33株抗心肌肌鈣蛋白T (cTnT) 的單克隆抗體制備、鑒定及應用

胡月紅，陳自敏，陳宇翔，楊映暉，魏淑英，宋瀏偉，周國梁，葛勝祥

1 廈門大學附屬第一醫(yī)院杏林分院 肺科實驗室，福建 廈門 361022

2 廈門大學 生命科學學院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建 廈門 361102

33株抗心肌肌鈣蛋白T (cTnT) 的單克隆抗體制備、鑒定及應用

胡月紅1*，陳自敏2*，陳宇翔1，楊映暉1，魏淑英2，宋瀏偉2，周國梁2，葛勝祥2

1 廈門大學附屬第一醫(yī)院杏林分院 肺科實驗室，福建 廈門 361022

2 廈門大學 生命科學學院 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建 廈門 361102

胡月紅, 陳自敏, 陳宇翔, 等. 33株抗心肌肌鈣蛋白T (cTnT) 的單克隆抗體制備、鑒定及應用. 生物工程學報, 2016, 32(12): 1694-1703.

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旨在制備抗心肌肌鈣蛋白T (cTnT) 的單克隆抗體 (mAb)，對單抗進行初步評價鑒定，并建立 (cTnT)的化學發(fā)光定量檢測試劑。首先利用外購的cTnT抗原免疫BALB/c小鼠，利用常規(guī)mAb制備技術和間接ELISA法篩選mAb，以表達和合成的cTnT片段對篩選到的 mAb進行表位鑒定。使用雙抗體夾心ELISA方法篩選檢測cTnT抗原的配對mAb，并建立cTnT全自動化學發(fā)光定量檢測試劑。使用220例臨床標本評價該試劑與羅氏試劑的檢測一致性，另外使用238例臨床樣本和784例體檢人群樣本評價該試劑的臨床應用。我們成功篩選到33株穩(wěn)定分泌抗cTnT抗體的雜交瘤細胞株，并對單抗的表位進行初步鑒定。我們篩選到能檢測10 pg/mL cTnT抗原的配對mAb E16H8和C8G11，并使用該配對研制出全自動化學發(fā)光定量試劑。該試劑與羅氏試劑相關系數(shù)r達到0.959 9，檢測一致率95%，利用該試劑盒檢測臨床樣本靈敏度為97.5%，特異性為99.15%，99%體檢人群的cTnT濃度分布小于0.080 6 ng/mL，符合WHO對急性心肌梗死的定義標準。綜上，初步建立了cTnT診斷優(yōu)勢表位單抗，并利用這些優(yōu)勢表位的單抗建立全自動管式化學發(fā)光定量檢測試劑，與羅氏試劑檢測結(jié)果符合率高。

心肌肌鈣蛋白T (cTnT)，急性心肌梗死 (AMI)，單克隆抗體，化學發(fā)光

心血管疾病是我國最常見的疾病之一，死亡率很高[1]。隨著基礎醫(yī)學臨床醫(yī)學和檢驗醫(yī)學的不斷發(fā)展，陸續(xù)有許多心臟標志物先后應用于臨床，在心臟疾病的診斷危險性評估療效觀察預后估計等方面起了重要作用。目前，臨床應用的心臟標志物按功能可大致分為3類：一是主要反映心臟組織損傷的標志物；二是了解心臟功能及預測冠狀動脈粥樣硬化標志物；三是作為心血管炎性疾病的標志物[2-7]。因此檢測心臟標志物對指導心臟病人的治療、監(jiān)測血栓病人的溶栓療效、判斷愈后都有著重要的意義[8]。

心肌肌鈣蛋白T (cTnT) 是心肌損傷 (如心肌梗死) 的特異性和高敏感性的標志物，由于分子量小 (37 000 Da)，所以發(fā)病后血中濃度迅速升高。心肌肌鈣蛋白T (cTnT) 是能預測急性冠狀動脈綜合癥短期、中期甚至長期結(jié)局的1種獨立的預后診斷標志物。低濃度的肌鈣蛋白T是心血管事件 (包括初發(fā)和再發(fā)的心房顫動)的獨立預測指標[9]。血中cTnT濃度增高也可見于其他疾病，如心肌炎、心臟挫傷、肺栓塞和藥物引起的心臟毒作用[10-13]。本研究目的就是特異性單抗的原料制備以及基于全自動管式化學發(fā)光免疫檢測試劑的建立。

