金黃色葡萄球菌核酸酶A與不同外源DNA片段融合表達的作用比較

付立霞，冀德君，盧徐斌，韓先干，魏文志

1 揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省人畜共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009

2 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

金黃色葡萄球菌核酸酶A與不同外源DNA片段融合表達的作用比較

付立霞1，冀德君1，盧徐斌1，韓先干2，魏文志1

1 揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省人畜共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009

2 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

付立霞, 冀德君, 盧徐斌, 等. 金黃色葡萄球菌核酸酶A與不同外源DNA片段融合表達的作用比較. 生物工程學報, 2016, 32(12): 1654-1663.

Fu LX, Ji DJ, Lu XB, et al. Comparison of effects of staphylococcal nuclease A fused with different exogenous DNA fragments. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1654-1663.

金黃色葡萄球菌核酸酶A (Staphylococcal nuclease A, SNA) 可用于菌蛻制備中宿主菌的進一步滅活及殘存遺傳物質的去除。關于SNA在去除了信號肽后是否仍能分泌至胞外以及是否需要融合其他氨基酸片段才能在宿主菌胞質中發(fā)揮作用尚存爭議。為厘清這一爭議，分別構建一系列含SNA、SNA與λ噬菌體cro基因或結核桿菌脲酶基因部分序列的融合片段cSNA或uSNA的溫控質粒并對其在大腸桿菌內(nèi)的作用進行評價。結果顯示，SNA、cSNA和uSNA的表達產(chǎn)物對大腸桿菌的4 h滅活率分別為99.9%、99.8%和74.2%。升溫誘導30 min后，SNA和cSNA即可在宿主菌胞內(nèi)被檢出，而uSNA需1 h；相較之下，SNA和cSNA在培養(yǎng)液上清中的被檢出時間要晚1 h，uSNA則晚2 h。對三者的核酸酶活性檢測均為：SNA＞cSNA＞uSNA，且胞外活性都顯著低于胞內(nèi)。此外，SNA和cSNA在誘導2 h后即將宿主基因組成功降解，而uSNA則在整個實驗期間均未能使宿主基因組完全降解。這表明SNA、cSNA和uSNA的表達產(chǎn)物均具有核酸酶活性，可被動釋放至胞外，外源DNA片段的融入反而會降低SNA的核酸酶活性。

菌蛻，cro基因，裂解基因E，金黃色葡萄球菌核酸酶A，脲酶基因

菌蛻是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174裂解基因E的誘導表達產(chǎn)物裂解后所形成的不含胞質內(nèi)含物的完整細菌空殼。由于保留了細菌原有的表面結構和特性，菌蛻具有疫苗和佐劑的雙重功能，可刺激機體產(chǎn)生更強的免疫反應，因而較常規(guī)疫苗具有更好的免疫保護效果[1-4]，其更進一步的優(yōu)點是可以作為抗原、核酸和藥物的高級遞送載體[5-7]。正是由于具有這些優(yōu)點，使得菌蛻日益成為當前疫苗研究的熱點。在菌蛻的制備過程中，盡管大多數(shù)實驗細菌可被裂解基因E所介導的裂解作用完全滅活，但也有一些細菌尤其是大腸桿菌不易被完全滅活，而且在溶菌誘導后期會出現(xiàn)反彈性生長[7-9]。為了解決這一問題，具有核酸降解能力的金黃色葡萄球菌核酸酶被作為輔助致死蛋白引入菌蛻疫苗的制備之中，以使宿主菌進一步被滅活，同時去除殘存的遺傳物質，消除潛在的生物安全風險[10-13]。

由于金黃色葡萄球菌核酸酶在基因組成上除了結構基因之外，前端還包括前體序列和信號肽序列[14]，在將其應用于菌蛻制備時為避免可能的外泌作用影響效果，只克隆表達其結構基因。但Lee等在相關研究中卻發(fā)現(xiàn)由λ噬菌體啟動子pR指導的SNA的基因表達產(chǎn)物不能降解細菌基因組DNA，而通過融合Cro蛋白N端26個氨基酸片段可成功解決這一問題，他因此推測SNA可能在缺失信號肽的情況下仍能被分泌至胞外[12]，與之相應的是Recchi等在將金黃色葡萄球菌核酸酶用于恥垢分枝桿菌外泌蛋白篩選時也觀察到類似現(xiàn)象[15]。不過，F(xiàn)u等在后續(xù)研究中卻再次證實SNA基因的單純表達產(chǎn)物即可成功降解細菌基因組DNA，并推斷SNA并非必須與其他基因融合，基因的表達效率才是關鍵[16]。

