肝素鈉粗品及原料藥中豬源性成分的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

余 燕，鄧 鋒

（廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180）

肝素鈉粗品及原料藥中豬源性成分的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

余 燕，鄧 鋒

（廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180）

目的 建立肝素鈉粗品及原料藥的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法，用于檢測(cè)生產(chǎn)原料的動(dòng)物來(lái)源是否為豬源性。方法 分別對(duì)肝素鈉粗品及原料藥進(jìn)行了DNA提取，并加入豬特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果 7批粗品及原料藥中，只有粗品檢測(cè)出豬源性成分，其DNA 50倍稀釋液中均檢測(cè)出豬源性成分，肝素鈉PCR產(chǎn)物與Genbank中豬序列的同源性為99．2%。結(jié)論 用常規(guī)PCR方法檢測(cè)肝素鈉粗品及樣品中豬源性成分是可行的。

肝素鈉；豬源性成分；DNA片段；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

肝素鈉是黏多糖硫酸酯類(lèi)抗凝血藥，是由豬或牛的 腸黏膜提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬黏多糖類(lèi)物質(zhì)。近年來(lái)研究證明，肝素鈉還有調(diào)血脂作用。早期的肝素鈉藥物常以牛、豬或羊的腸黏膜作為原料[1]，自從瘋牛病被確診后及羊瘙癢病的出現(xiàn)，許多國(guó)外廠商就不再采購(gòu)牛和羊來(lái)源的肝素鈉，只采購(gòu)豬來(lái)源的肝素鈉。而不同動(dòng)物種屬提取的生物大分子，可能會(huì)在分子結(jié)構(gòu)、有關(guān)物質(zhì)及疫病風(fēng)險(xiǎn)上存在差異，進(jìn)而影響藥品的療效和毒副作用[2]，因此區(qū)分不同種屬來(lái)源的肝素鈉也顯得非常重要。

動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法有顯微組織檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法、近紅外光譜檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法等[3－7]。目前，在飼料行業(yè)和出入境檢驗(yàn)檢疫部門(mén)，先后制訂的一系列標(biāo)準(zhǔn)均是基于核酸檢測(cè)法。對(duì)肝素鈉粗品基源的檢測(cè)，實(shí)際上是對(duì)豬、牛及山羊、綿羊等基因的檢測(cè)。線粒體DNA（m tDNA）控制區(qū)又稱D環(huán)區(qū)，是m tDNA的非編碼區(qū)，其堿基替換速率相對(duì)較快，是其他區(qū)段的5～10倍，被廣泛應(yīng)用于種群遺傳學(xué)分析、物種鑒別及瀕危物種保護(hù)等方面的研究[8－12]。因此，本研究中擬采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法來(lái)鑒別肝素鈉粗品及樣品的動(dòng)物源性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料、儀器與試藥

1．1 材料

豬肉粉陽(yáng)性對(duì)照品、羊肉粉陽(yáng)性對(duì)照品、牛肉粉陽(yáng)性對(duì)照品（批號(hào)均為20131012）均由上海上海食品藥品檢驗(yàn)所所提供；3批肝素鈉粗品（批號(hào)為 130901，130902，130904）由煙臺(tái)東城生化股份有限公司提供；4批肝素鈉原料藥（批號(hào)為 130701，130702，130703，20101101）由北京賽而生物藥業(yè)有限公司提供。

1．2 儀器

GE公司 Ultrospec 2100型核酸蛋白快速測(cè)定儀；Gene Amp?PCR System 9700型核酸擴(kuò)增儀；Bio－rad DNA凝膠電泳儀Mini－Sub Cell GT；Bio－rad凝膠成像系統(tǒng)GelDoc 2000。

1．3 試劑

豬、牛、羊引物由上海生工生物工程公司合成；擴(kuò)增反應(yīng)液為T(mén)akara公司的Premix Taq；提取試劑盒分別為DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products（Takara公司），北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的土壤基因組提取試劑盒（貨號(hào)為 DP336－02）；DNA marker（包括DL2000及20bp DNA laddermarker，大連寶生物工程有限公司）；MnlⅡ酶（紐英倫生物技術(shù)公司公司）；水為自制滅菌Milli－Q純凈水。

2 方法與結(jié)果

2．1 方法

2．1．1 豬、羊、牛肉粉陽(yáng)性對(duì)照品DNA的提取

分別稱取豬、羊、牛肉粉陽(yáng)性對(duì)照品10mg，用提取試劑盒DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。

2．1．2 肝素鈉粗品及樣品DNA的提取

采用北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的土壤基因組提取試劑盒，稱取樣品10mg，按照DNA提取操作說(shuō)明書(shū)對(duì)7批肝素鈉粗品及原料肝素鈉中殘留的DNA進(jìn)行提取純化。

2．1．3 引物序列

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB／T 21101－2007動(dòng)物源性飼料中豬源性成分定性檢測(cè)方法PCR方法）及出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：SN／T 1119－2002進(jìn)口動(dòng)物源性飼料中牛、羊源性成分檢測(cè)方法PCR方法）中的引物和DNA序列，與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（網(wǎng)址：www．ncbi．nlm．nih．gov）基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的豬、牛及羊線粒體基因進(jìn)行了比對(duì)。最終設(shè)計(jì)的引物如下。

上游引物：GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA；

下游引物：ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG；

擴(kuò)增片段大小為212 bp。

2．1．4 PCR檢測(cè)

以提取陽(yáng)性對(duì)照和肝素鈉粗品及原料藥為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系50μL：PreMix Taq 25μL，引物各1μL（10 mmol／L），DNA模板1μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。電泳條件：電壓90 V，時(shí)間30min，用Gel red染色10min，置于成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