1 材料與方法

1.1 試劑

心肌肌鈣蛋白T抗原購買于International laboratory USA (產(chǎn)品貨號：CMT866525A)；cTnI抗原 (購買于International Laboratory USA貨號CM583262)；Human troponic C (TnC) 購買于HyTest (貨號：8T57)。小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0為本公司保存。BALB/c小鼠為上海斯萊克動物中心提供。PEG1500﹑次黃嘌呤﹑胸腺嘧啶﹑氨基喋呤﹑DMSO﹑HRP、磁微粒Dynabeads M-270購自美國Life technologies公司。吖啶酯等購自Sigma公司。RPMI 1640基礎培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清購自PAA公司。羊抗鼠標記辣根過氧化酶、IgM﹑IgG1﹑IgG2a﹑IgG2b﹑IgG3為Serotec公司產(chǎn)品。

1.2 樣本

1.2.1 臨床樣本

選取2013年11月?2013年12月福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院及廈門大學附屬中山醫(yī)院收集的臨床樣本，來源于門診住院病人，其中確診AMI的118例，排除AMI的120例 (AMI的診斷標準參照全國中西醫(yī)結(jié)合防治冠心病、心絞痛、心律失常研究座談會修訂的診斷標準和WHO缺血性心臟病診斷標準) 其次還選擇了廈門大學附屬中山醫(yī)院收集有羅氏E170檢測背景的標本220份。

1.2.2 體檢樣本

均來自體檢中心健康體檢者。

1.2.3 樣本采集

所有檢測對象均為肝素抗凝的血漿。

1.3 儀器

Caris200為廈門優(yōu)邁科醫(yī)學儀器有限公司的產(chǎn)品。

1.4 多抗、單抗制備

選擇6只雌性BALB/c小鼠用外購的cTnT抗原乳化完全弗氏佐劑 (CFA) (Sigma, St. Louis，MO) 皮下免疫50 μg/只、免疫總體積是500 μL，兩周后使用同樣的抗原乳化不完全弗氏佐劑 (IFA) (Sigma，St. Louis，MO) 進行皮下免疫，劑量、免疫體積同初次免疫，間隔2周繼續(xù)免疫加強2針。最后利用相同的抗原PBS稀釋至1 mg/mL脾臟免疫100 μL，采集眼球血清監(jiān)測血清效價3 d后開展細胞融合。細胞融合、克隆化、腹水制備以及純化均按照常規(guī)方法進行[14]。其中融合、克隆化的篩選模式是利用間接法篩選檢測，利用外購抗原300 ng/孔包被于聚苯乙烯微孔板上，包被緩沖液是碳酸緩沖液，而后加入細胞上清反應，最后利用羊抗鼠標記的辣根過氧化物酶二抗捕獲反應。選擇1只3月齡新西蘭兔利用外購的cTnT抗原免疫制備多抗 (劑量是200 μg/只；皮下免疫；免疫體積1 mL)，免疫周期3周一次，免疫3針后處死采集血清[15]。

1.5 抗原制備以及鑒定

利用PTO-T7載體 (本實驗室構(gòu)建) 構(gòu)建cTnT全長以及不同區(qū)段的克隆，在cTnT全長以及不同區(qū)段N端再引入6個His的標簽，并在大腸桿菌中獲得表達，命名為r-cTnT、B6-71-285、B6-71-130、B6-101-160、B6-131-190和B6-161-220。經(jīng)過金屬螯合層析獲得純化抗原。利用兔多抗血清評價制備的抗原：利用獲得不同的截斷抗原包被，而后加入兔多抗血清評價。