鑒于目前關于SNA在菌蛻制備中應用形式方面存在的上述爭議，本研究通過對爭議中所涉及的SNA結構基因及其相關融合片段進行克隆及溫控表達，并對相應表達產(chǎn)物的核酸酶活性及對宿主菌的作用效果進行比較，以期厘清這一爭議，為高效安全菌蛻疫苗的制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及試劑

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司，質粒pFLX107、pBV220-SNA由本實驗構建保存[16-17]。限制性內(nèi)切酶XcmⅠ為New England BioLabs產(chǎn)品，KpnⅠ、PstⅠ、T4 DNA連接酶、PrimeSTAR HS (Premix)、Premix ExTaq、DL5000、DL10000等均購自于TaKaRa。DNA Mini Kit、High-Speed Plasmid Mini Kit和Gel/PCR DNA等為Geneaid產(chǎn)品。甲苯胺藍DNA瓊脂購自杭州濱和微生物試劑有限公司。所有引物 (表1) 均由賽默飛世爾 (Thermo Fisher) 旗下英濰捷基 (上海) 貿(mào)易有限公司合成。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primers sequence used in this study

1.2 質粒pFLX107-SNA的構建

以質粒pBV220-SNA為模板，利用引物SNA-F/SNA-R擴增SNA。反應體系為50 μL，其中模板和正反向引物各1 μL，PrimeSTAR HS (Premix) 25 μL，滅菌雙蒸水22 μL。PCR反應程序為：98 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后切膠回收。用KpnⅠ和PstⅠ對回收目的片段進行雙酶切，然后連入同樣經(jīng)KpnⅠ/PstⅠ雙酶切的pFLX107質粒中，最終構建成功的質粒命名為pFLX107-SNA (圖1)。

1.3 質粒pFLX107-tSNA的構建

質粒pFLX107-tSNA為通過TA克隆的方式構建。以質粒pBV220-SNA為模板，利用引物tSNA-F/tSNA-R和Premix ExTaq擴增SNA基因，然后回收連入經(jīng)XcmⅠ酶切回收的pFLX107中，將經(jīng)測序驗證SNA為反向插入的質粒命名為pFLX107-tSNA，作為后續(xù)實驗的空白對照 (圖1)。

1.4 質粒pFLX107-cSNA的構建

以質粒pBV220-SNA為模板，先通過引物Cro-F/Cro-R和cSNA-F/cSNA-R分別擴增cro 5′端序列和SNA基因，然后以回收的Cro片段和SNA片段為混合模板、以Cro-F/cSNA-R為引物，通過重疊PCR將Cro片段與SNA融合，最后經(jīng)KpnⅠ/PstⅠ酶切后連入pFLX107相應酶切位點，構建成質粒pFLX107-cSNA (圖1)。

圖1 溫控表達質粒圖譜Fig. 1 Maps of thermo-inducible plasmids. Cat: chloramphenicol acetyltransferase gene; Ori: origins of replication; pR: the rightward lambda promoter; cI857: a temperature sensitive repressor cI857; rrnBT1T2: ribosomal RNA operon T1T2 terminator; SNA: staphylococcal nuclease A gene; cSNA: SNA fused with Cro; uSNA: SNA fused with UreA.

