瓜類果斑病菌的檢測與防治進(jìn)展

曾海娟， 吳淑燕， 邱 實， 李建武， 翟緒昭， 宋春美， 劉 箐

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

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瓜類果斑病菌的檢測與防治進(jìn)展

曾海娟， 吳淑燕， 邱 實， 李建武， 翟緒昭， 宋春美*， 劉 箐*

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

瓜類果斑病菌可引起西瓜、甜瓜等葫蘆科植物患病，可通過種子遠(yuǎn)距離傳播，是一種常見的瓜類采后果實腐爛的病原菌。該病害具有發(fā)病迅速、傳播速度快等特點(diǎn)，一旦感染會對瓜類產(chǎn)量帶來巨大損失，因而田間病菌的檢測與診斷及早期預(yù)防十分重要。本文系統(tǒng)地綜述了國內(nèi)外瓜類果斑病菌的免疫學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)檢測方法及防治等研究進(jìn)展。

瓜類果斑病菌；檢測；防治；進(jìn)展

瓜類果斑病是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，20世紀(jì)80年代后期該病害在美國數(shù)個州的西瓜上出現(xiàn)破壞性爆發(fā)而受到廣泛關(guān)注，自此，瓜類細(xì)菌性果斑病在世界范圍內(nèi)傳播開來。其病原為革蘭陰性菌的嗜酸菌屬燕麥種西瓜亞種(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli, Aac)，是一種具有高度破壞性的種傳病菌[1]。到目前為止，并無可以完全抵抗該病菌的商業(yè)化培育品種[2]。瓜類果斑病菌又稱西瓜斑菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科植物患病，據(jù)報道，在番茄、茄子等茄科植物的種子中也檢測到了該病原菌[3]，它可侵染果實、植株及種子，主要依靠帶菌種子傳播，使幼苗患病，出現(xiàn)褐色壞死斑。帶菌果實在采后貯藏運(yùn)輸過程中會感染健康果實，表面出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，最終導(dǎo)致整個果實腐爛，嚴(yán)重影響瓜類產(chǎn)量。 由于果斑病菌引起的病害具有發(fā)病迅速、爆發(fā)性強(qiáng)、傳播速度快等特點(diǎn)，一旦感染會給瓜類產(chǎn)量帶來巨大損失，成為影響我國瓜類生產(chǎn)的主要病害之一。因而，果斑病菌的快速、高靈敏度檢測方法的建立，對于指導(dǎo)田間預(yù)防、病害控制具有重要的現(xiàn)實意義。

1 檢測方法

在細(xì)菌的常規(guī)檢測方法、免疫學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)檢測方法中，常規(guī)檢測方法周期較長，操作較繁瑣。目前，用于果斑病菌的檢測方法研究最多的是免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法，與常規(guī)法相比，具有快速、高效、簡便等優(yōu)點(diǎn)。

1.1 免疫學(xué)檢測技術(shù)材料

免疫學(xué)檢測技術(shù)是應(yīng)用最廣泛的一種方法，抗體特異性識別并結(jié)合相應(yīng)的抗原是免疫學(xué)檢測的基礎(chǔ)，該方法具有特異、精確等優(yōu)點(diǎn)，但檢測靈敏度較低。目前用于檢測果斑病菌的免疫學(xué)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、免疫磁性微球法(Immunomagnetic Microspheres，IMMS)、膠體金免疫層析試紙條(Colloidal Gold Immunochromatography assay strip, GICA strip)等。

1.1.1 酶聯(lián)免疫吸附測定 ELISA為免疫學(xué)中的經(jīng)典實驗，具有操作簡便、相對特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Himananto等[4]建立了雙抗夾心法ELISA檢測果斑病菌，采用與瓜類細(xì)菌性果斑病菌近緣的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、其他植物病原菌、病葫蘆中的細(xì)菌、西瓜種子中的腐生菌均無交叉反應(yīng)的瓜類細(xì)菌性果斑病菌的特異性單克隆抗體，可成功地將帶菌株與健康株分開，與間接ELISA法相比提高了檢測的靈敏度。在對比試驗中[5]，將果斑菌的多克隆抗體與雙抗夾心法ELISA相結(jié)合檢測時，靈敏度僅有單克隆抗體的1/10。