1.6 單抗特征分析

1) mAb滴度測定：雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及mAb滴度的測定采用間接ELISA法，包被的抗原為外購的cTnT抗原。2) mAb的亞型鑒定：采用間接ELISA法分析。將抗體稀釋至1 μg/mL加入預先包被外購的cTnT抗原的微孔板中反應其中抗原的包被量是300 ng/孔，所用酶標二抗為商品化購買的 IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的酶標二抗，根據(jù)說明書進行使用。3) mAb識別表位的分析：將不同表達的區(qū)段分別進行包被后，用間接ELISA法測定各株mAb與之的反應性，從而分析各株mAb的識別表位[16]。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗平臺檢測系統(tǒng)的建立

1) 單抗之間阻斷試驗驗證：利用r-cTnT包被評價32株單抗之間的相互阻斷關系，并初步分類。用間接阻斷ELISA分析mAb間與cTnT抗原反應的相互阻斷情況，以便為雙抗體夾心檢測cTnT抗原選擇配伍mAb提供參考。mAb辣根過氧化物酶 (HRP) 的標記采用改良過碘酸鈉法[17]。將各株單抗分別加入預先包被r-cTnT抗原的微孔板中37 ℃反應30 min，對照孔加PBS，而后利用PBST洗板后，正交加入各合適稀釋度的單抗標記的酶液37 ℃反應30 min，PBST洗板后并顯色讀值。最后依據(jù)各阻斷孔OD450值與相應對照孔的OD450值之差與對照孔OD450值的百分比值作為某mAb對相應HRP-mAb的阻斷值，大于50%認為有阻斷效果，小于50%認為無阻斷效果[18]。2) 采用方正滴定法[18]篩選配對單抗，以靈敏度高、本底低、線性范圍廣為選擇標準，最終確定E16H8為包被單抗，C8G11為酶標單抗初步建立酶免試劑。

1.8 磁微粒包被單克隆抗體

取1 mg磁微粒用200 μL EDC溶液 (10 mg EDC溶于1 mL去離子水) 活化，然后加入10 μg單克隆抗體并置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育偶聯(lián)2 h，孵育后洗液洗滌3次后用1 mL甘氨酸溶液 (pH 7.4)進行封閉，完成封閉后保存在含酪蛋白的PBS緩沖液中[19]。

1.9 吖啶酯標記單克隆抗體

取100 μg單克隆抗體稀釋到合適濃度后加入15 μL吖啶酯 (溶于甲基甲酰胺中)，混勻，室溫避光反應30 min；加入1 mL賴氨酸溶液(pH 8.0) 封閉；最后透析到PBS緩沖液中，用含酪蛋白的PBS緩沖液稀釋后使用[19]。

1.10 心肌肌鈣蛋白T定量測定試劑盒的配制以及免疫分析方法

將包被好的磁微粒及標記好的吖啶酯按照一定的稀釋比例進行稀釋，稀釋后進行罐裝、組裝及貼簽，即為心肌肌鈣蛋白T定量測定試劑盒。

取50 μL標記了單抗的磁珠緩沖液加入U型微孔板中并加入50 μL待檢測樣品，貼上封板膜后放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育。15 min后將微孔板置于磁力板架上，磁珠完全被吸附后，PBST清洗3遍，吸干殘余洗滌液，加入吖啶酯標記的抗體緩沖液50 μL，37 ℃恒溫箱孵育10 min，PBST清洗3遍，將每孔磁珠轉(zhuǎn)移至發(fā)光管中，加入激發(fā)液A100 μL，上機檢測時加入激發(fā)液B100 μL，檢測發(fā)光值[20]。

1.11 參考品的配制

cTnT抗原用基質(zhì)血 (購買于Trina公司) 稀釋后用羅氏E170試劑定量,而后將定量的抗原用基質(zhì)血稀釋成L系列參考品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.12 分析靈敏度的確定

用試劑檢測L系列參考品 (L1-L8，濃度分別為0.01、0.1、0.4、1、2、5、10、25 ng/mL)，用GraphPad Prism進行四參數(shù)擬合試劑劑量反應曲線。然后重復測定基質(zhì)血清20次，計算其平均發(fā)光值、標準差，得出M+2SD，然后將M+2SD的RLU值代入試劑盒劑量反應曲線方程中，求出對應的濃度值，即為其分析靈敏度。

