大黃素聯(lián)合5AzA-cdR對胰腺癌抑癌基因p16、RASSF1A去甲基化作用研究

潘烽平 徐鹿平 陸松春 陳自強 唐堅 褚永權(quán) 陳亮

大黃素聯(lián)合5AzA-cdR對胰腺癌抑癌基因p16、RASSF1A去甲基化作用研究

潘烽平 徐鹿平 陸松春 陳自強 唐堅 褚永權(quán) 陳亮

目的 研究大黃素是否可增強5AzA-cdR對胰腺癌Panc1細(xì)胞抑癌基因p16、RASSF1A的去甲基化作用。方法采用細(xì)胞增殖實驗檢測不同濃度大黃素對Panc1細(xì)胞的生長抑制情況，焦磷酸鹽測序PCR（BSP）分別檢測大黃素、5AzA-cdR及大黃素聯(lián)合5AzA-cdR對Panc1細(xì)胞抑癌基因p16、RASSF1A甲基化狀態(tài)的影響，并用熒光定量PCR（FQ-PCR）和Western blot分別檢測p16、RASSF1A及甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果 大黃素以時間和濃度梯度依賴性抑制Panc1細(xì)胞生長。BSP結(jié)果顯示大黃素具有微弱的去甲基化作用，5AzA-cdR具有一定程度的去甲基化作用，當(dāng)兩者聯(lián)用時，去甲基化作用更加顯著；FQ-PCR和Western blot結(jié)果顯示大黃素與5AzA-cdR聯(lián)用時，p16、RASSF1A的表達(dá)水平均較空白對照明顯增高（均P＜0.05），DNMT1、DNMT3a的表達(dá)水平均較空白對照明顯降低（均P＜0.05）。結(jié)論 大黃素與5AzA-cdR聯(lián)用可通過降低DNMT1和DNMT3a的表達(dá)水平來增強5AzA-cdR對胰腺癌抑癌基因p16、RASSF1A的去甲基化作用。

大黃素 胰腺癌 去甲基化 5AzA-cdR

胰腺癌是具有高度侵襲性的惡性腫瘤，手術(shù)切除和化療是治療的常用方法。然而由于胰腺只有20%的腫瘤在診斷時是可切除的，30%～40%的腫瘤雖局限于胰腺區(qū)域卻不可切除[1]，因此提高化療療效也是目前臨床努力的方向?；虍惓＜谆悄[瘤發(fā)病的重要原因之一，抑癌基因的高甲基化可引發(fā)轉(zhuǎn)錄抑制甚至喪失，癌基因低甲基化可使其異常活躍，表達(dá)失控，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常分化和增殖，發(fā)生癌變[2]。胰腺癌的發(fā)生也涉及到多基因的異常甲基化。現(xiàn)已知，抑癌基因p16、RASSF1A高甲基化可能是胰腺癌發(fā)生的重要原因，這為臨床研究去甲基化藥物抗腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。5AzA-cdR是目前公認(rèn)的具有去甲基化作用的藥物，但其毒副反應(yīng)大，骨髓抑制明顯，臨床應(yīng)用受限；大黃素是具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用的植物型藥物。那么大黃素與5AzA-cdR聯(lián)用是否可增強5AzA-cdR對胰腺癌抑癌基因p16、RASSF1A的去甲基化作用？對此，筆者在實驗室進(jìn)行了研究，以期為胰腺癌臨床化療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 大黃素（純度≥98%）、5AzA-cdR均購于美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購于美國GIBCO公司，細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心株型）購于上海捷瑞生物工程有限公司，EpiTectRBisulfite Kit修飾試劑盒、Anti-RASSF1a抗體、p16/INK4a抗體購于美國EPITOMICS公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系培養(yǎng) 將人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、飽和濕度、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，每2～4 d更換培養(yǎng)基1次，細(xì)胞生長至70%～80%時傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的Panc1細(xì)胞按每孔5×103個/100μl細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，分別用0（空白對照）、10、20、40、80μmol/L濃度的大黃素處理細(xì)胞，分別作用24、48、72 h，每一濃度同時設(shè)5個副孔。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μl的CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)1～2h，分別用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm波長下的吸光度值（OD值）。實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞生長抑制率 [細(xì)胞生長抑制率=（1-各濃度大黃素OD值/空白對照OD值）×100%]。實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)40μmol/L大黃素處理72h后的Panc1細(xì)胞呈現(xiàn)接近50%的生長抑制率，故得出最適大黃素濃度為40μmol/L。