1.5 質粒pFLX107-uSNA的構建

根據(jù)已發(fā)布序列委托合成結核分枝桿菌脲酶A基因 (ureA) 5′端序列[18]，然后利用引物Ure-F/Ure-R擴增ureA基因5′端序列。同時，以質粒pBV220-SNA為模板，利用引物uSNAF/uSNA-R擴增SNA基因。最后通過上述方法將ureA序列與SNA融合并克隆至質粒pFLX107，構建成質粒pFLX107-uSNA (圖1)。

1.6 不同SNA基因的誘導表達

所有構建成功的質粒均轉化至大腸桿菌DH5α。誘導表達前，將含有相應質粒的大腸桿菌DH5α，接種至100 mL含氯霉素 (35 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)液OD600達到0.3-0.4時，將溫度升至42 ℃誘導基因的表達，同時向培養(yǎng)液中加入CaCl2和MgCl2，使終濃度分別為10 mmol/L和1 mmol/L，以發(fā)揮SNA的最大活性。每隔一定時間取樣測定培養(yǎng)物的OD600，監(jiān)測細菌的生長情況。對誘導后0、2和4 h的菌液做適當稀釋后，進行平板活菌計數(shù)，計算SNA所介導的滅活效率。計算公式為：

滅活率= (1?誘導后CFU/誘導前CFU)×100%。

1.7 基因組檢測

誘導后每隔1 h取1 mL細菌培養(yǎng)液提取總基因組，確認核酸酶的降解活性?；蚪M的提取使用Genomic DNA Mini Kit，整個操作按照產(chǎn)品說明書進行。核酸酶對基因組的降解活性通過0.8%瓊脂糖電泳分析。

1.8 核酸酶活性測定

核酸酶活性的測定參照唐俊妮等[19]的方法，通過甲苯胺藍DNA瓊脂平板進行并略有改動。具體操作為：先配置甲苯胺藍DNA瓊脂，滅菌后倒入平皿中，待凝固后，用直徑3 mm的打孔器均勻打孔，取出孔中瓊脂。然后待升溫誘導后每隔一定時間取樣離心，取10 μL上清加入孔中以測定培養(yǎng)液上清中核酸酶的活性，然后棄上清，以等量滅菌LB液體對沉淀菌體進行重懸，煮沸15 min，再離心取10 μL上清加入其他孔中以測定胞內(nèi)核酸酶的活性，加樣后的平板均置于28 ℃過夜培養(yǎng)。上樣孔周圍藍色消褪出現(xiàn)粉紅色圓圈者為陽性反應，無變色為陰性反應，通過測量粉紅圈的直徑 (不含孔徑) 以判定核酸酶活性，陰性反應則記錄為零。

2 結果與分析

2.1 pFLX107系列衍生質粒的構建

以質粒pBV220-SNA為模板，SNA-F/SNA-R、tSNA-F/tSNA-R、Cro-F/Cro-R、cSNA-F/cSNA-R和uSNA-F/uSNA-R，引物對成功擴增出大小分別為468 bp (含限制性酶切位點和保護堿基，后同)、450、93、473和462 bp的預期目的片段 (圖2)；以人工合成ureA基因為模板，引物Ure-F/ Ure-R成功擴增出大小為98 bp的目的片段(圖2)。運用重疊PCR技術，分別以Cro-F/cSNA-R和Ure-F/uSNA-R為引物，均成功擴增出大小約為546 bp的融合片段 (圖2)。

圖2 目的基因的PCR擴增Fig. 2 PCR amplification of target gene. M: DNA marker DL5000; 1: SNA; 2: tSNA; 3: cro; 4: SNA for constructing cSNA; 5: cSNA; 6: ureA; 7: SNA for constructing uSNA; 8: uSNA.

對構建成功的質粒pFLX107-SNA、pFLX107-tSNA、pFLX107-cSNA、pFLX107-uSNA以M13-47/M13-48引物進行PCR鑒定均能擴增出預期目的片段，分別為673、571、748和748 bp (圖3)，測序結果表明，成功構建上述質粒。

2.2 大腸桿菌DH5α的生長曲線比較

轉化有上述構建質粒的大腸桿菌DH5α在28 ℃培養(yǎng)至OD600值約為0.3-0.4后，升溫至42 ℃并加入MgCl2/CaCl2進行SNA基因的誘導表達，在核酸酶的作用下其OD600表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。