1.13 統(tǒng)計學處理

分析靈敏度的結(jié)果采用GraphPad Prism5分析；與對照試劑相關性分析采用GraphPad Prism5；Bland-Altman分析采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行處理；本試劑的Kappa值采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組抗原的制備以及鑒定

利用PTO-T7載體表達N端帶有6個His標簽的cTnT區(qū)段抗原。由于cTnT N端1-71 aa是不穩(wěn)定的易變區(qū)，而且發(fā)生急性心肌梗死時產(chǎn)生的cTnT為cTnT-ND，此時外周血中cTnT-ND含量上升，通過試劑檢出的cTnT大部分為cTnT-ND[21]，因此從71 aa開始進行不同截短抗原表達利用親和層析純化截短抗原 (圖1)利用購買的cTnT抗原免疫獲得的兔多抗血清評價，均顯示具有抗原性。

圖1 純化cTnT截短抗原圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of truncated cTnT antigen. M: protein marker; 1: B6-71-130; 2: B6-101-160; 3: B6-131-190; 4: B6-161-220; 5: B6: 71-285.

2.2 cTnT單克隆抗體的制備與鑒定

利用常規(guī)單抗制備篩選技術，開展了4個融合獲得了33株抗-cTnT單抗。

2.2.1 cTnT單抗表位鑒定

將這些單抗分別與上述制備的全長抗原以及截短抗原、合成肽 (120-150 aa) 進行反應，結(jié)果見圖2。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)單抗的識別表位都是位于71-101 aa或者120-160 aa。評價這些單抗與cTnI抗原的反應性，結(jié)果顯示其與cTnI抗原無交叉反應。

2.2.2 單抗相互阻斷實驗

通過間接阻斷ELISA方法獲得不同單抗之間的相互阻斷情況的數(shù)據(jù) (圖2)，利用組間連接聚類方法進行系統(tǒng)聚類分析[22]，結(jié)果可以將上述制備的33株單抗分為3類，其中1B7/3G8/ 5E12/5F7/8G7/14D3/3F7分為一類，主要是識別71-101 aa的偏線性表位單抗，這一類單抗基本識別表位一致；第二類單抗是7D2/E2G10/ E16H8/E3F2/E18E11/E2G2/E13B7/8D5/C8G11/ C8B2/E12C10，主要是識別120-160 aa的偏線性表位單抗以及對這些表位都不反應的單抗，但是可能也存在偏構(gòu)象單抗類似120-160 aa表位的單抗；第三類單抗是完全偏構(gòu)象型單抗對現(xiàn)有區(qū)段抗原都不反應。

2.2.3 單抗配對篩選

將獲得的33株單抗分別標記HRP，使用定量的抗原以及一份高濃度血清作為樣品進行單抗與酶標記單抗的正交配對檢測，根據(jù)檢測靈敏度以及特異性篩選到4個配對：D2G11-4F12-HRP；E4G6-B12D8-HRP；E16H8-C8G11-HRP；E4G6-8D5-HRP。這4個配對又進行靈敏度的平行比較以及選擇3份陽性樣本和山羊血清、人血清白蛋白進行配對的特異性評價，結(jié)果見圖3。從結(jié)果顯示E16H8-C8G11對抗原檢測的靈敏度最優(yōu)，對樣本檢測較好且無非特異性反應，因此最終選擇該配對用于cTnT管式化學發(fā)光試劑的研制。最后還選用E16H8-C8G11配對評價cTnI以及TnC的交叉反應情況，結(jié)果顯示對二者無交叉。

圖2 單抗的阻斷試驗及性質(zhì)鑒定圖譜Fig. 2 Blocking test and characterization of monoclonal antibodies.

圖3 比較不同抗體配對檢測 (A) cTnT抗原和 (B) 樣本Fig. 3 Comparison of different pairs of antibodies in detection of cTnT antigen (A) and samples (B).

