞。

本實驗通過BMSCs的黏附特性，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取BMSCs[18-19]。流式細胞儀檢測在不同胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)濃度下，不同處理時間時處于G0/G1時相的細胞比例，從而確定最佳的處理條件。本研究還利用bFGF誘導(dǎo)細胞周期同步化組和未同步化組，于不同的誘導(dǎo)時間檢測其向神經(jīng)細胞分化的能力和區(qū)別，探索采用血清饑餓法同步化BMSCs于G0/G1期的最優(yōu)條件，為提高BMSC的分化比例提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Wistar成年大鼠6只，體質(zhì)量200 g，購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，許可證號SYXK(京)2013-0004。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠BMSCs提取、培養(yǎng)和傳代

1.2.1.1 提取和培養(yǎng)

成年Wistar大鼠腹腔注射4%水合氯醛6m l/kg麻醉。分離股骨和脛骨，去除股骨和脛骨上多余肌肉、血管、筋膜等并暴露骨兩端，含青鏈霉素雙抗PBS沖洗3次后，于PBS中浸泡。注射器吸取含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基從股骨和脛骨中將骨髓細胞沖洗出來，10m l DMEM培養(yǎng)基于濕潤的37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后細胞全換液，去除不貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.1.2 傳代

待細胞生長至80%～90%細胞融合時，用含有雙抗的PBS洗滌3次，每皿中加入胰酶+乙二胺四乙酸(ethylene diam ine tetraacetic acid,EDTA)2m l晃勻，保證每個細胞都能接觸到。2m in后，相差顯微鏡下觀察細胞由長梭形變?yōu)閳A形時，每皿加入等體積含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000 r/m in離心5 m in，棄上清后將沉淀均分到兩個培養(yǎng)皿中，分別加入10m l培養(yǎng)基于濕潤的37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至80%～90%細胞融合狀態(tài)時，同樣的方法傳代至P3代備用。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞表面標記

收獲P3代生長狀態(tài)良好細胞，0.25%胰酶消化2 m in，4℃、1000 r/m in離心5m in，PBS(含青鏈霉素雙抗)清洗細胞3次，計數(shù)細胞，棄上清加入熒光標記一抗(PE-Cy5-labeled anti-Rat CD45/FITC-labeled anti-Rat CD90)，平均每1×106個細胞加1μl，冰上孵育40m in后，PBS洗滌1次，5m in，上機檢測，PBS洗滌細胞3次，除去未結(jié)合抗體，PBS 500μl重懸細胞，流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.3 大鼠BMSCs血清饑餓處理

P3代細胞種植于六孔板中，待細胞貼壁后分組處理。分組情況如下：5%、1%、0.5%、0.1%、0 FBS處理24 h；5%、1%、0.5%、0.1%、0 FBS處理48 h。

1.2.4 大鼠BMSCs細胞周期檢測

待處理結(jié)束后，PBS洗滌3次。每孔0.25%胰酶+ EDTA 0.5m l消化處理2m in，待細胞由長梭形慢慢形變?yōu)閳A形時，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞至懸浮。收集細胞至1.5m l EP管中。1000 r/m in離心10 m in，棄上清，PBS重懸細胞后1000 r/m in離心10m in，棄上清后，邊震蕩邊快速加入70%乙醇至充分混勻，4℃固定細胞2 h以上。將經(jīng)過固定的細胞1000 r/m in離心5m in，重復(fù)2次，棄上清加入RNase1m l37℃反應(yīng)30m in，冷卻至室溫。每管中加入PI染液100μl，30 s后，EPICSXL coulter流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特)上機檢測。

1.2.5 BMSCs的誘導(dǎo)分化

P3代細胞種植于包被有左旋多聚賴氨酸(SIGMA)的蓋玻片上，待細胞貼壁后向培養(yǎng)基中添加20 ng/m l bFGF(SIGMA)，2～3 d半量換液一次。采用免疫熒光細胞化學(xué)方法，3 d后檢測神經(jīng)干細胞標志物Nestin的表達；7 d后檢測神經(jīng)細胞標記物Tuj-1的表達。

1.2.6 免疫熒光

4%多聚甲醛4℃固定40m in，0.3%TritonX-100破膜5m in，之后用1%封閉用山羊血清室溫封閉30 m in，加入相應(yīng)一抗(Nestin 1∶100,M ILLIPORE；Tuj-1多克隆抗體1∶200)，37℃孵育2 h，加入A lexa594和Alexa488標記的山羊抗兔或小鼠熒光二抗(1∶300，INVITROGEN公司)，37℃避光孵育1 h，Hoechst33342(1∶1500，SIGMA公司)復(fù)染核，50% PB甘油封片，BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS)下觀察照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs形態(tài)和生長特征