含質粒pFLX107-SNA、pFLX107-cSNA、pFLX107-uSNA的大腸桿菌DH5α經(jīng)升溫誘導后，OD600均經(jīng)歷一段快速增長后緩慢下降最后趨于平穩(wěn)，其中大腸桿菌DH5α (pFLX107-SNA) OD600在120 min達到最大值后開始緩慢下降，180 min后穩(wěn)定于約1.0左右；大腸桿菌DH5α (pFLX107-cSNA) 的OD600于150 min達到最大值后緩慢下降，210 min后穩(wěn)定于1.1左右；大腸桿菌DH5α (pFLX107-uSNA) 的OD600于210 min達到最大值后一直穩(wěn)定維持于1.4左右。作為對照的大腸桿菌DH5α (pFLX107-tSNA) OD600則在整個實驗期間一直持續(xù)增長直至達到平臺期(OD600=1.8) (圖4)。

平板活菌計數(shù)從另一方面反映了SNA的作用效果。誘導后2 h和4 h，轉化有質粒pFLX107-SNA或pFLX107-cSNA的大腸桿菌DH5α活菌數(shù)均較誘導前下降了2-3個數(shù)量級，大腸桿菌DH5α (pFLX107-SNA) 的滅活率分別為99.7%和99.9%，大腸桿菌DH5α (pFLX107-cSNA) 的滅活率分別為99.5%和99.8%；而轉化有質粒pFLX107-uSNA的大腸桿菌DH5α活菌數(shù)則只較誘導前降低了不到1個數(shù)量級，滅活率分別為55.7%和74.2%。相較之下，大腸桿菌DH5α (pFLX107-tSNA) 活菌數(shù)在實驗期間一直處于增長之中，誘導后2 h和4 h的活菌數(shù)分別為誘導前的1.6倍和3.5倍 (表2)。

圖3 構建質粒的PCR鑒定Fig. 3 PCR identification of constructed plasmids. M: DNA marker DL5000; 1: pFLX107-SNA; 2: pFLX107-tSNA; 3: pFLX107-cSNA; 4: pFLX107-uSNA.

圖4 大腸桿菌DH5α的生長曲線Fig. 4 Growth curve of E. coli DH5α carrying pFLX107-SNA, pFLX107-tSNA, pFLX107-cSNA and pFLX107-uSNA, respectively. The cells were grown at 28 ℃ until the OD600reached 0.3-0.4, and then was induced by the upshift of temperature from 28 ℃ to 42 ℃. Mg2+and Ca2+were added to the culture simultaneously.

2.3 核酸酶活性

為了解不同重組質粒中金黃色葡萄球菌核酸酶基因的誘導表達及可能存在的外泌情況，對誘導后不同時段的培養(yǎng)液上清和胞內(nèi)核酸酶進行活性檢測。活性檢測陽性反應會在點樣孔周圍形成粉紅色圓圈，其直徑大小可在一定程度上反映核酸酶的活性。

升溫誘導90 min后，大腸桿菌DH5α (pFLX107-SNA) 和大腸桿菌DH5α (pFLX107-cSNA) 培養(yǎng)液上清中可首次檢測到核酸酶，此后呈緩慢增加趨勢，以最后4組測量值計算的平均粉紅圈直徑分別為 (4.7±0.3) mm和 (3.7±0.2) mm (后同)；大腸桿菌DH5α (pFLX107-uSNA) 則在誘導180 min后方在其培養(yǎng)液上清中檢測到核酸酶，平均粉紅圈直徑為 (3.1±0.2) mm (圖5A)。與之相對的是，大腸桿菌DH5α (pFLX107-SNA) 和大腸桿菌DH5α (pFLX107-cSNA) 胞內(nèi)核酸酶在誘導30 min后即可被檢測到，大腸桿菌DH5α (pFLX107-uSNA) 則在誘導60 min后可檢測到胞內(nèi)核酸酶，三者的平均粉紅圈直徑分別為 (10.5±1.1) mm、(7.2±0.4) mm和(4.1±0.3) mm (圖5B)。而作為空白對照的大腸桿菌DH5α (pFLX107-tSNA) 則在歷次核酸酶活性檢測中均為陰性 (圖5)。