2.3 cTnT管式化學發(fā)光平臺檢測系統(tǒng)的建立及應用

2.3.1 試劑分析靈敏度

以L系列參考品建立四參數(shù)擬合試劑劑量反應曲線，通過重復測定基質(zhì)血清得出所建立化學發(fā)光試劑的分析靈敏度為0.009 2 ng/mL (圖4)。

2.3.2 試劑與同類產(chǎn)品的比較

檢測有對比試劑羅氏E170檢測背景的標本220份，根據(jù)定量結(jié)果，以＜0.1 ng/mL為正常參考值，將220份標本的結(jié)果判定為正?；虍惓?，考核其判定符合率。本研發(fā)試劑與羅氏試劑的結(jié)果總體符合率為95.00%，表明本試劑有良好檢測性能，對臨床cTnT的異常與否判定準確，結(jié)果如圖5、6和表1所示。

檢測有羅氏E170檢測背景的標本220份，將定量結(jié)果與羅氏的定量結(jié)果進行相關性比較。對其進行線性回歸，考察其定量相關性程度。本試劑與羅氏的定量值經(jīng)過直線回歸后，得到的直線斜率為1.065、截距-0.078 26，相關系數(shù)r達到0.959 9，表明兩試劑有良好的相關性。其中漏檢的10份標本主要都是灰區(qū)的標本。

圖4 試劑分析靈敏度結(jié)果Fig. 4 The analytical sensitivity of the assay.

圖5 相關性分析散點圖Fig. 5 Scatter plots of correlation analysis.

圖6 兩試劑檢測結(jié)果Bland-Altman圖Fig. 6 Bland-Altman analysis of the two assays.

2.3.3 臨床樣本檢測

檢測臨床樣本238例，其中正常人樣本120例，AMI病人118例。試劑靈敏度為97.5%，特異性為99.15%，總符合率為98.32%，Kappa值為0.966 (P〈0.001)，一致性為最強。結(jié)果見表2。

表1 與Roche檢測結(jié)果的符合率Table 1 Coincidence rate with the Roche kit

表2 試劑檢測結(jié)果與臨床樣本背景的比較Table 2 Comparison of test results with clinical samples

2.3.4 體檢人群樣本檢測

檢測784例排除了近期有服用處方及自服藥、血壓異常及有心腦血管相關疾病的體檢人群樣本。結(jié)果顯示95%體檢人群的cTnT濃度小于0.016 3 ng/mL，99%體檢人群的cTnT濃度小于0.080 6 ng/mL，符合WHO[23]對急性心肌梗死的定義標準。

3 討論

心肌肌鈣蛋白 (Cardiac troponin，cTn) 是由3種亞基組成：心肌肌鈣蛋白T (cTnT)、心肌肌鈣蛋白I (cTnI) 和肌鈣蛋白C (TnC)。所以在檢測的過程中要求較高的特異性，根據(jù)這個要求心肌肌鈣蛋白T定量測定試劑盒 (化學發(fā)光微粒子免疫檢測法) 中使用的是能與cTnT特異性反應的一對單克隆抗體。本研究主要目的是建立高特異性以及高靈敏度的化學發(fā)光微粒子免疫檢測試劑，為此我們首先需要獲得高特異性以及高靈敏度的心肌肌鈣蛋白T的單克隆抗體。我們利用大腸桿菌表達的cTnT免疫篩選獲得大量的單抗，并對單抗進行表位分析以及特異性分析，結(jié)果顯色大多數(shù)單抗的識別表位都是在71-130 aa與120-160 aa之間，而且對cTnI等都無交叉。沒有鑒定出表位的幾個單抗，有可能是1-71 aa的單抗，也有可能是構(gòu)象表位的單抗。本研究制備的心肌肌鈣蛋白T的特異性單抗為建立心肌肌鈣蛋白T定量測定試劑盒解決了關鍵原料的來源，促進國產(chǎn)化定量試劑研發(fā)的速度。

我們利用心肌肌鈣蛋白T的特異性單抗E16H8以及C8G11建立定量檢測試劑。通過試劑性能驗證，表明心肌肌鈣蛋白T定量測定試劑盒能達到羅氏試劑的水平，與羅氏試劑的結(jié)果總體符合率為95.00%，與羅氏的定量值經(jīng)過直線回歸后，得到的直線斜率為1.065，截距為-0.078 26，相關系數(shù)r達到0.959 9。