1.1.2 免疫磁性微球技術(shù) 免疫磁性微球或稱免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMB)是包被有抗體或具有抗體結(jié)合功能的磁性微球，當(dāng)它與含有靶物質(zhì)的樣品混合孵育時，可與靶物質(zhì)特異性地結(jié)合而形成具有磁響應(yīng)性的復(fù)合物，此復(fù)合物可被磁場滯留，從而與樣品中其他雜質(zhì)分離。Charlermroj等[6]將免疫磁性微球與熒光抗體相連，用于捕獲相應(yīng)的病原菌，建立了植物病菌的多通道檢測方法，并對瓜類細(xì)菌性果斑病菌在內(nèi)的4種植物病原菌同時進(jìn)行檢測，可準(zhǔn)確、靈敏地檢測出4種菌，檢測時間為1 h，低于ELISA的4 h，該方法可大大縮短檢測時間。

1.1.3 膠體金免疫試紙 膠體金免疫試紙應(yīng)用于植物病原菌的檢測國內(nèi)外早有報道，如孫艷秋等[7]制備膠體金試紙檢測黃瓜細(xì)菌性角斑病，操作簡便，檢測時間短，且樣品不需要前處理?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道的用于檢測西瓜斑菌的試紙條主要是Agdia公司的膠體金試紙，如馮建軍等[8]使用該試紙條檢測瓜類果斑病菌，靈敏度為106cfu/mL，適于田間病害的快速檢測及診斷。目前國內(nèi)外并無相關(guān)文獻(xiàn)報道西瓜斑菌抗體制備及膠體金試紙的研制，預(yù)測在抗體制備及試紙研制方面可能會有較大的市場。免疫學(xué)方法利用了抗原抗體結(jié)合的特異性，ELISA應(yīng)用最廣泛；免疫磁性微球技術(shù)與ELISA相比縮短了檢測時間；膠體金試紙條檢測時間最短，約5～10 min即可出現(xiàn)結(jié)果，但容易出現(xiàn)假陽性。這3種方法檢測靈敏度約為105～106cfu/mL，有待提高。免疫學(xué)方法一般需要相應(yīng)的特異性抗體，而抗體的制備、純化過程較為繁瑣，周期較長，需要大量人力物力。因此，迫切需要建立高靈敏度、特異性強(qiáng)的檢測方法，以滿足微量植物病原菌快速檢測的需要。

1.2 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

1.2.1 基于 PCR的檢測方法 目前用于檢測的PCR方法主要有常規(guī)PCR、免疫PCR(Immune PCR, Im-PCR)、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)。以PCR為基礎(chǔ)的檢測方法需要特異性的引物，不同的DNA序列可設(shè)計不同特異性的寡核苷酸引物。董明明等[9]將Aac膠體金免疫層析(GICA)方法與PCR相結(jié)合，解決了試紙條的假陽性，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。王婧等[10]以Aac BOX短重復(fù)序列的PCR產(chǎn)物設(shè)計兩對引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2，建立巢式PCR(nested-PCR)方法，該引物可將Aac與其近源種燕麥?zhǔn)人峋ㄌ厝R蘭亞種(A.avenaesubsp.Cattleyae)、魔芋假單胞菌(A.avenaesubsp.konjaci)及其他不相關(guān)菌株區(qū)分開，檢測靈敏度為4.7×10 cfu/mL，比直接PCR靈敏度高出1 000倍。

免疫PCR是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。采用免疫捕捉PCR法及常規(guī)PCR法檢測果斑病菌時[11]，靈敏度分別為50～100 cfu/mL和104cfu/mL，免疫捕捉PCR法檢測少量瓜種的最適浸提液為3-N-嗎啡啉乙磺酸(MOPS)[12]，該方法具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)。免疫磁性分離PCR(IMS-PCR)，不受西瓜種子中PCR抑制因素的影響。研究表明[13]，IMS-PCR對西瓜種子浸泡液的最低檢出限為10 cfu/mL。Bahar等[14]以Aac的ERIC和BOX-PCR序列設(shè)計引物BX-S，采用IMS-PCR檢測果斑病菌，可檢測出5 000粒種子中0.02 %的帶菌種子，IMS-PCR法在檢測果斑病菌上具有高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR技術(shù)相比具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、高通量、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)[15]。Zhao等[16]采用選擇性培養(yǎng)基EBB及EBBA的瓊脂平板對果斑菌進(jìn)行富集后，結(jié)合real-time PCR建立了real-time BIO-PCR(enrichment PCR)，該方法對EBBA培養(yǎng)的瓜類細(xì)菌性果斑病菌的檢測靈敏度為1 cfu/mL。Real-time PCR與PCR相比，不需要凝膠電泳，避免了溴化乙錠的污染，檢測速度較快。

