細菌產生的活性氧及其功能

劉武康， 吳淑燕， 陳國薇， 張 超， 吳 嫚， 李 森， 劉 箐

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093)

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細菌產生的活性氧及其功能

劉武康， 吳淑燕， 陳國薇， 張 超， 吳 嫚， 李 森*， 劉 箐*

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093)

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)是需氧生物有氧代謝和專一酶類產生的含氧的、化學活性極強的一類小分子物質。按照其產生機理可分為兩大產生途徑，其一是呼吸作用中發(fā)生的單電子轉移產生的ROS，通常認為此途徑產生過量的ROS對生物大分子具有極強的氧化損傷，與多種疾病密切相關；其二是由專一酶類產生的少量ROS，一般認為此途徑產生的ROS具有殺滅入侵的外來微生物的作用，但近年來大量研究表明，此途徑產生的ROS可行使信號分子和基因開關等多種生理功能。同時，生物體自身的抗氧化系統(tǒng)也可直接調控ROS的水平。本文綜合分析近年來對細菌中的ROS的研究成果，并對目前存在的問題和未來的發(fā)展進行評述。

細菌；活性氧；抗氧化系統(tǒng)；功能

1 細菌活性氧及其功能研究進展

1.1 ROS在細菌中的產生途徑及其抗氧化體系

當ROS在生物體中被發(fā)現后，立即引起了關注。首先，需要研究的問題就是ROS在機體中是如何產生的，包括其產生的途徑、相關反應、相關酶類等；其次，由于機體內積累大量的ROS會產生多種損害，機體如何保持ROS脅迫下的氧化還原平衡同樣是受到廣泛關注的問題。

1.1.1 細菌中ROS的產生 細菌是一種原核生物，原核生物的呼吸作用主要發(fā)生在細胞膜上，由細胞膜上相關的酶催化反應的進行，因此細菌中ROS主要產生部位是細胞膜。細菌中ROS大部分是在呼吸鏈上的酶催化的氧分子連續(xù)單價電子的傳遞反應產生的，例如大腸埃希菌(Escherichiacoli)，呼吸鏈中所產生的過氧化氫能夠占到總量的87%左右[12]。此外，生長的環(huán)境也對細菌ROS的產量有影響，例如電離、UV輻射以及環(huán)境中某些小分子物質等的作用[13-14]。

Nox最早在高等動植物中發(fā)現，被認為是可以專一催化產生ROS的酶類，現在已有很多研究關注細菌中Nox。Nox的反應底物為O2和NADH或NADPH，根據所查閱的文獻，關于Nox的具體分類方法目前未有明確的定義。綜合各類文獻表述，以NADH為底物的Nox根據其產物一般分為兩類：Nox1的反應產物主要為過氧化氫；Nox2的反應產物為水，即狹義的NADH氧化酶[15]。Nox1一般存在于需氧型細菌的膜上或胞內，而Nox2一般存在于厭氧或兼性厭氧菌的胞內，其中大部分為乳酸菌[16]。Nox2由于產物為水，其主要作用一般是清除厭氧或兼性厭氧菌胞內過量的分子氧以獲得更適宜的生長條件。也有研究指出在某些抗氧化能力較弱的細菌中，如雙歧桿菌(Bifidobacterium)，由于Nox1催化的產物為氧化性較強的過氧化氫，會激發(fā)細菌超氧化物歧化酶(SOD)等酶類發(fā)揮作用，以此作為清除胞內過量氧的一種手段[17]。而以NADPH為底物的Nox一般存在于高等動植物中，該種Nox種類較多，包含NADPH 氧化酶催化亞基gp91phox(NOX2) 及其同源物NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1 和DUOX2 ，它們被統(tǒng)稱為NOX 家族[18]，但目前已有研究發(fā)現細菌中存在以NADPH為底物的Nox相關基因序列。

目前已發(fā)現的與細菌中ROS產生的相關途徑及相關酶類大多集中在呼吸鏈上，但呼吸鏈中生成的ROS多數都會進入連續(xù)的單電子轉移途徑，無法向外擴散，也不易在其他位置發(fā)揮作用，而對于專一催化產生ROS的酶類的研究目前也基本集中在Nox。目前對細菌中ROS產生途徑的了解仍不全面，也導致對ROS在細菌中的功能的研究有一定的局限性，因此關于細菌中ROS的產生途徑還有待深入研究，獲得的重要研究成果也將為后續(xù)的研究打下堅實的基礎。