對心肌損傷的診斷在諸多診斷急性心肌梗死 (AMI) 的臨床生化指標中，CK-MB (血清心肌酶) 曾一度被認為是診斷AMI的“金標準”，已廣泛應用多年。隨著對心肌肌鈣蛋白 (cTn)深入研究，無論是對心肌的特異性還是診斷敏感性，CK-MB的作用受到越來越多人的質(zhì)疑。cTn被認為是目前最好的確定標志物，正逐步取代CK-MB成為AMI的診斷“金標準”。檢測238例臨床樣本，靈敏度為97.5%，特異性為99.15 %，其中有4例不符的樣本都是在臨界值附近屬于灰區(qū)樣本。

目前除了羅氏有成熟的化學發(fā)光檢測試劑外，其他公司大部分都是有cTnI檢測試劑而較少有cTnT檢測試劑，價格昂貴。雖然國內(nèi)已有一些公司已經(jīng)研發(fā)出一些利用熒光免疫層析法和膠體金免疫層析法的檢測試劑，但是靈敏度還未能達到要求，而化學發(fā)光免疫分析具有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重復性及更容易實現(xiàn)高通量的檢測[24-25]。故研究國產(chǎn)心肌肌鈣蛋白T定量發(fā)光檢測試劑盒已經(jīng)迫在眉睫。

總之，本研究建立的心肌肌鈣蛋白T的全自動管式化學發(fā)光免疫檢測試劑是一種準確、可靠、可定量、高通量的檢測方法，有利于國內(nèi)各級醫(yī)院以及臨床單位廣泛開展cTnT指標檢測，有利于提高我國對急性心肌梗死 (AMI) 病人進行早期診斷和治療，降低病人的死亡風險。

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(本文責編 陳宏宇)

Development, identification and application of 33 monoclonal antibodies against cardiac troponin T

Yuehong Hu1＊, Zimin Chen2＊, Yuxiang Chen1, Yinghui Yang1, Shuying Wei2, Liuwei Song2, Guoliang Zhou2, and Shengxiang Ge2
1 Laboratory of Lung, Xinglin Branch of the First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361022, Fujian, China
2 National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China

The aim of this study is to prepare and characterize cardiac troponin T (cTnT) monoclonal antibodies (mAb), and further develop a chemiluminescence quantitative detection assay for cTnT. BALB/c mice were immunized with recombinant cTnT antigen, and specific mAbs were prepared using conventional hybridoma technique and screened by indirect ELISA method. To identify the epitopes, several cTnT peptide fragments were synthesized or expressed by genetic engineering. A double antibody sandwich ELISA method was used to screen the mAb pairs for cTnT detection, and the automatic chemiluminescence detection assay for cTnT was developed. In total 220 clinical specimens were used for system comparison between our assay and Roche cTnT assay; further performance characteristics was evaluated by testing 238 clinical samples and 784 physical examination samples. We successfully screened 33 strains of hybridoms against cTnT, and the mAbs' epitopes were identified. Mab E16H8 and C8G11 with a detection limit of 10 pg/mL cTnT antigen were selected to develop the full automatic chemiluminescence quantitative assay. The correlation coefficient of our reagent with Roche's was 0.959 9, with a coincidence rate of 95%. The assay presented a sensitivity of 97.5%, and a specificity of 99.15% in detection of clinical samples. The cTnT concentration was less than 0.080 6 ng/mL in 99% of general population, which agrees with the definition of WHO on patients with acute myocardial infarction (AMI). In summary, we developed monoclonal antibodies against predominant epitopes for diagnostics of cTnT, and an automatic tubular chemiluminescence quantitative detection assay was further developed, which presents a high coincidence rate with Roche's.

cardiac troponin T, acute myocardial infarction (AMI), monoclonal antibodies, chemiluminescence

Shengxiang Ge. Tel/Fax: +86-592-6536555; E-mail: sxge@xmu.edu.cn

Received:March 29, 2016;Accepted:May 16, 2016

Supported by:Xiamen Science and Technology Program (No. 3502Z20126007).

*These authors contributed equally to this work

廈門市科技計劃 (No. 3502Z20126007) 資助。

時間：2016-06-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160613.1509.003.html