HB13對大鼠的一般生殖毒性研究

龔夏實(shí) 張 彤 李 燕 惠曉琳 李繼洪

湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司湖北省藥物安全性評價(jià)中心（武漢 430061）

HB13對大鼠的一般生殖毒性研究

龔夏實(shí) 張 彤 李 燕 惠曉琳 李繼洪

湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司湖北省藥物安全性評價(jià)中心（武漢 430061）

目的 觀察HB13對SD大鼠的一般生殖毒性。方法 SD大鼠，雌雄各100只，分為低、中、高劑量組（20、40和80mg/（kg·d））和對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），每組25只。雄鼠于交配前28 d給藥，雌鼠于交配前14天給藥，給藥至妊娠第7天。雄鼠交配后處死，孕鼠于妊娠第14天頸椎脫臼處死，觀察HB13對雌雄鼠一般情況、生育力和胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果 與對照組相比，HB13高、中劑量組雄鼠給藥期體重減輕，睪丸系數(shù)及附睪系數(shù)增大，異常精子率升高；高劑量組還使雄鼠生育力降低。給予高、中劑量HB13的雌鼠妊娠后體重較對照組減輕，著床后丟失率增高，吸收胎數(shù)增加，活胎數(shù)減少，連胎子宮重降低；高劑量組HB13還使雌鼠生育率及著床數(shù)降低，著床前丟失率升高。結(jié)論 HB13低劑量對雌、雄性大鼠無一般生殖毒性；中劑量對孕鼠早期胚胎發(fā)育有明顯干擾作用；高劑量對雌、雄大鼠生育力有顯著降低作用并且對早期胚胎發(fā)育有明顯干擾作用。

HB13 生殖毒性 大鼠 生育力 胚胎發(fā)育

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的一種全身性疾病，近年來其發(fā)病率及致殘率呈逐年升高趨勢［1-2］。其發(fā)病機(jī)制一般認(rèn)為是感染后引起的自身免疫反應(yīng)，常見癥狀是關(guān)節(jié)腫痛，晚期可引起關(guān)節(jié)的強(qiáng)直、畸形和功能嚴(yán)重受損，對人類的健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響［3］。HB13作為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一類新型非甾體抗炎藥物，暫未見其相關(guān)的生殖毒理研究報(bào)道，本研究擬對HB13的生殖毒性展開研究，為其在臨床安全使用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動物 5～6周齡SPF級SD大鼠200只（雌雄各半），實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK（湘）2009-0004，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SYXK（鄂）2009-0023，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。飼料為北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的專用鼠顆粒飼料，飲水為高壓滅菌水。室溫20℃～23℃，相對濕度41%～68%，光照為明12 h，暗12 h。

1.2 材料 HB13（批號:10031101，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（批號: 2010020，湖南爾康制藥有限公司提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法［4-9］將雌雄大鼠各100只隨機(jī)分為4組，即低、中、高劑量組（20、40和80mg/（kg·d））和溶媒對照組，每組25只，每天灌胃給藥。雄性大鼠給藥4周后與給藥2周的雌鼠以1∶1合籠，合籠期間連續(xù)給藥，并每日進(jìn)行陰栓或陰道涂片檢查，查到陰栓或精子日定為妊娠第0天，雌鼠繼續(xù)給藥至妊娠第7天。雄鼠交配成功后停藥頸椎脫臼處死，稱取睪丸和附睪的重量，對附睪中的精子計(jì)數(shù)并進(jìn)行精子活力檢查和精子形態(tài)學(xué)檢查。2周內(nèi)未交配成功的雌雄大鼠停藥頸椎脫臼處死，交配成功的雌鼠于第14天頸椎脫臼處死，解剖檢查，肉眼觀察母鼠心、肝、脾、肺、腎、子宮及卵巢有無異常，計(jì)數(shù)黃體數(shù)，活胎、死胎、吸收胎并計(jì)算著床數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析。交配率、生育率、受孕率用χ2檢驗(yàn)，其余指標(biāo)用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 HB13對雄性大鼠的影響 與對照組比較，高、中劑量組雄鼠體重增長減慢，在給藥后體重降低（P＜0.01）（見表1）；高劑量組雄性大鼠生育率降低（見表2），高、中劑量組的睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)（見表3）、異常精子率均增加（見表4）。