1.2.3 實驗分組及用藥 將上述增殖培養(yǎng)的Panc1細(xì)胞分設(shè)空白對照組（只含0.1%的DMSO）、大黃素組（含大黃素40μmol/L）、5AzA-cdR組（含5AzA-cdR 1μmol/ L）、大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組（含大黃素40μmol/L+ 5AzA-cdR 1μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)72h后進(jìn)行下述檢測。

1.2.4 焦磷酸鹽測序PCR（BSP） 按照細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書的方法分別提取各組細(xì)胞的DNA，取1μg的DNA用于亞硫酸鹽修飾，修飾過程按照EpiTectRBisulfite Kit修飾試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度見表1。25μl反應(yīng)體系包括模板DNA 4μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，引物各1.5μl，DEPC-H2O 5.5μl。反應(yīng)條件為95℃5min，94℃30s，退火溫度見表1所示，45s，72℃45s，共40個循環(huán)，最后72℃10min，10℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳45min，電泳結(jié)束后紫外線拍照，驗證反應(yīng)產(chǎn)物后將其送往上海邁普生物技術(shù)有限公司回收、克隆，隨機挑取10個克隆測序，BiQ Analyzer軟件分析樣品的甲基化情況。

1.2.5 熒光定量PCR（FQ-PCR） 用TRIzol一步法分別提取各組細(xì)胞總的RNA。按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照SYRB Green5μl、上游下游引物（引物序列見表1所示）各1μl、cDNA1μl，用熒光PCR水補足配成10μl的反應(yīng)體系，上機余下擴(kuò)增45個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，應(yīng)用LightCycler 480軟件分析。

表1 反應(yīng)引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

1.2.6 Western blot 使用RIPA裂解液分別提取各組細(xì)胞蛋白，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度后，經(jīng)8%～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，切取不同的目的片段，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉2h，洗膜后分別4℃孵育于不同濃度不同種類的一抗中過夜，洗膜后對應(yīng)孵上不同種屬的辣根酶標(biāo)記山羊二抗90min，之后在發(fā)光液機器中曝光。以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白的灰度值與GAPDH的灰度值比為參考來衡量蛋白的表達(dá)差異，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度大黃素對Panc1細(xì)胞生長抑制率的比較 見圖1。

圖1 不同濃度大黃素對Panc1細(xì)胞生長抑制率的比較

由圖1可見，大黃素以時間和濃度梯度依賴性抑制Panc1細(xì)胞的生長，40μmol/L的大黃素作用Panc1細(xì)胞72h后，生長抑制率為50.6%，接近半數(shù)抑制率。

2.2 4組Panc1細(xì)胞抑癌基因p16、RASSF1A甲基化的比較 見圖2。

圖2 4組Panc1細(xì)胞抑癌基因p16、RASSF1A甲基化的比較（0：空白對照組；E：大黃素組；A：5AzA-cdR組；E+A：大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組；灰色代表甲基化，黑色代表非甲基化）

由圖2可見，p16包含17個CpG島，空白對照組、大黃素組、5AzA-cdR組及大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組甲基化率分別為80.0%、66.5%、51.8%、30.0%；RASSF1A包含36個CpG島，各組甲基化率分別為85.0%、72.7%、60.3%、43.6%。大黃素組、5AzA-cdR組及大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組與空白對照組比較，p16、RASSF1A甲基化水平均下降，5AzA-cdR組及大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組下降最明顯。

2.3 4組Panc1細(xì)胞p16、RASSF1A、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較 見表2、圖3。

表2 4組Panc1細(xì)胞p16、RASSF1A、DNMT mRNA表達(dá)水平的比較

圖3 4組Panc1細(xì)胞p16、RASSF1A、DNMT蛋白表達(dá)水平的比較（0：空白對照組；E：大黃素組；A:5AzA-cdR組；E+A：大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組）

由表2、圖3可見，4組比較，大黃素組、5AzA-cdR組及大黃素聯(lián)合 5AzA-cdR組 Panc1細(xì)胞 p16、RASSF1A mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對照組增高（P＜0.05）；組間兩兩比較，大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組增高最明顯（均P＜0.05）。4組比較，大黃素組、5AzA-cdR組及大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組Panc1細(xì)胞DNMT1、DNMT3a mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對照組下降（P＜0.05）；組間兩兩比較，大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組下降最明顯（均P＜0.05）。