2．1．5 PCR產(chǎn)物的酶切及序列比對(duì)

酶切條件：按MnlⅡ酶的酶切反應(yīng)條件操作。PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司公司測(cè)序。用DNAstar軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，將豬源性PCR產(chǎn)物序列與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中豬序列（NC_000845）比對(duì)。

2．2 結(jié)果

2．2．1 引物的特異性

采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示，用豬的引物，以豬肉粉陽(yáng)性對(duì)照的核酸為模板，可擴(kuò)增出212 bp的特異條帶，而以羊、牛肉粉陽(yáng)性對(duì)照的核酸為模板均未擴(kuò)增出該條帶，表明豬的引物能特異性擴(kuò)增豬來(lái)源的核酸，見(jiàn)圖1。

2．2．2 肝素鈉粗品及樣品檢測(cè)結(jié)果

采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示，用豬引物擴(kuò)增，3批肝素鈉粗品能擴(kuò)增出特異性條帶，而4批原料肝素鈉不能擴(kuò)增出特異性條帶，見(jiàn)圖2。

2．2．3 肝素鈉粗品及樣品稀釋液檢測(cè)結(jié)果

圖1 豬源性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 DNA提取液常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

將肝素鈉粗品及原料藥進(jìn)行50倍的稀釋。用豬引物擴(kuò)增，最終7批肝素鈉粗品及原料肝素鈉均能擴(kuò)增出特異性條帶。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 DNA稀釋液常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2．2．4 PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶確證結(jié)果

將其中一批肝素鈉粗品YTHS130901用豬引物擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用MnlⅡ酶切后，得到長(zhǎng)度分別為196及16的2個(gè)片段，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2．2．5 引物比對(duì)

圖4 PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶圖譜

將其中一批肝素鈉粗品YTHS130901用豬引物擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送予大連寶生物公司測(cè)序，將豬源性PCR產(chǎn)物序列與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中豬序列（NC_000845）比對(duì)。豬源性樣品的同源性為99．2%。

3 討論

本研究所采用的豬源性引物目標(biāo)序列為豬線粒體中tRNAlys和ATP合成酶亞基8和亞基6（tRNAlys－ATPase8－ATPase6）基因，該基因序列在同種物種中保守，在不同物種中差異較大。從基因庫(kù)查詢結(jié)果來(lái)看，擴(kuò)增目標(biāo)序列與基因庫(kù)中家豬（Sus scrofa）基因匹配度為100%；該目標(biāo)序列與牛（Bos taurus）基因、山羊（Capra hircus）基因、綿羊（Ovis aries）基因的最高匹配度分別為73%，79%和76%，說(shuō)明目標(biāo)序列為家豬特有擴(kuò)增目標(biāo)序列。該序列為豬線粒體中tRNAlys和ATP合成酶亞基 8和亞基 6（tRNAlys－ATPase8－ATPase6）基因，該基因序列在同種物種中保守，在不同物種中差異較大。通過(guò)對(duì)豬陽(yáng)性對(duì)照及7批次樣品的檢測(cè)，證實(shí)了該引物的可靠性。

值得注意的是，3批粗品的DNA提取液檢測(cè)出豬源性成分，4批原料藥的DNA提取液檢測(cè)結(jié)果為陰性，7批粗品及原料藥的DNA稀釋液中均檢測(cè)出豬源性成分。分析原因可能為：肝素鈉是硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬多糖類(lèi)物質(zhì)，因多糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)PCR反應(yīng)具有較強(qiáng)的抑制作用，肝素鈉原料藥與肝素鈉粗品相比，純度較高，DNA殘留量較少，且多糖的存在干擾了PCR反應(yīng)，故原料藥的DNA提取液檢測(cè)結(jié)果為陰性，而將提取液稀釋后檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，推測(cè)為DNA提取液中仍有多糖殘留，而正是多糖的存在抑制了PCR反應(yīng)。進(jìn)行稀釋后，多糖含量降低，抑制作用減弱，而DNA含量仍在檢測(cè)限以上，因此檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。粗品中DNA殘留量相對(duì)較多，提取液中的多糖不足以抑制PCR反應(yīng)，因此也顯示陽(yáng)性結(jié)果。

綜上所述，用常規(guī)PCR方法檢測(cè)肝素鈉粗品及樣品中豬源性成分是合理和可行的。

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Identification of Porcine Derived M aterials in Heparin Sodium Crude Product and Drug Substance Sam p les by PCR

Yu Yan，Deng Feng
（Guangdong Institute for Food and Drug Control，Guangzhou，Guangdong，China 510180）

Objective To develop a PCR method for the identification of porcine derived materials in heparin sodium samples．M ethods DNA was extracted from heparin sodium samples prepared from crude product and drug substance．Then the DNA samples extracted were amplified with specific primers．PCR products were digested by enzyme and sequenced to verify the sequence identity．Results It was found that porcine derived materials were detected in crude products，and none detected in drug substances．But porcine derived materials were detected in 50 times dilutions of crude products and drug substances by PCR．PCR products amplified from porcine derived samples had 99．2% homologies to that of gene in the Genbank．Conclusion It is feasible to use PCR to identify porcine derived materials in heparin sodium crude product and drug substance．

heparin sodium；porcine derived materials；DNA fragment；PCR amplifi－cation

R927．11；R973＋．2

A

1006－4931(2016)04－0026－04

余燕（1980－），女，河南信陽(yáng)人，碩士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)樯幬锓治雠cPCR技術(shù)開(kāi)發(fā)，（電子信箱）yuyan921124＠126．com。

20115－03－30；

2015－08－18)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：A2013158，B2014093。