稻瘟病拮抗菌的篩選及抑菌活性的研究

黃元慧， 謝鯤鵬， 王 朔， 呂雪鑫， 謝明杰

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

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稻瘟病拮抗菌的篩選及抑菌活性的研究

黃元慧， 謝鯤鵬， 王 朔， 呂雪鑫， 謝明杰*

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

利用對(duì)峙法和牛津杯法從大連近海海域分離得到1株對(duì)稻瘟病菌有拮抗作用的菌株BCHN-15，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA方法鑒定，該菌株為解淀粉芽胞桿菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BCHN-15能顯著抑制稻瘟病菌的生長，與稻瘟病菌作用48 h后，稻瘟病菌的菌絲干重與對(duì)照組相比減少了74.36%。該菌產(chǎn)生的抑菌成分可破壞稻瘟病菌的細(xì)胞膜，且對(duì)熱穩(wěn)定，其活性成分能被鹽酸沉淀。結(jié)果表明，BCHN-15可通過破壞稻瘟病菌的細(xì)胞膜，引起菌絲畸形和斷裂來發(fā)揮其抑菌作用。

稻瘟病菌; 拮抗菌; 抑菌作用

稻瘟病是一種真菌性水稻病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)11%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致絕產(chǎn)[1-2]。長期以來，主要采用化學(xué)方法防治水稻稻瘟病病害[3]。但由于長期大量地使用化學(xué)農(nóng)藥，會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，并對(duì)人畜健康和環(huán)境造成損害和污染，因此生物防治方法成為目前防治稻瘟病的主要方向[4]。其中由于海洋微生物的多樣性和差異性，可以產(chǎn)生比陸生微生物結(jié)構(gòu)更新、活性更高、功能更具獨(dú)特的抗菌活性物質(zhì)[5]，因此本研究室擬從海洋中分離獲得對(duì)稻瘟病菌有拮抗作用的微生物，并對(duì)其抑制稻瘟病菌的作用機(jī)制進(jìn)行研究，旨在今后為其開發(fā)成高效的生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稻瘟病菌 由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。

1.1.2 樣品采集 從大連開發(fā)區(qū)泊石灣近海海域取深度為10～20 cm處的海水和海泥，置于無菌袋中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病菌拮抗菌的分離、初篩和復(fù)篩 稱取2 g樣品，加入18 mL生理鹽水，采用10倍梯度稀釋法進(jìn)行分離，將分離到的單菌落用斜面保存?zhèn)溆?。稻瘟病拮抗菌的初篩采用瓊脂塊對(duì)峙法[6]：鉆取6 mm稻瘟病菌菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中心，用接種環(huán)挑取上述分離到的各拮抗菌，在距平板中心2.5 cm處十字交叉接種，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。將對(duì)稻瘟病菌有抑制作用的拮抗菌用牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩[7]：用5 mL無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)5 d的稻瘟病菌絲，混勻，取1 mL倒入冷卻至約45 ℃的PDA培養(yǎng)基中，混勻倒平板。待平板凝固后，在中央放入牛津杯，杯中加入200 μL初篩菌株的培養(yǎng)液，28 ℃下培養(yǎng)72 h，測(cè)量抑菌圈直徑并記錄結(jié)果，以無菌水為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 稻瘟病拮抗菌的鑒定 采用生理生化法和16S rDNA法對(duì)分離的拮抗菌菌株進(jìn)行鑒定[8-9]。

1.2.3 拮抗菌對(duì)稻瘟病菌生長量的影響 將活化好的稻瘟病菌的孢子，用無菌水制成107cfu/mL 的孢子懸液。取1 mL加入到20 mL PDA液體培養(yǎng)基中，再加入200 μL拮抗菌發(fā)酵液，振蕩培養(yǎng)48 h后12 000 r/min離心5 min，棄上清，無菌水沖洗3次后，將沉淀放入干燥箱干燥48 h后稱重，并計(jì)算菌絲重量的變化率。以加同樣體積的無菌水作為空白對(duì)照。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。稻瘟病菌菌絲重量變化率計(jì)算公式如下：

M：菌絲干重變化率/%，Mc：對(duì)照組菌絲重量/g，Ms:實(shí)驗(yàn)組菌絲重量/g。

1.2.4 拮抗菌對(duì)稻瘟病菌菌絲形態(tài)的影響 采用1.2.1的瓊脂塊對(duì)峙法進(jìn)行測(cè)定。用接種針挑取有明顯抑菌條帶的邊緣菌絲，制成裝片，在顯微鏡下和掃描電鏡下分別觀察菌絲形態(tài)的變化，以對(duì)照邊緣的菌絲為對(duì)照。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞膜的影響[10]稱取2 g培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的稻瘟病菌菌絲，用40 mL培養(yǎng)基懸浮，然后加入200 μL拮抗菌發(fā)酵液，于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6和8 h時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中糖和蛋白質(zhì)的含量。糖的測(cè)定采用蒽酮比色法，蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以不加拮抗菌發(fā)酵液只加入等量培養(yǎng)基組為空白對(duì)照。