原代提取24 h后，細胞貼壁且兩端有較長突起，胞核卵圓形，細胞呈克隆樣生長，形成大小不一的集落，前期生長緩慢，達到80%～90%匯合后傳代。傳代后細胞增殖較快，呈均勻分布生長，形態(tài)為長梭形，10～14 d傳至P3代細胞形態(tài)，呈長梭形。見圖1～圖2。

2.2 大鼠BMSCs的鑒定

第3代BMSCs 95%以上的細胞為CD45-/CD90+細胞。即95%以上為BMSCs。見圖3。

圖1 BMSCs原代細胞形態(tài)(相差顯微鏡，200×)

圖2 P3代細胞形態(tài)(相差顯微鏡，200×)

圖3 流式雙標鑒定BMSCs

2.3 大鼠BMSCs血清同步化條件優(yōu)化

各處理條件下，G1/G0期細胞數(shù)目與正常培養(yǎng)狀態(tài)即10%FBS處理下都有所增加。見表1。其中1% FBS處理48 h時，G1/G0期細胞所占比例為94.27%，達到最高值(F=39.91,P＜0.001)。見表1。

2.4 細胞周期同步化于G0/G1期對BMSCs向神經(jīng)細胞分化的影響

基于以上研究，我們選擇1%FBS處理48 h為最佳處理條件，并命名為同步化組，同時將10%FBS條件定義為非同步化組。bFGF誘導(dǎo)3 d后，同步化組中Nestin+細胞比例顯著高于非同步化組[(80.3±2.4)%vs. (12.1±1.5)%](F=28.25,P＜0.001)。誘導(dǎo)7 d后，同步化組Tuj-1+細胞數(shù)顯著高于非同步化組[(74.8±3.2)%vs. (19.3±2.5)%](F=17.95,P＜0.001)。見圖4。

圖4 bFGF誘導(dǎo)3 d和7 d后Nestin+和Tuj-1+的表達情況

表1 不同濃度FBS處理24 h、48 h時各細胞周期時相細胞所占比例(%)

3 討論

BMSCs具有廣泛的臨床應(yīng)用前景?；诟杉毎闹委熢谂R床中已取得良好的效果，白血病和某些癌癥治療中都應(yīng)用到干細胞。理論上，囊胚內(nèi)細胞層分離的胚胎干細胞是細胞治療的最佳細胞資源，但由于受倫理學(xué)限制及潛在的致畸性和成瘤的可能，應(yīng)用受到限制。BMSCs由于能夠取自自體，避免了上述問題，成為熱門資源；目前主要應(yīng)用于局部移植、系統(tǒng)移植、結(jié)合干細胞的基因治療及組織工程領(lǐng)域中。李曉峰等在大面積的骨缺損骨折中應(yīng)用自體體外擴增的BMSCs局部移植獲得成功[19]，BMSCs治療椎骨骨性融合也取得良好效果。在心血管疾病中，BMSCs治療外周動脈疾病引起的繼發(fā)性缺血性疾病、冠狀動脈疾病獲得巨大的成功[20]。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)主要來源于骨髓，臨床上人類的MSCs一般從髂前上棘抽取[21]。骨髓中MSCs所占比例相當(dāng)少，大約為0.0001%，通過細胞培養(yǎng)技術(shù)分離和擴增。目前分離MSCs的方法主要有密度梯度離心、免疫磁珠分選、貼壁培養(yǎng)法等。本實驗采用的是全骨髓貼壁培養(yǎng)法，利用MSCs在塑料制品中貼壁生長并形成類似成纖維細胞的形態(tài)，經(jīng)傳代后，細胞擴增速度較快[23]。研究者們使用MSCs的方法各異，進一步標準化的分離過程仍有待于對其生物學(xué)特征和機制的深入研究。

骨髓來源MSCs細胞構(gòu)成復(fù)雜，為了得到純度較高的MSCs，急需對得到的MSCs進行鑒定。鑒定方法主要有三種。①BMSC具有在塑料制品中的貼附性。②具有能夠向骨、軟骨、脂肪等細胞的分化能力。③利用細胞表面抗原標志，排除造血干細胞特征。本實驗中采用CD45和CD90共標的方法，利用CD45排除造血干細胞可能，CD90為干細胞表面標記。95%以上的細胞表達CD90并且為CD45陰性。如此，即可鑒定我們提取的細胞為BMSCs。

細胞周期對于調(diào)控細胞的增殖和分化非常重要。G0/G1期為細胞走向增殖還是分化的關(guān)鍵限制點。細胞通過本限制點后將無一例外的走向增殖[22-23]。為了分化，在G1期，細胞需要離開細胞周期而進入G0期[24-25]。這表明，通過某些細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)抑制劑的過表達來阻斷細胞周期使其停留在G1期，能促進分化，而驅(qū)動細胞通過G1期能抑制分化[26]。本研究的目的為探索將BMSCs的細胞周期同步化在G1/G0期的最優(yōu)條件，即盡可能多地將細胞阻滯在G1/G0期，使更多的細胞走向分化，從而提高細胞分化比例。本研究結(jié)果也說明了這個問題，即細胞周期同步化于G0/G1期能夠促進更多的BMSCs在bFGF的誘導(dǎo)作用下走向分化。

