早期自然流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14的表達(dá)及其臨床意義

陳秋月 鄒阮敏 薛向陽(yáng) 楊蒙蒙 肖碧如 孫蓉蓉 張文淼

早期自然流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14的表達(dá)及其臨床意義

陳秋月 鄒阮敏 薛向陽(yáng) 楊蒙蒙 肖碧如 孫蓉蓉 張文淼

目的 研究正常早孕婦女和早期自然流產(chǎn)婦女之間絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14的表達(dá)情況，探討其表達(dá)的臨床意義。方法 選取33例正常早孕婦女絨毛組織和37例早期自然流產(chǎn)婦女絨毛組織，HE染色后光鏡下觀察兩組絨毛組織的形態(tài)學(xué)變化；采用免疫組化SP三步法檢測(cè)兩組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14的表達(dá)。結(jié)果 HE染色下兩組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)對(duì)比，見早期自然流產(chǎn)組絨毛組織滋養(yǎng)細(xì)胞層變薄、滋養(yǎng)細(xì)胞變性甚至壞死、滋養(yǎng)細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)、絨毛間質(zhì)水腫壞死；免疫組化示正常早孕組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞CXCL14的表達(dá)量為0.07±0.05，自然流產(chǎn)組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞CXCL14的表達(dá)量為0.12±0.02，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；首次流產(chǎn)組CXCL14表達(dá)量0.116±0.067，多次流產(chǎn)組CXCL14表達(dá)量0.086±0.127，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。結(jié)論 早期自然流產(chǎn)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14表達(dá)升高，可能在自然流產(chǎn)的發(fā)生中起著重要作用。

CXCL14 絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞 自然流產(chǎn)

自然流產(chǎn)是指妊娠＜28周，胎兒體重＜1 000g，胚胎或胎兒因各種原因而導(dǎo)致妊娠終止,其中孕12周前的自然流產(chǎn)稱之為早期流產(chǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)趨化因子可參與各種生殖過程，如對(duì)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞具有促分裂、促分化作用，它的異?？膳c復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、癌癥等有關(guān)[1]。CXCL14是被發(fā)現(xiàn)較晚的CXC型趨化因子，在免疫細(xì)胞趨化、腫瘤發(fā)生等中都起著重要的調(diào)控作用[2-3]。CXCL14在多種正常組織中有表達(dá)，而在多種腫瘤組織中失表達(dá)。正常妊娠過程中絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞具有類似腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，Kuang等[4]認(rèn)為CXCL14在妊娠期具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲作用，也有人認(rèn)為CXCL14能抑制妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤(rùn)[15]?，F(xiàn)我們對(duì)早期自然流產(chǎn)組織中CXCL14的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2013年10月我院婦科門診收治的70例早期妊娠終止患者作為研究對(duì)象，患者均知情同意。自然流產(chǎn)組37例，年齡23～36（29.4±5.32）歲，孕周6～10（8.60±1.26）周，流產(chǎn)次數(shù)1～4（2±1.73）次，本次妊娠胚胎停育或保胎失敗，且流產(chǎn)前超聲檢查提示胚胎發(fā)育停止、無(wú)胎心搏動(dòng)后，行吸宮術(shù)結(jié)束妊娠。對(duì)照組33例，年齡23～37（32±4.70）歲，孕周6～9（7.30±0.54）周，流產(chǎn)次數(shù)1～3（2±0.82）次，B超檢查證實(shí)胚胎發(fā)育正常，見胚芽和胎心搏動(dòng)，本次妊娠期間無(wú)陰道流血、腹痛等癥狀和體征，行吸宮術(shù)結(jié)束妊娠。以上兩組均排除心臟病、糖尿病、腎病、肝炎等內(nèi)科合并癥及傳染性生殖器感染疾病、生殖道畸形，無(wú)吸煙和長(zhǎng)期服藥史。兩組妊娠婦女年齡、孕周、流產(chǎn)次數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 吸宮術(shù)中取材適量絨毛組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗后在10%中性甲醛溶液內(nèi)固定。

1.2.2 HE染色 絨毛組織石蠟切片行常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察兩組絨毛組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 免疫組化SP三步法檢測(cè) 固定后的絨毛組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4μm，二甲苯脫蠟至蒸餾水；3%H2O2：清除內(nèi)源性過氧化物酶10min；PBS洗滌3次；檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行高壓修復(fù)1.5 min；自然冷卻至室溫后，PBS（0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）洗滌3次；羊血清封閉2h；加入Ⅰ抗（Ⅰ抗CXCL14特異性兔抗人多克隆抗體固定液購(gòu)于Abcan公司），4℃過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗37℃，孵育30 min；二甲苯氨DAB顯色（兔Ⅱ抗、羊血清封閉液和DAB顯色液購(gòu)置于北京中杉金橋生物公司）。蘇木素復(fù)染、分化、透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化結(jié)果判讀 鏡下絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，CXCL14定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕色為陽(yáng)性表達(dá)。用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計(jì)算平均吸光度值（MOD值），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每張切片（×200）同一方向隨機(jī)取5個(gè)不重疊的視野，分別測(cè)定每視野的陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，測(cè)得計(jì)量資料采用表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色后兩組絨毛組織的形態(tài)學(xué)變化 見圖1。