3 討論

表觀遺傳學(xué)改變是在基因的DNA序列未發(fā)生改變的情況下，基因表型發(fā)生可遺傳性變化，DNA甲基化是重要的基因表觀修飾方式之一。DNMT主要有DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 3種，DNMT1對新和成的DNA單鏈行甲基化修飾，將甲基化信息傳遞給子代細(xì)胞，DNMT3a、DNMT3b是胚胎發(fā)育過程中建立起DNA甲基化模式的甲基轉(zhuǎn)移酶，它們參與甲基化的從頭和成[3]。DNMT在腫瘤中表達(dá)增強，導(dǎo)致抑癌基因高甲基化并失活，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生[4]。在腫瘤基因組中，基因啟動子CpG島去甲基化可促進(jìn)抑癌基因的表達(dá)，因此極有可能成為胰腺癌基因治療的新靶點。

p16基因在細(xì)胞周期的調(diào)控中起著重要作用。Peng等[5]認(rèn)為胰腺癌患者中p16基因和APC基因甲基化程度最高。楊衛(wèi)華等[6]對46例人類胰腺癌和癌旁組織中p16基因表達(dá)及其甲基化的水平進(jìn)行分析，胰腺癌中p16蛋白表達(dá)率為41.3%（19/46），而癌旁組織表達(dá)率為95．7%（44/46），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。RASSF1A編碼的蛋白主要作用于Ras蛋白相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能與ras蛋白結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Shimizu等[7]報道，在胰腺癌倉鼠的瘤組織中，RASSF1A表達(dá)明顯少于正常組織。Dammann等[8]對57例胰腺腫瘤進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)64%原發(fā)性胰腺癌、83%胰腺內(nèi)分泌瘤細(xì)胞株RASSF1A啟動子高甲基化。

目前最常用于去甲基化的藥物主要有azacytidine和decitabine兩種核苷類似物[9]，但是其毒副反應(yīng)大，最明顯的是藥物毒性和骨髓抑制，限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此尋找具有特異性好、安全性高、毒副反應(yīng)小的具有去甲基化作用的藥物迫在眉睫。大黃素藥理作用十分廣泛，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等方面的作用。據(jù)本課題組之前相關(guān)報道可知，大黃素、5AzA-cdR對胰腺癌Panc1細(xì)胞具有一定程度的去甲基化作用,且大黃素去甲基化強度弱于5AzA-cdR[10]?；诖?，本課題組大膽猜測若將大黃素、5AzA-cdR聯(lián)合作用于胰腺癌細(xì)胞，其去甲基化作用可能會比兩者單獨作用要強，這也符合目前臨床上治療腫瘤多藥聯(lián)合的原則。

本研究細(xì)胞增殖實驗證實大黃素以時間和濃度梯度抑制胰腺癌細(xì)胞的生長；BSP顯示，與空白對照組比較，大黃素組、5AzA-cdR組以及大黃素聯(lián)合5AzA-cdR組分別作用于Panc1細(xì)胞72h后，大黃素聯(lián)合5AzA-cdR可以明顯的對p16、RASSF1A發(fā)揮一定程度的去甲基化作用，且聯(lián)合用藥強于單一用藥。甲基化常引起抑癌基因的失表達(dá)，并且其表達(dá)量與CpG島甲基化率成反比，低水平的甲基化導(dǎo)致67%～90%抑癌基因失表達(dá)，而CpG島高甲基化率引起抑癌基因的完全失表達(dá)[11]。FQ-PCR與Western blot結(jié)果更進(jìn)一步的證明大黃素聯(lián)合5AzA-cdR用藥可以增強5AzA-cdR對p16、RASSF1A的去甲基化作用。在生物體內(nèi)，催化甲基化反應(yīng)的主要是DNMT1、DNMT3a，使抑癌基因發(fā)生去甲基化的途徑主要是抑制DNMT的活性和減少DNMT的表達(dá)兩種方式。本研究結(jié)果表明大黃素聯(lián)合5AzA-cdR可以明顯減少DNMT1和DNMT3a的表達(dá)，可推測大黃素聯(lián)合5AzA-cdR用藥可以通過減少DNMT1和DNMT3a的表達(dá)來增強5AzA-cdR對p16、RASSF1A的去甲基化作用，其是否可以抑制DNMT的活性，還有待于后續(xù)研究。

綜上所述，本研究BSP證實大黃素聯(lián)合5AzA-cdR可以對p16、RASSF1A發(fā)揮明顯的去甲基化作用，且作用要強于兩藥的單一用藥；FQ-PCR以及Western blot結(jié)果進(jìn)一步說明大黃素增強5AzA-cdR去甲基化作用可能是通過抑制DNMT的表達(dá)來實現(xiàn)，這可為臨床上治療胰腺癌提供理論參考。

[1] Saif M W.Pancreatic neoplasin in 2011:an update[J].JOP,201l,12 (4):316-321.