2.4 宿主菌基因組電泳檢測

在鈣、鎂離子存在時，升溫誘導2 h后，大腸桿菌DH5α (pFLX107-SNA) 和大腸桿菌DH5α (pFLX107-cSNA) 的基因組即被成功降解 (圖6)，而大腸桿菌DH5α (pFLX107-uSNA)和大腸桿菌DH5α (pFLX107-tSNA) 的基因組在整個實驗期間則始終可被檢測到，但通過電泳條帶的明暗強度可看出前者基因組濃度誘導后期較誘導前期有所下降 (圖6C)，而后者基因組濃度則不斷增加 (圖6D)。

表2 大腸桿菌DH5α的誘導滅活Table 2 Inactivation of E. coli DH5α harboring pFLX107-SNA, pFLX107-tSNA, pFLX107-cSNA and pFLX107-uSNA, respectively, after induction by temperature upshift

圖5 大腸桿菌DH5α培養(yǎng)液上清 (A) 和胞內(nèi) (B) 核酸酶活性Fig. 5 Nuclease activity of culture supernatant (A) and intracellular nuclease activity (B) of E. coli DH5α carrying pFLX107-SNA, pFLX107-tSNA, pFLX107-cSNA and pFLX107-uSNA, respectively.

圖6 大腸桿菌DH5α總基因組電泳分析Fig. 6 Electrophoretic analysis of total DNA of E. coli DH5α harboring pFLX107-SNA (A), pFLX107-cSNA (B), pFLX107-uSNA (C) and pFLX107-tSNA (D), respectively. M: DNA marker DL10000; Lane 1-6: samples prepared from the induced culture every one hour after induction.

3 討論

作為一種新型的疫苗技術，菌蛻較傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢已在各類實驗中一再得到證實[1-4]，但在菌蛻的制備過程中，單純基因E所介導的裂解作用并不足以使宿主菌完全滅活[7-9]。出于生物安全考慮，SNA被作為輔助致死基因引入菌蛻的制備之中，但如前所述，目前關于SNA在菌蛻制備中的應用形式存在爭議，與之對應的理論解釋也截然相反[10-13]，因此厘清這一爭議對于高效安全菌蛻疫苗的生產(chǎn)或制備無疑具有十分重要的理論意義和經(jīng)濟價值。

本研究通過對爭議中所涉及的SNA結構基因及其相關融合片段進行克隆及溫控表達，并從不同方面對其作用效果進行了比較。本次研究中，無論是SNA的單純表達產(chǎn)物還是其與Cro或脲酶N端氨基序列的融合產(chǎn)物均具有核酸酶活性，而且綜合比較之下單純SNA的活性最強，cSNA次之，uSNA則活性最低，顯示外源片段的融入反而會在一定程度上降低SNA的活性，降低程度則因融入的片段而異，這可能與融入片段會影響到SNA的折疊并進而影響到其活性有關。此外，升溫誘導后三者在宿主菌胞內(nèi)被檢出的時間均要早于其在培養(yǎng)液上清中被檢出的時間，且對應胞內(nèi)核酸酶活性均顯著高于培養(yǎng)液上清中的核酸酶活性，這表明三者可能皆如Recchi等對uSNA所描述的那樣不能外泌，只是由于過表達和宿主菌滅活致死才被動釋放至胞外。