1.1.2 細菌中的抗氧化體系 生物體中的ROS水平超過自身承受能力時，就會出現氧化應激，對機體造成損傷，因此生物體中都存在一系列調控機制用以維持ROS的穩(wěn)態(tài)[19]。生物體中與維持ROS穩(wěn)態(tài)相關的物質均為具有較好還原性的抗氧化物質，一般分為非酶類與酶類兩種。常見的非生物酶類抗氧化物質有維生素C(Vc)、維生素E(Ve)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、β-胡蘿卜素和黃酮類物質、多酚類物質等，它們的優(yōu)點是在生物體內可以快速擴散，可以作用于細胞膜，甚至直接在細胞外發(fā)揮作用，但缺點是不易進入細胞內。然而，由于多數非酶類的抗氧化物不能在機體內合成，所以這些物質大多是由高等動物從食物中獲得，細菌中非酶類抗氧化劑發(fā)揮的作用較少[10]。

微生物中發(fā)揮抗氧化作用的主要是酶類物質，最常見的有超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(Catalase)，超氧化物歧化酶催化超氧負離子發(fā)生歧化反應生成氧和過氧化氫，過氧化氫酶則催化過氧化氫生成水和氧氣，這兩種酶在微生物抗氧化系統(tǒng)中至關重要，維持了機體內的氧化還原平衡[20]。在細菌中，存在兩個氧化還原調控子，一個是對過氧化氫敏感的轉錄激活子 OxyR，它可以控制谷胱甘肽還原酶、NADPH-依賴的烷基氫過氧化物還原酶等基因的表達，這些物質主要用來清除機體中過量的過氧化氫；另一個轉錄調控子是二級 SoxRS系統(tǒng)，它用來抵御過量的超氧陰離子，調控的基因有 SOD、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、鐵氧還原蛋白等[21-22]。 由此可見，細菌中的ROS水平很大程度上取決于細菌的抗氧化系統(tǒng)的活躍程度，大部分情況下細菌體內ROS水平激增都伴隨著體內抗氧化系統(tǒng)活力的減弱，沒有足夠的還原性物質和還原性酶活力降低均導致細菌中ROS的大量產生并在體內不斷積累。

細菌中ROS的產生和ROS穩(wěn)態(tài)的保持有多種酶、蛋白質、核酸和小分子物質的參與，涉及的反應種類多、過程復雜，許多機理目前仍不明確。關注細菌中產生ROS的相關基因和酶類，以及細菌的抗氧化系統(tǒng)，不僅對研究細菌的生命活動有重要意義，也對高等動物乃至人類的衰老、疾病等問題的研究有著促進作用。

1.2 ROS在細菌中的功能

1.2.1 ROS對細菌的氧化損傷 ROS被認為參與了細胞的衰老、凋亡或者癌變，其產生危害主要是由于ROS會造成細胞中的各種生物大分子快速氧化，對細胞危害極大[23-25]。已有的研究成果表明，生物體中的DNA、RNA、脂質和蛋白質等對ROS都很敏感，過量的ROS對這些物質都會造成損傷。其中，脂類物質是氧脅迫損傷的主要對象，自由基直接與細胞膜上的多不飽和脂肪酸反應，引起脂質的過氧化，造成細胞膜流動性的降低，改變了細胞膜的特性，進而破壞細胞膜蛋白[26-27]。除此之外，DNA也是ROS的主要攻擊對象，ROS可損傷DNA中的堿基和糖組分，進而破壞了DNA的雙鏈結構，影響了DNA的正常復制，增加了突變的發(fā)生概率[28-29]。細菌中過量生成ROS后與體內重要生物大分子發(fā)生的反應，無一例外都是對細胞有毒性的，都會影響細菌的正常生存。