[2] Miranda T B,Jones P A.DNA methylation:the nuts and bolts of repression[J].J CellPhysiol,2009,213(2):384-390.

[3] Bestor TH.The DNA methyltransferases of mammals[J].Hum Mol, 2000,9(2):2395-2402.

[4] Baylin S B,Herman J G.DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics[J].Trends Genet,2000,16(4):168-174.

[5] Peng D F,Kanai Y,Sawada M,et al.DNA methylation of multiple tumor-related genes in association with overexpression of DNA methyltransferase l(DNMT1)during multistage carcinogenesis of the pancreas[J].Carcinogenesis,2014,27(4):1160-1168．

[6] 楊衛(wèi)華,王春友,朱求實,等.胰腺癌中p16基因甲基化改變及其蛋白表達(dá)分析[J].中國普通外科雜志,2007,16(5):446-450．

[7] Shimizu K,Itsuzaki Y,Fujii H,et al.Reduced expression of the Rassfla gene and its aberant DNA methylation in pancreatic duct adenoeareinomas induced by N-nitrosobis(2-oxopropy1)amine in hamsters[J].MolCarcinog,2008,47(2):80-87．

[8] Dammann R,Schaqdarsurenqin U,Liu L,et al.Frequent RASSF1A promoter hypermethylation and K-ras mutations in pancreatic carcinoma[J].Oncogene,2003,22(3):3806-3812．

[9] Brueckner B,Kuck D,Lyko F.DNAmethyltransferase inhibitors for cancer therapy[J].Cancer J,2013,13(4):17-22.

[10] Zhang H,Chen L,Bu H Q,et al.Effects of emodin on the demethylation of tumor-suppressor genes in pancreatic cancer PANC-1 cells[J].OncolRep,2015,33(6):3015-3023.

[11] Tahiliani,Koh KP,Shen,et al.Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1[J].Science,2009,324(3):930-935.

Emodin enhances 5AzA-cdR-induced demethylation of P16 and RASSF1A genes in pancreatic cancer cells

PAN Fengping，XU Luping，LU Songchun，et al.Department of General Surgery,Jiaxing First Municipal Hospital,Jiaxing 314000,China

Objective To investigate the effects of emodin on 5AzA-cdR-induced demethylation of tumor suppressor genes P16 and RASSF1A in pancreatic cancer cells. Methods Cultured pancreatic cancer Panc1 cells were treated with emodin,5AzA-cdR or emodin plus 5AzA-cdR,respectively.Cell proliferation was determined by CCK-8 kit;methylation of p16 and RASSF1A genes in Panc1 cells was detected by BSP method.The mRNA and protein expressions of p16,RASSF1A and methyltransferase DNMT1 and DNMT3a in Panc1 cells were examined by FQ-PCR and Western blot,respectively. Results Emodin inhibited the growth of pancreatic cancer Panc1 cells in a dose-and time-dependent manner.BSP results showed that the demethylation effect of emodin was weak,5AzA-cdR had a moderate effect on demethylation,while the demethylation of emodin combined with 5AzA-cdR was more significant.FQ-PCR and WB confirmed that the expression of P16 and RASSF1A increased(P＜0.05)and the expression of DNMT1 and DNMT3a decrease in combination group compared to control group(P＜0.05).Conclusion Emodin combined with 5AzA-cdR can enhance the 5AzA-cdR-induced demethylation of P16 and RASSF1A genes in pancreatic cancer cells though down-regulating the expression of methyltransferase DNMT1 and DNMT3a.

Emodin Pancreatic cancerDemethylation 5AzA-cdR

2015-09-09）

（本文編輯：李媚）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2016KYB286）

314000 嘉興市第一醫(yī)院普外科（嘉興市醫(yī)學(xué)重點學(xué)科）

陳亮，E-mail：542393023@qq.com