另一方面，在菌蛻的制備過程中，裂解基因E會在宿主菌表面形成平均直徑約40-200 nm的跨膜通道，導致胞質內(nèi)容物的釋放[20]，這意味著將SNA應用于菌蛻制備時無論其自身能否外泌均會被釋放至胞外，因此Lee等認為核酸酶只有在胞內(nèi)才能發(fā)揮作用的解釋值得商榷。根據(jù)其描述通過軟件重構相關質粒發(fā)現(xiàn)，當SNA基因被直接置于pR控制之下時，SD盒與起始密碼子之間的距離為57 bp，包含有許多起始構建質粒pGEM-T easy vector自身酶切位點及居間序列，并非如之前所分析的那樣只是增加了一個限制性酶切位點[16]，而這一距離的最適范圍通常為5-13 bp，超過20 bp就會阻礙后續(xù)基因的表達[21]，因此兩者之間距離過長可能才是導致SNA誘導后不能發(fā)揮作用的真正原因。進一步分析顯示，當Lee等進行Cro和SNA融合時，并沒如其所言用pR-Cro元件替換質粒中的pR，而是直接將這一組合元件插入在前述57 bp序列中的SalⅠ和NdeⅠ酶切位點之間，對應于Cro蛋白N端26個氨基酸片段的核酸序列實際上也只包含65 bp的Cro 5′端序列，鑒于此后這一存在移碼的Cro和SNA的表達產(chǎn)物仍能正常發(fā)揮作用，一種可能的解釋是這65 bp序列中存在著能影響基因轉錄或表達的序列元件，類似現(xiàn)象曾在裂解基因E的體外DNA重組 (DNA shuffling) 中出現(xiàn)過，缺失了1個起始堿基的基因E反而具有更高的裂解效率[22]。此時，Cro和SNA的融合表達產(chǎn)物實際上仍為單純SNA。

最后，本次研究中uSNA在整個實驗期間盡管表現(xiàn)出了對DNA的降解能力但并不能使宿主基因組完全降解，對宿主菌的滅活也不到一個數(shù)量級，而SNA和cSNA在升溫誘導2 h后即將宿主基因組成功降解，對宿主菌的滅活效果也較uSNA高出1-2個數(shù)量級，則從另一方面反映了一個值得注意的問題，即核酸酶的活性才是決定對宿主菌的滅活水平和對基因組降解能力的關鍵。

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(本文責編 郝麗芳)

Comparison of effects of staphylococcal nuclease A fused with different exogenous DNA fragments

Lixia Fu1, Dejun Ji1, Xubin Lu1, Xian'gan Han2, and Wenzhi Wei1
1 Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China
2 Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China

Staphylococcal nuclease A (SNA) may be used to produce bacterial ghosts for further inactivation of host bacteria and elimination of residual genetic materials. It is still controversial if SNA without signal peptide can be secreted to extracellular matrix and if fusion with other peptide is required for its function in the cytoplasm of host bacteria. To clarify this dispute, a series of temperature-inducible plasmids carrying SNA alone or SNA fused with partial sequences of λ phage cro gene (cSNA) or Mycobacterium tuberculosis urease gene (uSNA) were constructed and evaluated in Escherichia coli. Results show that the percentages of inactivated E. coli by SNA, cSNA and uSNA after 4 h of induction were 99.9%, 99.8% and 74.2%, respectively. Moreover, SNA and cSNA in the cytoplasm of host bacteria were initially detectable after 30 min of induction, whereas uSNA was after 1 h. In comparison, SNA and cSNA in culture supernatant were initially detectable 1 h later, whereas uSNA was 2 h later. The nuclease activity in the cytoplasm or supernatant was ranked as follows: SNA 〉 cSNA 〉 uSNA, and the activity in the supernatant was significantly lower than that in the cytoplasm. Furthermore, host genomic DNA was degraded by SNA or cSNA after 2 h of induction but not by uSNA even throughout the whole experiment. In conclusion, this study indicates that SNA, cSNA and uSNA expressed in host bacteria all have nuclease activity, the enzymes can be released to culture media, and fusion with exogenous peptide negatively reduces the nuclease activity of SNA.

bacterial ghosts, cro gene, lysis gene E, staphylococcal nuclease A, urease gene

Wenzhi Wei. Tel: +86-514-87979096; Fax: +86-514-87350440; E-mail: wzwei@yzu.edu.cn

Received:May 9, 2016;Accepted: September 18, 2016

Supported by: The Open Project Program of Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis (No. R1510), Shanghai Key Project on Agricultural Development through Science and Technology (No. 2015HNG1-9), Project of Jiangsu Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control (No. K14009).

江蘇省人獸共患病學重點實驗室項目 (No. R1510)，上海市科技興農(nóng)重點攻關項目 (No. 2015HNG1-9)，江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室課題 (No. K14009) 資助。

時間：2016-09-26

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160926.1452.002.html