1.2.6 拮抗菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測(cè)定 將拮抗菌發(fā)酵液分別置于60、80、100和120 ℃下處理20 min，按照1.2.3的方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以未經(jīng)處理的原發(fā)酵液為對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 拮抗菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)分析[11]取25 mL拮抗菌發(fā)酵液，緩慢加入2 mol/L鹽酸調(diào)pH值至2.0左右，4 ℃下靜置過夜，于10 000 r/min離心30 min，分別測(cè)定上清液和沉淀部分(沉淀用少量無菌水溶解)對(duì)稻瘟病菌的抑菌作用，以不含拮抗菌的發(fā)酵液為對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌拮抗菌的篩選結(jié)果

本研究從大連開發(fā)區(qū)近海海域中，經(jīng)平板稀釋法分離共獲得83株菌，經(jīng)初篩和復(fù)篩，有4株細(xì)菌對(duì)稻瘟病菌有抑制作用，其中BCHN-15的抑菌活性最好，其抑菌圈直徑達(dá)到41.4 mm(圖1)。

2.2 BCHN-15菌株形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果

BCHN-15菌落呈圓形，白色，表面有褶皺，邊緣整齊，無光澤，濕潤、不透明。顯微鏡下的個(gè)體形態(tài)為桿狀，革蘭染色陽性，能形成芽胞(圖2)。生理生化鑒定結(jié)果與解淀粉芽胞桿菌的特征基本相同(表1)，可初步鑒定BCHN-15菌株為解淀粉芽胞桿菌。

2.3 BCHN-15菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

將BCHN-15菌株經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，并提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)KJ608175。通過Blast程序與GenBank核酸序列庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，BCHN-15菌株的16SrDNA序列與解淀粉芽胞桿菌(登錄號(hào)分別為HE774 679.1、FJ685 773.1、AB244 462.1、AB245 422.1、CP000 560.1)的同源性均為100%。用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示BCHN-15菌株與Bacillusamyloliquefaciens位于同一簇群，親緣關(guān)系最近。根據(jù)BCHN-15菌株的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列的分析結(jié)果，BCHN-15被鑒定為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖1 BCHN-15對(duì)稻瘟病菌的抑制效果Fig.1 The inhibit effect of BCHN-15 against rice blast fungusA:瓊脂塊對(duì)峙法篩選稻瘟病拮抗菌；B:牛津杯法篩選稻瘟病拮抗菌A:The screening of antagonistic strain against rice blast by Flat-stand method；B:The screening of antagonistic strain against rice blast by Oxford plate method

表1 BCHN-15菌株的生理生化特征

注：“+”：反應(yīng)呈陽性；“-”： 反應(yīng)呈陰性

圖2 BCHN-15菌株的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of BCHN-15 strainA: 菌落形態(tài)；B:芽胞染色；C：掃描電子顯微鏡A：Colony morphology； B：Spore staining；C：Scanning electron microscopy

2.4 BCHN-15發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌生長量的影響

BCHN-15菌株能顯著抑制稻瘟病菌的生長，當(dāng)該菌發(fā)酵液作用稻瘟病菌48 h后，與對(duì)照組相比，稻瘟病菌的菌絲干重減少了74.36%(P<0.01)。

2.5 BCHN-15發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌菌絲形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BCHN-15菌株發(fā)酵液可明顯影響稻瘟病菌的菌絲形態(tài)，與對(duì)照組相比，經(jīng)BCHN-15菌株發(fā)酵液處理24 h后的稻瘟病菌，其菌絲頂端膨大，出現(xiàn)囊泡，菌絲扭曲，畸形和斷裂等現(xiàn)象(圖 4)，該結(jié)果與電子掃描顯微鏡結(jié)果一致(圖 5)。

圖3 BCHN-15菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of BCHN-15 strain

圖4 稻瘟病菌菌絲的顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 The microscope picture of rice blast fungus hyphaeA：對(duì)照組菌絲;B: BCHN-15作用48 h后的菌絲A:The control group of hyphae; B: Treat with BCHN-15 for 48 h

圖5 稻瘟病菌菌絲的電子顯微鏡圖Fig.5 The Electron microscope of rice blast fungus hyphaeA：對(duì)照組菌絲； B：BCHN-15作用48 h后的菌絲A:The control group of hyphae； B: Treat with BCHN-15 for 48 h

2.6 BCHN-15發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞膜的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著BCHN-15菌株發(fā)酵液與稻瘟病菌作用時(shí)間的延長，培養(yǎng)液中糖和蛋白的濃度逐漸上升(圖6)，當(dāng)二者作用10 h時(shí)，與對(duì)照組相比，糖和蛋白的含量分別增加了285%和108%(P<0.01)，表明稻瘟病菌的細(xì)胞膜受到了破壞，胞內(nèi)的大分子物質(zhì)滲漏到了細(xì)胞外。

圖6 BCHN-15發(fā)酵液對(duì)稻瘟病菌培養(yǎng)液中糖和蛋白的影響(n=3)Fig.6 he Effect of saccharide and protein by BCHN-15 which is in the culture of Magnaporthe oryzae(n=3)