表1 HB13對雄性大鼠體重的影響（±s）

表1 HB13對雄性大鼠體重的影響（±s）

注:與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 n 不同給藥周數(shù)體重（g）0周 1周 2周 3周 4周對照組 25 208.0±7.8 270.0±10.0 328.0±14.6 378.0±20.0 410.0±23.0低劑量組 25 208.0±7.9 269.0±12.3 323.0±18.1 368.0±27.8 400.0±29.4中劑量組 25 208.0±8.2 263.0±10.5 313.0±15.1** 355.0±19.2** 383.0±23.4**高劑量組 25 208.0±8.3 260.0±9.7** 304.0±13.8** 345.0±16.4** 362.0±22.5**

表2 HB13對雄性大鼠交配率和生育率的影響

2.2 HB13對雌性大鼠的影響 與對照組相比，HB13各劑量組孕鼠妊娠給藥期體重降低（P＜0.05），而孕鼠妊娠停藥后，高、中劑量組孕鼠體重降低（P＜0.01）（見表5）。高劑量組能降低雌性大鼠受孕率（見表6），使著床數(shù)減少（P＜0.01），著床前丟失率和著床后丟失率均增高（P＜0.01），可吸收胎數(shù)增加（P＜0.05），活胎數(shù)減少（P＜0.01），連胎子宮重降低（P＜0.01）；中劑量組雌鼠著床后丟失率增高（P＜0.01），吸收胎數(shù)增加（P＜0.05），活胎數(shù)減少（P＜0.01），明顯干擾孕鼠早期胚胎發(fā)育。（見表7、表8）

表3 HB13對雄性大鼠睪丸和附睪的影響（±s）

表3 HB13對雄性大鼠睪丸和附睪的影響（±s）

注:與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 n 睪丸重量（g） 睪丸系數(shù)（%） 附睪重量（g） 附睪系數(shù)（%）對照組 25 3.52±0.276 0.85±0.085 0.88±0.079 0.21±0.019低劑量組 25 3.51±0.268 0.87±0.084 0.92±0.132 0.23±0.035中劑量組 25 3.57±0.270 0.92±0.118* 0.92±0.117 0.23±0.026*高劑量組 25 3.66±0.299 0.98±0.097** 0.95±0.136 0.25±0.030**

表4 HB13對雄性大鼠精子形態(tài)的影響（±s）

表4 HB13對雄性大鼠精子形態(tài)的影響（±s）

注:與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 n 無定形（‰） 無鉤（‰） 香蕉形（‰） 雙頭（‰） 尾折形（‰） 異常精子率（‰）對照組 25 3.00±1.73 0.90±1.12 0.80±1.07 0.00±0.00 3.30±1.99 8.20±3.03低劑量組 25 2.00±1.55 3.30±2.10** 1.10±1.12 0.00±0.00 3.40±2.71 9.80±1.71中劑量組 25 3.60±1.66 2.60±1.64** 1.30±1.28 0.00±0.00 4.00±2.49 11.40±3.40**高劑量組 25 5.00±2.56* 2.60±2.18** 1.20±1.13 0.10±0.40 5.20±2.49* 14.20±4.39**

表5 HB13對孕鼠體重的影響（±s）

表5 HB13對孕鼠體重的影響（±s）

注:與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 n妊娠后不同天數(shù)體重（g）第0天 第3天 第5天 第7天 第10天 第14天對照組 24 283.0±19.8 307.0±19.6 315.0±21.1 323.0±21.1 342.0±23.1 363.0±24.3低劑量組 20 269.0±14.6* 292.0±12.2* 301.0±11.6* 309.0±13.3* 328.0±13.9 354.0±18.6中劑量組 20 265.0±19.3* 280.0±17.9* 287.0±17.4** 293.0±16.3** 313.0±13.6** 337.0±16.1**高劑量組 8 264.0±13.0* 271.0±12.5* 281.0±17.7** 283.0±15.7** 308.0±14.6** 323.0±16.0**

表6 HB13對雌性大鼠交配率和受孕率的影響

3 討 論

環(huán)氧合酶（COX）是由花生四烯酸合成前列腺素過程中的限速酶。目前，已發(fā)現(xiàn)由不同基因編碼的COX-1、 COX-2、COX-3，COX-2在妊娠中具有非常重要的作用，在妊娠期，主要存在于子宮平滑肌和子宮內(nèi)膜細(xì)胞，分別具有誘發(fā)分娩和維持妊娠的作用，同時(shí)，COX-2產(chǎn)生的前列腺素I2（PG I2）、前列腺素E2（PGE2）在受精、卵裂、胚囊植入過程中均發(fā)揮重要作用，能啟動和維持產(chǎn)程［10-11］。