圖1 H E染色后兩組絨毛組織的形態(tài)學(xué)變化（A：對(duì)照組；B：自然流產(chǎn)組；H E染色，×400）

由圖1可見，與對(duì)照組比較，早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織的滋養(yǎng)層變薄、滋細(xì)胞變性甚至壞死、滋養(yǎng)細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)、絨毛間質(zhì)水腫壞死。

2.2 兩組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14的表達(dá) 兩組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞層均存在CXCL14的陽(yáng)性表達(dá)，但自然流產(chǎn)組表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性、棕色染色較深，而對(duì)照組表達(dá)稍弱、染色淡（圖2）；CXCL14在自然流產(chǎn)組絨毛組織的表達(dá)水平（MOD值為0.12±0.02）高于正常組（MOD值為0.07±0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.605，P＜0.01）。

圖2 兩組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14的表達(dá)（A：對(duì)照組；B：自然流產(chǎn)組；DAB染色，×200）

2.3 首次流產(chǎn)和多流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCL14蛋白表達(dá)比較 將70例患者據(jù)流產(chǎn)次數(shù)多少分為首次與多次流產(chǎn)兩組，多次流產(chǎn)組絨毛組織的表達(dá)水平（MOD值為0.086±0.127）低于首次流產(chǎn)組（MOD值為0.116±0.067），差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.253，P＞0.01）。

3 討論

自然流產(chǎn)是產(chǎn)科常見的病理妊娠，臨床上有10%～15%的妊娠以自然流產(chǎn)告終，其病因復(fù)雜，有50%～70%未找到明確的原因[5]。自然流產(chǎn)率在近年來升高，特別是早期自然流產(chǎn)，病因多雜不明確。妊娠由多種因素精密復(fù)雜地調(diào)控著，被認(rèn)為是一種假惡性過程[6]，其中，母體內(nèi)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞被視為一種具有特殊功能細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞入侵子宮壁使胚胎定植，并進(jìn)一步重塑子宮螺旋動(dòng)脈，形成必要的高容低阻力的血管以確保足夠的血液供應(yīng)最佳的胎兒生長(zhǎng)[7]。另外，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞在胎盤形成與發(fā)育過程中表現(xiàn)為增殖、浸潤(rùn)、血管擴(kuò)散等類似腫瘤細(xì)胞功能特性，但又與腫瘤細(xì)胞不同的是，滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的發(fā)揮只作用在妊娠早期且部位只限于子宮，受時(shí)間和空間上的精密調(diào)控。如果絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)侵襲、增殖等能力降低，都會(huì)影響胎盤的發(fā)育形成及功能，導(dǎo)致病理妊娠發(fā)生。

現(xiàn)大多學(xué)者認(rèn)為，胚胎相對(duì)母體而言為一種同種異體抗原，因此成功的妊娠能否維持，與母體的免疫耐受情況密切相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)母胎免疫的調(diào)節(jié)及滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和分化作用有母胎界面存在的多種多樣的趨化因子及其受體參與作用。CXCL14又稱BRAK、BMAC和MIP-2r，是CXC趨化因子家族的一員，最初于1999年由Hormas等[8]從人乳腺和腎臟組織中分離出來，5q31為其染色體定位，其受體目前尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)CXCL14不僅能抑制新生血管生成，還有趨化NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等作用[9－10]。有學(xué)者認(rèn)為在不同的病理生理?xiàng)l件下，CXCL14可能表現(xiàn)為不同的功能狀態(tài)，如在人體，CXCL14除了淋巴組織表達(dá)缺失，在其他許多正常組織，如胎盤，子宮頸和子宮可檢測(cè)到CXCL14高表達(dá)[8，11]，而在多種腫瘤組織中CXCL14呈低表達(dá)或者表達(dá)缺失[12]。在生殖免疫方面，CXCL14在母胎界面的表達(dá)具有孕周及部位差異[13]，且CXCL14能特異地與滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合[4]，提示在母胎界面，滋養(yǎng)層細(xì)胞可能是CXCL14的靶細(xì)胞。故我們推測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞上CXCL14表達(dá)異?？赡芘c自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