1.2.2 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù) 目前，等溫擴(kuò)增技術(shù)在檢測病原菌方面國外已有較多文獻(xiàn)報道，Oya等[17]采用膜過濾(membrane filtration)及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)檢測西瓜斑菌，以基因hrpG-hrpX的序列設(shè)計引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對種子浸泡液的檢測靈敏度為103cfu/mL，整個過程僅需2 h，可用于快速、準(zhǔn)確地檢測西瓜、甜瓜種子。Zhang等[18]采用等溫的DNA擴(kuò)增系統(tǒng)建立了交叉引物擴(kuò)增(Cross-priming amplification, CPA)，該反應(yīng)需要鏈置換DNA聚合酶，擴(kuò)增過程不需要熱變性及剪切酶，該方法檢測果斑菌純培養(yǎng)物的靈敏度為3.7×103cfu/mL，具有快速方便、靈敏特異，不需要精密儀器等優(yōu)點(diǎn)，適于自然感染的西瓜種子的檢測。

1.2.3 核酸探針及核酸傳感器 采用探針及傳感器檢測西瓜斑菌的檢測方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高。吳晶等[19]篩選特異性分子靶標(biāo)，設(shè)計了用于檢測果斑菌的padlock探針，該探針只能從目標(biāo)菌擴(kuò)增出100 bp大小的片段，非目的菌不能擴(kuò)增出片段，探針的靈敏度為10 pg。將探針與正向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(Macroarray)相結(jié)合，建立了能夠同時檢測多份樣品的分子檢測技術(shù)。Tian等[20]以16S～23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核糖體的DNA序列建立鎖式探針和斑點(diǎn)免疫印記法檢測瓜類果斑病菌，探針靈敏度為100 fg，可準(zhǔn)確檢出0.1%人工感染的西瓜種子。運(yùn)用傳感器方法檢測果斑病菌，主要是由生物、化學(xué)、物理等學(xué)科交叉衍生而來的。Zhao等[21]采用金納米顆粒標(biāo)記寡核苷酸，研制出檢測瓜類果斑病菌的DNA傳感器，該傳感器對目標(biāo)DNA定性檢測的最低檢出限為4 nmol/L，半數(shù)定量檢測的最低限為0.48 nmol/L，且檢測DNA序列時不需要后續(xù)處理，成為潛在的現(xiàn)場快速檢測DNA序列的有效工具。

1.2.4 生物芯片 可視基因芯片將特定的分子結(jié)合轉(zhuǎn)變成可以直接通過肉眼觀察到的信號，無需復(fù)雜的檢測設(shè)備，張靚等[22]用該方法檢測瓜類果斑病菌在內(nèi)的6種瓜類種傳細(xì)菌，以細(xì)菌純培養(yǎng)液為模板，利用多重PCR擴(kuò)增，目標(biāo)菌檢測靈敏度可達(dá)103～104cfu/mL，可用于種子上多目標(biāo)菌株的同步篩查，具有高靈敏度、高通量等特點(diǎn)。熊亮斌等[23]應(yīng)用蛋白宏陣列檢測西瓜細(xì)菌性果斑病菌，檢測靈敏度為2.3×105cfu/mL。與傳統(tǒng)ELISA法相比，本方法只需1/12的捕獲抗體，1/8的檢測時間，檢測結(jié)果肉眼可判斷，極大簡化了操作難度，降低了成本。熊亮斌等[24]建立了改良DAS-Dot-ELISA法檢測果斑病菌，以硝酸纖維素膜為載體，對Dot-ELISA法的封閉條件、包被抗體濃度、點(diǎn)樣量等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，靈敏度達(dá)1.9×105cfu/mL,該方法與微孔板ELISA吻合率平均達(dá)99.0%。