2.7 BCHN-15發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BCHN-15發(fā)酵液在低于100 ℃下處理時(shí)，發(fā)酵液的抑菌活性變化不大，表明BCHN-15菌株發(fā)酵液的活性成分熱穩(wěn)定性較好，但過高的溫度(120 ℃)會(huì)破壞BCHN-15菌株抑菌活性成分(圖7)。

圖7 溫度對(duì)抑菌活性成分的影響Fig.7 The effect of temperature on antibacterialactive dingredients與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，n=3compare with the control group,*P<0.05,**P<0.01,n=3

2.8 BCHN-15發(fā)酵液活性成分分析

研究結(jié)果表明，不含BCHN-15菌株的發(fā)酵液經(jīng)鹽酸沉淀后，上清液和沉淀部分對(duì)稻瘟病菌均無明顯抑制作用，而BCHN-15菌株發(fā)酵液經(jīng)鹽酸沉淀后，其沉淀部分和上清液對(duì)稻瘟病菌均有明顯抑制作用，且沉淀部分的抑菌作用明顯高于上清液，表明BCHN-15菌株的抗菌活性物質(zhì)可以被酸沉淀(圖8)。

圖8 發(fā)酵液活性成分的抗菌效果Fig.8 The antibacterial effect of BCHN-15 fermented liqui active dingredients1：沉淀 2：上清1: precipitation; 2:supernatant

3 討 論

從海洋微生物中獲得具有新穎結(jié)構(gòu)的稻瘟病拮抗菌是目前防治水稻病害的有效方法之一[12]。Fudou等[13]從海洋中分離出多種對(duì)植物病原真菌具有抑菌作用的活性成分。本文從大連開發(fā)區(qū)近海海域分離到1株對(duì)稻瘟病菌有顯著拮抗作用的BCHN-15菌株，經(jīng)鑒定該菌株為解淀粉芽胞桿菌。已有的研究結(jié)果顯示，解淀粉芽胞桿菌具有廣譜的抑菌活性，對(duì)稻瘟病、炭疽病、灰霉病等多種真菌病害都有抑制作用[14]。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BCHN-15菌株對(duì)稻瘟病菌也具有顯著的抑制作用，該菌株發(fā)酵液作用稻瘟病菌48 h后，稻瘟病菌的菌絲重量明顯減少，并可使病菌的菌絲發(fā)生扭曲、變形、畸形和斷裂等現(xiàn)象，最終可能導(dǎo)致菌絲不能正常分化產(chǎn)生孢子，影響其繁殖。

細(xì)胞膜是保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞正常代謝的屏障結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜的破壞，導(dǎo)致菌體的生命活動(dòng)受到影響[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BCHN-15菌株發(fā)酵液可破壞稻瘟病菌的細(xì)胞膜，可使病菌細(xì)胞內(nèi)的糖和蛋白發(fā)生泄漏，進(jìn)而影響菌體的生物學(xué)功能或?qū)е滤劳?。關(guān)于解淀粉芽胞桿菌的抑菌作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要是因?yàn)椴煌瑏碓吹慕獾矸垩堪麠U菌其產(chǎn)生的抑菌活性成分不同。有報(bào)道顯示，解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的抑菌活性成分主要為抗生素和蛋白質(zhì)多肽，且代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性、耐酸、耐堿等特性[16]。本實(shí)驗(yàn)分離得到的BCHN-15所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)，熱穩(wěn)定性好，且能被酸沉淀，初步推測(cè)其抑菌物質(zhì)可能為蛋白質(zhì)類多肽，但其具體成分還有待于進(jìn)一步研究。

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Identification and Characterization of an Antagonistic Strain against Rice Blast

HUANG Yuan-hui, XIE Kun-peng, WANG Shuo, Lü Xue-xin, XIE Ming-jie

(Schl.ofLifeSci.,LiaoningNormalUni.,KeyLab.ofBio-tech. &Molec.DrugDevel’tofLiaoningProv.Dalian116081)

An antagonistic bacterial strain BCHN-15 against rice blast pathogen was isolated from the offshore sea area at Dalian using confrontation and Oxford cup methods. Physiologic and biochemistry experiments and 16S rDNA methods identified BCHN-15 was aBacillusamylobacter. The results showed that BCHN-15 could significantly inhibit the growth of the rice blast and the dried weight of rice blast mycelium of was reduced by 74.36% as compared with control groups 48 h after affected with rice blast pathogen. The active ingredients produced by the strain could destroy the cell membrane of rice blast pathogen, and at the same time, they showed thermal stability and they could be precipitated by hydrochloric acid. The results showed that the antibacterial mechanism of BCHN-15 involved in the activity may include damaging plasma membrane, and causing malformation and rupture in hyphae.

rice blast pathogen; antagonistic bacteria; microbial inhibition

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2013412);大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013E13SF108)

黃元慧 女，本科。研究方向?yàn)樯锟茖W(xué)。E-mail:1127876921@qq.com

* 通訊作者。女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)槲⑸锷-mail:xmj1222@sina.com

2015-10-11；

2015-11-11

Q939.9

A

1005-7021(2016)01-0030-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.006