在本研究中，先行HE染色觀察正常早孕絨毛組織與自然流產(chǎn)者絨毛組織形態(tài)學(xué)差異，正常早孕絨毛組織外層的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞間界限不清，胞質(zhì)嗜酸性較強(qiáng)，細(xì)胞核深而粗，內(nèi)層的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞界限清楚，胞質(zhì)透明、嗜堿性較弱，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，并可見小血管布于絨毛間質(zhì)中。相比之下早期自然流產(chǎn)組的絨毛組織滋養(yǎng)層變薄，滋養(yǎng)細(xì)胞總體上嗜酸性增強(qiáng)，內(nèi)層細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞變性甚至壞死，且絨毛間質(zhì)無(wú)血管呈水腫壞死。另外，胎盤對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、激素的分泌、細(xì)胞因子和免疫抗體等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)需要絨毛組織的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)揮作用，因此它是絨毛組織的功能層。而細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞是合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的前體細(xì)胞，是未成熟細(xì)胞，它能不斷的增殖、分裂及凋亡，通過分泌HCG來實(shí)現(xiàn)胎盤的內(nèi)分泌功能，并參與遷移滋養(yǎng)層細(xì)胞及調(diào)節(jié)胎盤生長(zhǎng)。絨毛組織的另一組成部分，絨毛間質(zhì)，能對(duì)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、激活通路等來支持其功能的發(fā)揮。因此，絨毛組織在各種因素影響下出現(xiàn)異常都將影響妊娠的正常進(jìn)行。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)CXCL14在月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜中后期分泌期表達(dá)上調(diào)，這與胚胎植入的預(yù)計(jì)時(shí)間是一致的[14]。CXCL14能選擇性地表達(dá)于妊娠早期的胚胎著床部位，故行進(jìn)一步的免疫組化顯示，CXCL14在正常早孕組及自然流產(chǎn)組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)重組的CXCL14能并通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）來抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的粘附和增殖，而CXCL14抗體卻起了相反的作用[15]，本實(shí)驗(yàn)中觀察自然流產(chǎn)組的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞從DAB染色后CXCL14較正常早孕組深，通過IPP軟件對(duì)兩組絨毛組織上CXCL14的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果示自然流產(chǎn)組及正常早孕組的平均吸光度值分別為0.12±0.02和0.07±0.05，統(tǒng)計(jì)分析P＜0．01，表明在自然流產(chǎn)組的絨毛組織上CXCL14的表達(dá)水平高于正常早孕組。故推測(cè)CXCL14表達(dá)增高可能會(huì)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的功能和胚胎的植入發(fā)育，影響正常妊娠的進(jìn)行。最后，提出流產(chǎn)次數(shù)多少與CXCL14表達(dá)量是否存在差異，故以首次流產(chǎn)和多次流產(chǎn)作為分組依據(jù)，結(jié)果示首次流產(chǎn)組CXCL14平均吸光度值為0.116± 0.067，多次流產(chǎn)組平均吸光度值為0.086±0.127，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．01）。

綜上所述，妊娠是一個(gè)極為復(fù)雜的生理過程，趨化因子CXCL14在妊娠方面的研究也越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。CXCL14已經(jīng)明確在母胎界面有表達(dá)，在本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果示CXCL14在自然流產(chǎn)組中的表達(dá)高于高于對(duì)照組，我們推測(cè)它的表達(dá)增高可能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的功能，與自然流產(chǎn)的發(fā)生可能有關(guān)。但CXCL14與早期自然流產(chǎn)是否存在確切相關(guān)性，則需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Association between expression of CXCL14 in villi trophoblasts and early spontaneous abortions

CHEN Qiuyue,ZOU Ruanmin,XUE Xiangyang，et al.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China

Objective To investigate the association of expression of cxcl14 in villi trophoblasts with early spontaneous abortion. Methods Villi tissue samples were collected from 37 cases with early spontaneous abortion and 33 cases with normal early pregnancy.The Histopathology of viilli tissue was examined with HE staining.The expression of CXCL14 in villi trophoblasts was detected by immunohistochemical SP method. Results HE staining showed that in early spontaneous abortion samples,the layers of villous trophoblasts became thinner,trophoblastic degeneration or necrosis was observed,eosinophilic staining in trophoblasts was enhanced,and interstitial tissue of villi presented edema and necrosis.Immunohistochemistry showed the expression value of CXCL14 in trophoblasts of abortion group was higher than that of normal group (0.12±0.02 vs 0.07±0.05, P＜0.05).The expression value of CXCL14 in patients with abortion≥2 times and in those＜2 time were 0.086±0.127 and 0.116± 0.067,respectively(P＞0.05). Conclusion The higher expression of CXCL14 in villi trophoblasts may be associated with early spontaneous abortions．

CXCL14 VillitrophoblastSpontaneous abortion

2015-02-06）

（本文編輯：沈昱平）

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科（陳秋月、鄒阮敏、楊蒙蒙、肖碧如、孫蓉蓉、張文淼）；溫州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室（薛向陽(yáng)）

張文淼，E-m ai l：zhw m 63@126.com