HB13為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的非甾體抗炎藥，其療效主要源于其對COX-2的抑制。本實(shí)驗(yàn)中，中劑量組對大鼠給藥期體重和雌鼠妊娠后體重均有減輕作用，對孕鼠早期胚胎發(fā)育有干擾作用；高劑量組對大鼠給藥期體重和雌鼠妊娠后體重均有減輕作用，對雄性大鼠生育率和雌性大鼠受孕率有降低作用，對孕鼠著床和胚胎形成及發(fā)育有干擾作用。其原因，可能是HB13對COX-2的抑制，從而對雌鼠的生殖過程產(chǎn)生了影響。但暫未見非甾體抗炎藥對雄鼠生殖影響的相關(guān)報(bào)道，其原因有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)在HB13小于20mg/（kg·d）劑量下，對大鼠生殖器官發(fā)育、交配行為、精子和卵子的發(fā)育成熟、受精卵著床前、后丟失率及活胎的生長發(fā)育等均無明顯損害作用；因此在小于20mg/（kg·d）劑量下使用比較安全。

表7 HB13對孕鼠排卵和著床的影響（±s）

表7 HB13對孕鼠排卵和著床的影響（±s）

注:與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 n 黃體數(shù) 著床數(shù) 著床前丟失率（%） 著床后丟失率（%）對照組 24 19.10±3.39 16.00±2.68 15.00±11.31 6.90±8.71低劑量組 20 20.70±2.36 15.40±4.38 24.00±23.71 10.60±11.74中劑量組 20 20.00±4.19 15.00±2.78 22.80±16.70 43.80±34.75**高劑量組 8 18.90±5.33 7.50±4.66** 58.90±27.41** 85.90±18.12**

表8 HB13對孕鼠胚胎的影響（±s）

表8 HB13對孕鼠胚胎的影響（±s）

注:與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 孕鼠數(shù)（n） 死胎數(shù)（只） 吸收胎數(shù) 活胎數(shù) 連胎子宮重（g）對照組24 0 1.10±1.36 14.90±2.76 12.59±2.04低劑量組 20 0 1.40±1.27 14.00±4.21 11.73±3.53中劑量組 20 1 6.60±5.61* 8.40±5.32** 8.09±4.13**高劑量組 8 0 6.10±3.87* 1.40±1.60** 2.23±1.65**

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General reproductive toxicity of HB13 on rats

Gong Xiashi，Zhang Tong，Li Yan，et al.Hubei Center for Safety Evaluation of Drugs，Hubei Pharmaceutical Industry Research Institute Co.Ltd，Wuhan 430061，China

Objective To study the general reproductive toxicity of HB13 in SD rats. Methods SD rats，100 females and 100 males，were divided into low，medium and high dose groups 20，40 and 80mg/（kg·d）and the control group（0.5%CMC-Na），The rats were given HB13 for 28 days in male rats and 14 days in female rats respectively before mating，and then mated.The HB13 treatment continued until the 7th day of pregnancy.When the female rats were confirmed pregnant，the male rats were executed and the female rats were executed on the 14th day of pregnancy.Then we can observe the effect of HB13 on fertility and embryonic development in rats. Results Compared with the control group，the body weight of medium，high dose group reduced significantly，the coefficient of testicular and epididymis，abnormal sperm rate increased significantly.High dose group of HB13 also made the fertility of male rats decline；The body weight，live births uterus weight（including the fetus）of pregnant rats in high and medium group decreased significantly.At the same time，the rate of lost oosperm and absorbed embryo increased.The high dose group of HB13 can also reduce the fertility of female rats. Conclusion The low dose group of HB13 didn't have general reproductive toxicity in rats，the medium dose group impaired early embryonic development，but the high dose group can significantly reduce the fertility of both male and female rats，and can impair the development of embryonic.

HB13；Reproductive toxicity；Rat；Fertility；Embryonic development

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.01.007

2015-07-29）

龔夏實(shí)，E-mail：gxs_530＠sina.com