1.2.5 質(zhì)譜分析方法 Kajiwara等[25]采用限制性內(nèi)切酶獲取果斑病菌DNA中的PCR引物，進(jìn)行熱變性后直接采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)進(jìn)行分析，整個過程僅需1 h，具有檢測時間短、成本低、可自動化等優(yōu)點(diǎn)。各種基因擴(kuò)增技術(shù)在病原菌檢測上的研究越來越多，基于PCR的檢測方法靈敏度較高，但需要精密的熱循環(huán)儀器；等溫擴(kuò)增技術(shù)在恒溫下即可完成擴(kuò)增，對儀器要求降低；生物芯片作為一種高通量的檢測方法，可用于多種病原菌的檢測，縮短了檢測時間。各種檢測方法比較見表1。

表1 各種檢測方法比較

2 防 治

瓜類果斑病菌是一種具有高度破壞力的種傳病菌。有報道表明[26]，健康西瓜籽苗若在開花期感染果斑菌，則果實中的種子會帶菌。目前可用于防治瓜類果斑病的方法主要有種子處理、化學(xué)防治、利用拮抗菌的生物防治。

2.1 種子處理

由于帶菌種子可實現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播，生產(chǎn)上必須加強(qiáng)對開花期植株監(jiān)控，加強(qiáng)種子帶菌率檢測，并對種子適當(dāng)處理，以減少種苗得病概率。

據(jù)報道，種子的快速干燥能有效控制帶菌種子幼苗果斑病的發(fā)生[27]，種子干熱處理也可降低感染率。Kubota 等[28]對感染果斑菌的西瓜、甜瓜、冬瓜、南瓜等種子采用不同的溫度及時間進(jìn)行干熱處理，甜瓜、黃瓜等小種子85 ℃處理3～5 d較合適，而冬瓜、葫蘆等大種子對干熱比較敏感。殼聚糖A在濃度為0.40 mg/mL處理種子時，可顯著抑制果斑菌的生長，且殼聚糖A的抗菌活性受濃度及培養(yǎng)時間的影響[29]。播種前帶菌種子采用40%甲醛100倍液浸種1 h，4 %鹽酸處理20 min，酸性電解水浸泡30 min，對西瓜幼苗的防效較好，對西瓜種子的發(fā)芽和幼苗的生長影響較小[30-32]。

2.2 化學(xué)防治

目前報道的用于防治果斑菌的化學(xué)藥劑主要有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47%加瑞農(nóng)可濕性粉劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%的新植霉素可溶性粉劑、農(nóng)用鏈霉素、DT殺菌劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的二氯異氰尿酸鈉可濕性粉劑750倍液、可殺得(氫氧化銅)2 000干懸浮劑800倍液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的葉枯唑可濕性粉劑750倍液，體積分?jǐn)?shù)為12%的松脂酸銅乳油800倍液。

王中武等[33]比較了藥液浸種法、苗期噴霧法、果實發(fā)病初期噴霧法的防治效果，關(guān)鍵用藥時期為苗期，其次為果實發(fā)病初期，可用于補(bǔ)充防治，浸種法最不理想。最可靠的藥劑為加瑞農(nóng)和新植霉素，防效均超過80%。陳海燕等[34]評估了5種藥劑在防治瓜類細(xì)菌性果斑病上的藥效，二氯異氰尿酸鈉防效最好為65.5%，可殺得、葉枯唑可濕性粉、鏈霉素和松脂酸銅乳油防治效果均在50%以上，在生產(chǎn)上可輪換使用。

2.3 生物防治

目前報道的可防治瓜類細(xì)菌性果斑病的拮抗菌主要有熒光假單胞菌 (Pseudomonasfluorescens)、稻種病原菌(Acidovoraxavenaesubsp.Avenae, AAA)、酵母菌。采用AAA處理的種子具有較強(qiáng)的抑菌作用，可減少96.5%果斑菌的傳播，AAA及熒光假單胞菌在開花期處理植株后的感染率分別為24.1%和13.8%，而PBS處理后感染率為60%[35]，可見，開花期進(jìn)行防治可有效降低種子帶菌率。Wang等[36]從植物的葉子及花中分離到的463株酵母菌中有24株在瓊脂平板上可以拮抗果斑菌，其中異常畢赤酵母(PichiaanomalaKurtzman)可形成大于18 mm的抑菌圈，噴灑時可降低果斑菌發(fā)生率及發(fā)病的嚴(yán)重程度。Concei??o等[37]采用葉面噴灑硅和紅酵母(Rhodotorulaaurantiaca)，對果斑菌的抑制效果高于苯并噻二唑，在29 d內(nèi)對果斑菌有抑制效果。目前防治果斑菌最常見的方法是種子處理，但會降低種子的發(fā)芽率，其中化學(xué)防治可能會導(dǎo)致環(huán)境中存在藥物殘留，生物防治效果比較理想，但如稻種病原菌可能會對其他植物存在威脅，需繼續(xù)探索生防菌的安全性。不同防治方法比較見表2。