1.2.2 細菌中ROS的信號分子作用 由于ROS對于細胞的毒性，過量的ROS必然會引起細菌生長減緩，很多文獻報道也驗證了這一點。Yesilkaya等[30]研究了肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)在較高ROS環(huán)境下的生存狀況，發(fā)現當環(huán)境中氧脅迫壓力產生時，細菌的增殖會明顯減緩，但將環(huán)境中的氧脅迫撤去后，細菌自身的活力會很快恢復，致病性也沒有明顯下降，因此認為環(huán)境中少量的ROS會激發(fā)細菌的防御體系，增殖減緩并非細菌本身受到殺傷，而可能是細菌的主動行為，目的是為了減少突變的發(fā)生和原發(fā)性損傷，這一觀點提醒我們在研究ROS對細菌生長的影響時，不能只關注ROS對細菌生長的影響，還要對細菌本身生理機能的變化進行觀察。Huang等[31-32]的研究發(fā)現，單核細胞增生性李斯特菌4b G(Listeriamonocytogenes4b G)中存在抗氧脅迫基因gltB和gltC，該基因的缺失菌株在氧脅迫條件下增殖能力下降明顯，且菌膜生成能力同時下降。菌膜作為細菌的一種特殊的應對外界不利環(huán)境的生存方式，其生成能力受ROS的影響也驗證了ROS與細菌的生長狀況有直接關系[33-35]。ROS作為一種信號分子，探究其影響細菌生長狀況過程中的具體作用，有利于研制和開發(fā)新型、高效的殺菌劑和抑菌劑，控制微生物污染，對臨床醫(yī)學、食品安全等方面都有著積極意義。

1.2.3 ROS與病原菌致病力 對于致病細菌，ROS與其致病力的關系倍受關注，而根據文獻的報道，ROS對致病菌致病力一般有上調或是下調兩種影響，根據細菌的種類不同其影響程度和作用方式也有所不同。鄒海杰[36]以大腸埃希菌(Escherichiacoli)為模型研究了革蘭陰性菌外膜蛋白OmpW在抗宿主氧化應激中的作用，結果表明，在致病菌入侵人體的過程中，非特異性免疫中由二價鐵離子引發(fā)的芬頓反應釋放羥自由基是一種高效的免疫手段，然而游離態(tài)的鐵離子增多會增加革蘭陰性菌鐵離子的攝入，同時過量的羥自由基損傷人體自身細胞，使得致病菌致病力增加，而外膜蛋白OmpW在這一過程中起到了抗氧化脅迫并增加細菌鐵離子攝入的作用。Corcionivoschi等[37]在研究ROS與空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)致病力時發(fā)現，黏膜免疫過程中釋放的ROS會擾亂磷酸酪氨酸信號，從而下調了該細菌的致病力。Derr等[38]則在以變異鏈球菌(Streptococcusmutans)為對象研究NADH氧化酶在該細菌引起口腔疾病的致病機理時發(fā)現，NADH氧化酶可以加快糖代謝效率，在其黏附牙齒形成菌膜時造成局部的酸性環(huán)境，從而引發(fā)齲齒。可見，由于機體自身的免疫過程和細菌自身的代謝均有ROS的生成，因此ROS對病原細菌的致病力有直接影響。

1.2.4 ROS與腸道益生菌對腸道保護作用 嬰幼兒的腸道在未發(fā)育成熟的階段，極易產生急性腸炎，目前常見的治療方法就是增加腸道益生菌的攝入，深入研究發(fā)現腸道益生菌在保護腸道的過程中，ROS可能起到了關鍵的作用。Lin等[39]的研究發(fā)現對出生后腸道發(fā)育未成熟的小鼠使用鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)灌胃可以明顯降低感染性腸炎的發(fā)病率，其機理是該種益生菌可以使腸道上皮細胞局部的ROS產量增加，使與炎癥信號產生相關的酶類被氧化后失活，大大降低炎癥發(fā)生的概率，并認為這可能就是許多益生菌能明顯降低新生兒和幼兒腸炎發(fā)生概率的原因。Jones等[40]研究發(fā)現，腸道中的乳酸菌由Nox介導釋放的ROS可以促進小鼠和果蠅腸道上皮細胞的增殖和分化，從而起到保護腸道、防止腸炎發(fā)生等益生作用。益生菌和致病菌在人體中往往是相互制約的關系，而ROS可能在二者相互拮抗的過程中起到關鍵作用，了解益生菌在體內發(fā)揮作用的機理，探究ROS在這一過程中的具體作用，則可以從源頭上控制某些由致病菌引起的健康問題。