研究發(fā)現(xiàn)，降低血清濃度可以提高G1/G0期細胞比例，但是BMSCs的生長是需要一定濃度血清的，降低血清濃度雖然能夠提高G1/G0期細胞比例，但是同樣造成了一定程度上細胞活性的降低，所以尋找最佳的處理條件非常關(guān)鍵。本研究在比較不同濃度的處理條件后發(fā)現(xiàn)，1%FBS處理48 h不僅能夠最大程度提高G1/G0期細胞比例，同時還能保持較好的細胞活力。

細胞周期同步化是指將正常生長的細胞通過物理、化學(xué)或是其他方法改變細胞周期進程，使大部分的細胞處于某一個特定的時期。有研究顯示，利用RoscovitineATP競爭性抑制劑與ATP競爭CDK的ATP結(jié)合位點抑制CDK的活性(CDK1、CDK2、CDK5、CDK7)能夠?qū)⒓毎铚贕0/G1期。但是，外源性的化學(xué)試劑對細胞的損傷無法估計。血清饑餓法同步化細胞，不添加任何外源化學(xué)試劑，對細胞的損傷較小，是目前研究者們普遍采取的方法。但處理條件的不確定為同步化細胞制造了障礙，本研究確定了采用血清饑餓法同步化細胞的最佳條件。

綜上所述，本研究提供了一種區(qū)別于物理、化學(xué)方法的同步化BMSCs的方法，并確定了最佳的處理條件。為進一步研究BMSCs高比例分化為目標細胞提供了方法，為BMSCs應(yīng)用于臨床研究奠定了細胞基礎(chǔ)。

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Cell Cycle Synchronization Methods of BoneM arrow M esenchymal Stem Cellsand Its Effecton NeuralDifferentiation

LIMan-li1,ZHAOWen2,GAO Yu-dan2,DUANHong-mei1,YANG Zhao-yang2,LIXiao-guang1,2
1.Departmentof BiomedicalEngineering,Schoolof BiologicalScienceand Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China;2.Departmentof Neurobiology,CapitalMedical University,Beijing 100069,China

ObjectiveTo analyze theeffectof different treatmentconditionson cells synchronization in G0/G1 phase to get thebestcondition,and to explore its effect on neural differentiation of bonemarrow mesenchymal stem cells(BMSCs)induced by basic fibroblast grow th factor(bFGF).MethodsBMSCswere isolated and cultured in 5%,1%,0.5%,0.1%,0 fetalbovine serum(FBS)respectively,for 24 hours and 48 hours.A fter PIstaining,cell cycle proportions of each phasewere detected by flow cytometry,and were compared with the normal group(10%FBS).A fter the optimal treatment condition was got,20 ng/m l bFGFwas added into synchronization group and unsynchronization group 3 days and 7 days,respectively.The expression of Nestin and Tuj-1 were detected with immunofluorescence.ResultsAdult rat BMSCswere isolated from bonemarrow and cultured,after passage,the cellswerew ith long spindle shape.Compared with the normal group,the cell proportion of G1/G0 phase increased under different treatments,peaked with(94.274±0.468)%under 1%FBS,48 hours(F=39.91,P＜0.001).AfterbFGF induction for3 days,the Nestin+cellnumberwas higher in the synchronization group than in theunsynchronization group[(80.3±2.4)%vs.(12.1±1.5)%](F=28.25,P＜0.001).A fter bFGF induction for 7 days,the Tuj-1+cell numberw as higher in the synchronization group than in the unsynchronization group[(74.8±3.2%)%vs.(19.3±2.5)%](F=17.95,P＜0.001).Conclusion1%FBS,48 hours is the optimal condition to BMSCs synchronization in G0/G1 phase,which can promote the neural differentiation of BMSCs.

bonemarrow mesenchymalstem cells;cell cycle;synchronization;serum starvation;neuraldifferentiation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.12.007

R329.2

A

1006-9771(2016)12-1399-05

2016-06-17

2016-08-01)

1.國家“863”計劃項目(No.2012AA 020206)；2.國家自然科學(xué)基金面上項目(No.31271037)；3.國家自然科學(xué)基金國際合作與交流項目(No.31320103903)；4.“十二五”國家科技支撐計劃項目(No.2012BAI17B04)；5.高等學(xué)校全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項資金資助項目(No.201356)；6.國家國際科技合作專項項目(No.2014DFA 30640)；7.國家自然科學(xué)基金委員會資助項目(No.31130022)。

1.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京市100191；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京市100069。作者簡介：李曼麗(1985-)，女，漢族，河北安新縣人，博士研究生，主要研究方向：干細胞的誘導(dǎo)分化。通訊作者：李曉光。E-mail:lxgchina@sina.com。