表2 不同防治方法比較

3 小 結(jié)

瓜類果斑病菌是一種毀滅性的種傳細(xì)菌，該病菌抗干旱能力非常強(qiáng)，能夠在種子表面存活4～5個月[38]，少量的幼苗感染就可能造成病害大面積爆發(fā)。檢測果斑病菌的方法中，ELISA法應(yīng)用最普遍，但該法靈敏度相對較低。免疫學(xué)方法大都需要特異性的單克隆抗體，而抗體制備過程十分繁瑣；基于PCR的檢測方法靈敏度較高，但需要精密的熱循環(huán)儀器，對人員也有一定的操作要求，尚未廣泛應(yīng)用于實際的田間檢測，因而需繼續(xù)探索更加快速、靈敏、實用的檢測方法。

目前普遍認(rèn)為防治果斑病菌最根本的方法是選育抗病品種。鄭喜清等[39]發(fā)現(xiàn)抗病品種種皮的蠟質(zhì)含量與感病品種種皮的蠟質(zhì)含量存在顯著性差異，抗病品種高于感病品種。Carvalho等[40]評估了不同基因型的西瓜種子在不同的生長階段對瓜類細(xì)菌性果斑病的抵抗能力，基因型為BGCIA 979、BGCIA 34、Sugar Baby在多數(shù)的生長階段表現(xiàn)出較高的抵抗力，可用于培育抗果斑病的品種。生產(chǎn)上應(yīng)加強(qiáng)種子檢疫，盡量保證流入市場的種子是無菌的。播種前種子進(jìn)行處理，幼苗期采用化學(xué)藥劑或生物拮抗菌葉面噴灑預(yù)防，及時檢測，若發(fā)現(xiàn)病情應(yīng)及時施藥。同時應(yīng)加強(qiáng)對生防菌防治機(jī)理研究及瓜類抗病機(jī)制研究，推動更加環(huán)保、有效的防治方法的研制及高抗病品種的選育。

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Advances in Detection and Prevention of Melons Fruit Spot Pathogen

ZENG Hai-juan, WU Shu-yan, QIU Shi, LI Jian-wu, ZHAI Xu-zhao, SONG Chun-mei, LIU Qing

(Schl.ofMed.Instrum’t&FoodEngin.,Uni.ofShanghaiforSci. &Technol.,Shanghai200093)

Fruit spot pathogen of melons can cause watermelon, melon and other cucurbits to ill, it can be spread a long-distance by seeds and also is a common pathogen of postharvest decay. The disease has features of rapid onset, fast propagation and others. Once infected will bring huge losses on melon yield. Therefore, early detection and diagnosis and prevention of bacteria in the field are very important. The article systematically reviewed the progress of immunological detection methods, molecular biology detection methods and prevention of bacterial fruit spot pathogen of melons at home and abroad.

melons fruit spot pathogen; detection; prevention; progress

上海市科委高校能力建設(shè)項目(13430502400)；“科技創(chuàng)新行動計劃”長三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項目(15395810900)；上海市研究生教育創(chuàng)新計劃

曾海娟 女，博士研究生。研究方向為食品安全快速檢測技術(shù)。Tel：021-65710369，E-mail：zenghaijuan12@126.com

2015-02-10；

2015-05-05

Q939.95

A

1005-7021(2016)01-0100-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.017

* 通訊作者。劉箐 男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向為食源性致病菌致病機(jī)理及快速檢測技術(shù)。

Tel：021-65710369，E-mail：liuq@usst.edu.cn

宋春美 女，博士。研究方向為食品安全快速檢測技術(shù)。Tel：021-65710369，E-mail：zhiya007@163.com