1.2.5 ROS與細菌耐藥性 除了上述幾個方面，還有研究關注了ROS與細菌抗生素耐藥性的關系。多數研究認為，很多抗生素或抗菌劑的作用機制是誘導細菌自身產生過量的ROS而造成氧化損傷以起到殺菌作用[41-43]。Boles等[44]的研究發(fā)現綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)在四環(huán)素、利福平、慶大霉素等抗生素脅迫下形成菌膜，菌膜中的氧化脅迫造成的DNA斷裂在修復后形成突變體，從而產生具有耐藥性的菌株，但文獻中未提及ROS產生途徑。Aiassa等[45]的研究發(fā)現，奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)在菌膜或游離狀態(tài)下，通過提高自身的抗氧化防御能力，來提高自身抵抗抗生素環(huán)丙沙星的殺菌作用，在環(huán)丙沙星作用下該菌的多種調控抗氧化相關酶類的基因大量表達。因此可以假設，多種抗生素的作用機制是引發(fā)細菌自身產生氧化損傷，而自身抗氧化能力較強或是氧化損傷造成的抗氧化能力增強的突變體則會具有更強的耐藥性，長期使用抗生素類藥物可能增加細菌的突變概率，使強耐藥性菌株產生的概率增加。研究ROS與細菌耐藥性之間的關系及其作用機制，對研發(fā)新型抗生素、控制抗生素濫用有著積極作用。

綜上所述，ROS在生物體中的作用不是單一的、絕對的，在研究時，應全面分析其在生物體中的積極作用和消極作用，且應更多地關注ROS的積極作用。細菌往往會通過某些途徑主動生成較低水平的ROS，這些ROS在細菌中起到信號或是調節(jié)的作用，激發(fā)細菌某些特殊機制，如進入防御狀態(tài)、輔助細菌入侵宿主細胞、抑制環(huán)境中其他競爭者等。在以細菌為對象對ROS進行研究時，應將ROS與細菌生長狀況、致病能力、相關基因表達水平等方面變化綜合分析，并深入研究ROS參與各種生命活動的具體作用通路。

2 細菌活性氧研究中存在的問題

雖然ROS已經受到廣泛關注，但由于其本身的許多特殊性質，造成了研究過程中的許多困難[46]。在研究細菌中的ROS時，存在的主要問題有：由于ROS較高的活性和較低的穩(wěn)定性，這對觀測細菌中ROS含量的趨勢變化造成了一定的困難；ROS本身可以參與的反應是多種多樣的，因此在研究細菌中的ROS時，很難同時對不同的反應進行分析，難以分析ROS發(fā)揮作用的具體途徑；ROS在細胞內和細胞外的時間、空間上的分布復雜，在不同部位ROS的產生途徑和作用機制都不相同，目前的技術還難以做到針對細菌中某個準確的時間點和部位的ROS進行觀測和分析；ROS在生物體內的存在情況很大程度上取決于生物體本身的狀態(tài)，細菌自身的生理狀態(tài)會很大程度影響ROS的產生，使實驗的偶然性很大，而動物實驗的不確定因素則更多；目前還是缺乏可靠的技術方法測定ROS在生物體內的絕對濃度，即使測定相對濃度也有困難，測定細菌中的ROS時，通常使用熒光探針進行檢測[47]，常見的有DCFH-DA，一般使用96孔板培養(yǎng)后用DCFH-DA孵育于酶標儀中檢測熒光值[48]，也有報道使用流式細胞儀對單個細胞ROS水平進行觀測[49]，但是這些檢測方法都存在無法測定絕對或相對濃度、無細節(jié)分辨能力等問題。

3 展 望

近年來，大量的研究都在關注ROS與生物體的衰老、疾病、細胞凋亡之間的關系，試圖尋找ROS的具體作用通路，并推動醫(yī)學的發(fā)展，探尋許多疾病的新的診斷、治療方法。細菌種類多，在自然界中廣泛存在，增殖快，環(huán)境適應能力強，細菌的各項生命活動也與動植物及人類緊密相關，例如人體中的細菌數量、種類以及生長狀況在某種程度上反映了機體的健康狀況。因此，研究細菌中的ROS是ROS相關研究領域的重要組成部分，獲得的研究成果也對其他領域的研究有促進作用。

對于細菌中ROS產生的途徑和方式，呼吸鏈途徑研究得較為深入，但是呼吸鏈上ROS的產量雖大，時間空間上的分布卻較為有限，產生后脫離呼吸鏈作用于其他部位的可能性較小。多數研究構建與呼吸鏈中ROS產生相關的基因缺失菌株，可以達到使細菌ROS水平激增的效果，同時也會觀測到細菌各方面生命活動的變化，但是這種手段也有一定的局限性，呼吸鏈中的關鍵基因缺失，雖然促使ROS的大量生成，但是呼吸作用可能也會受到影響，因此細菌各方面的變化并不一定是ROS激增造成的氧損傷，也有可能是呼吸作用受到阻礙造成的。因此，若要深入研究ROS在細菌中的具體作用，尋找未知的ROS產生的途徑和場所，還需發(fā)現類似Nox蛋白可以在特殊部位針對性地產生ROS的物質。雖然細菌體內的ROS只在固定的部位產生且具有強氧化性，難以從產生部位向外部擴散，但是經ROS氧化的脂質生成的醛類物質卻能夠較穩(wěn)定地存在，并擴散至外部，損傷其他部位。因此可以假設，很多情況下ROS造成的損傷并非是其直接造成的，而是由ROS氧化某些生物大分子生成的具有一定氧化性的醛、酸等物質間接作用造成的，對于這些ROS的氧化產物在細菌中的作用，在研究時不可忽視。此外，目前的研究對象多數為常見的、需氧型的菌種，還需關注一些在極端條件下生存的或是完全厭氧的細菌，這些細菌自身的抗氧化系統(tǒng)如何應對外界的氧脅迫、ROS對其生長的影響不應忽視。

目前，針對細菌中ROS的研究涉及生物化學、分子生物學、微生物學、醫(yī)學等多個學科，取得了很多重要的成果，但是多數集中在研究ROS與細菌生長、致病性、抗逆性之間的相關性，很多ROS具體的作用方式和作用通路尚不明確。同時，對ROS的研究還要依靠先進的技術方法，解決目前ROS研究時不易觀察、實驗結果偶然性大、ROS濃度難以測定等方面的問題，這些則涉及物理、化學、材料學、工程機械和計算機等領域。

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The Reactive Oxygen Species Generated by Bacteria and its Functions

LIU Wu-kang, WU Shu-yan, CHEN Guo-wei, ZHANG Chao, WU Man, LI Sen, LIU Qing

(Schl.ofMed.Instrum't&FoodEngin.,ShanghaiUni.forSci. &Technol.,Shanghai200093)

Reactive Oxygen Species (ROS) is a kind of oxygenous small molecular substance with extremely strong chemical activity generated during aerobic metabolism of aerobe and specific enzymes. It has two major generation approaches according to its production mechanism. The first one is ROS generated by single electron transfer in respiration. Generally the superfluous ROS generated from this approach has great oxidative damage to biomacromolecule and is closely related to many diseases. The second one is the small amount of ROS generated by specific enzymes. Usually believing, the ROS generated by this approach has the effect of killing invasive foreign microorganism. However, recently a large number of studies have shown that the ROS generated by this approach have multiple physiological functions such as signal molecular and genetic switch. Simultaneously, antioxidant system of organisms also can directly regulate the level of ROS. This paper observed on the research achievement of ROS in bacteria recently and the existing problems and the future development.

bacterium; reactive oxygen species; antioxidant system; function

國家自然科學基金項目(31371776)

劉武康 男，碩士研究生。研究方向為食源性致病菌致病機理。E-mail：liu_wukang@126.com

* 通訊作者。李森 女，博士，講師。研究方向為食源性致病菌致病機理。E-mail：lisen_1027@126.com

2015-03-23；

2015-05-06

Q936；Q505；Q507

A

1005-7021(2016)01-0089-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.015

劉箐 男，博士，教授，博士生導師。研究方向為食源性致病菌致病機理及快速檢測技術研究。Tel：021-65710369,

E-mail：liuq@usst.edu.cn