腰椎間盤突出癥活血化瘀治療的目標蛋白篩選及鑒定

關(guān) 鵬，尹利軍，許建文，韋家鼎，李智斐，邰志洪，桂裕昌，韋玉蘭

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·論著·

腰椎間盤突出癥活血化瘀治療的目標蛋白篩選及鑒定

關(guān) 鵬，尹利軍，許建文，韋家鼎，李智斐，邰志洪，桂裕昌，韋玉蘭

背景 活血化瘀屬于中醫(yī)藥特色療法，也是臨床上非手術(shù)治療腰椎間盤突出癥(LIDP)療效優(yōu)良的主要方法之一，既往有學者從病理、影像、免疫及基因等角度開展了大量研究，但有關(guān)活血化瘀治療LIDP機制仍未明了。目的 通過同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)結(jié)合液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)篩選和鑒定LIDP活血化瘀治療前后差異表達蛋白，篩選LIDP活血化瘀治療的目標蛋白。方法 選取2013年7月—2014年12月于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院治療的血瘀證LIDP患者30例為研究對象，予活血化瘀治療4周，觀察患者臨床療效。分別于治療前后提取患者外周血血清，通過去除高豐度蛋白、測定蛋白濃度、酶解蛋白、肽段iTRAQ標記、高效液相色譜分離、LC-MS/MS分析等程序和方法，篩選及鑒定治療前后的差異表達蛋白。結(jié)合基因本體論注釋及KEGG通路分析相關(guān)生物信息學，對差異蛋白的功能和代謝通路進行分析。結(jié)果 治療后臨床控制19例，顯效8例，有效2例，無效1例，總有效率為96.7%(29/30)。iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS鑒定到300個蛋白質(zhì)組，其中209個蛋白各通道標記標簽均有定量信息，篩選出20個差異表達蛋白，其中呈上調(diào)表達及下調(diào)表達的差異蛋白各10個。本研究對20個差異蛋白的KEGG富集結(jié)果顯示，9個差異蛋白富集到27條信號通路。補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)富集到3個差異蛋白，PPAR信號通路、百日咳、美洲錐蟲病、金黃色葡萄球菌感染及系統(tǒng)性紅斑狼瘡富集到2個差異蛋白。百日咳、美洲錐蟲病、金黃色葡萄球菌感染及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等11條信號通路富集到補體C3，PI3K-Akt信號通路、黏著斑、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)等9條信號通路富集到纖維連接蛋白1。結(jié)論 活血化瘀治療血瘀證LIDP效果顯著；載脂蛋白A1、載脂蛋白M、載脂蛋白C3、纖維連接蛋白1及補體C3很可能是血瘀證LIDP選用活血化瘀治療的潛在血清靶蛋白。

椎間盤移位；證型；活血祛瘀劑；蛋白質(zhì)組學

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腰椎間盤突出癥(LIDP)是骨科常見病，其發(fā)病率占脊柱疾病的首位，發(fā)病人群以青壯年為主，臨床85%以上的患者通過非手術(shù)治療可達臨床控制乃至痊愈[1-2]。中醫(yī)藥療法是其非手術(shù)治療與康復(fù)的主要方法之一，但在同一中醫(yī)辨證標準之下，辨證結(jié)果因人而異的情況比較常見，論治的方案既難于統(tǒng)一也影響推廣。本文篩選LIDP最常見的中醫(yī)證型血瘀證患者30例，予活血化瘀治療，于治療前后采集患者外周靜脈血，采用同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)，聯(lián)合同位素標簽和液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)，篩選和鑒定治療前后患者血清中的差異表達蛋白，經(jīng)過生物信息學分析，對活血化瘀治療LIDP的目標蛋白進行篩選和鑒定，取得較好結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 病例納入與排除標準 納入標準：(1)根據(jù)患者臨床癥狀并結(jié)合體征、影像學檢查，符合LIDP的診斷標準，且中醫(yī)辨證為血瘀證[3-7]；(2)年齡19～58歲；(3)自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并肝、腎、心腦血管、呼吸系統(tǒng)疾病或精神疾?。?2)合并血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、腫瘤等；(3)拒絕參與本研究。

1.2 研究對象 選取2013年7月—2014年12月于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院治療的血瘀證LIDP患者30例為研究對象，其中男16例，女14例；平均年齡(41.2±10.9)歲；腰痛并下肢放射性疼痛24例，僅腰臀部疼痛6例；影像學檢查示L4/5椎間盤突出11例；L5/S1椎間盤突出14例，兩個及以上節(jié)段椎間盤突出5例。

1.3 治療及效果評價

1.3.1 治療方案 (1)辨證活血化瘀中藥煎劑內(nèi)服，1付/d，早晚分2次口服；(2)活血化瘀外用中藥制劑痛區(qū)燙療，2次/d；(3)靜脈注射活血化瘀通絡(luò)中藥針劑；(4)循經(jīng)活血通絡(luò)推拿手法治療,1次/d；(5)骨盆電動牽引，牽引質(zhì)量30～50 kg，30 min/次，1次/d?？偗煶?周，治療期間患者適當臥床休息，堅持腰背肌功能鍛煉，對癥處理可能出現(xiàn)的并發(fā)癥，并予健康教育指導(dǎo)，必要時予心理疏導(dǎo)。出院后按健康教育指導(dǎo)方案繼續(xù)進行適當?shù)墓δ苠憻?、調(diào)整生活及飲食習慣。

1.3.2 效果評價 (1)患者一般情況：治療期間密切觀測患者血壓、心率及胸悶等情況，有效預(yù)防因過度功能鍛煉、不適當牽引等引發(fā)的異常。(2)腰腿痛程度：于治療前及治療后采用視覺模擬評分法(visual analogue scale,VAS)評估腰腿痛程度，由患者記錄，或患者提供數(shù)據(jù)由研究者記錄，分數(shù)越高，表示疼痛越嚴重。(3)療效評價：根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局批準的行業(yè)標準及有關(guān)LIDP療效標準[5-7]，并參照日本骨科學會(JOA)腰椎疾病療效評判標準委員會制定的腰椎疾患療效評定基本方案(29分制)給予評價，改善率=〔(治療后評分-治療前評分)/(29-治療前評分)〕×100%。臨床控制：改善率≥75%，腰腿痛及相關(guān)癥狀消失，直腿抬高試驗陰性，恢復(fù)正常工作；顯效：改善率50%～<75%，腰腿痛及相關(guān)癥狀基本消失，直腿抬高試驗陰性，基本恢復(fù)正常工作；有效：改善率25%～<50%，腰腿痛及相關(guān)癥狀減輕，直腿抬高試驗可疑陽性，部分恢復(fù)工作，但停藥后復(fù)發(fā)；無效：改善率<25%，腰腿痛及相關(guān)癥狀體征無改善，直腿抬高試驗陽性，或加重。

1.4 蛋白組學分析[8-11]

1.4.1 主要儀器及試劑 Q-Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan，美國)、AKTA Purifier 100純化儀(GE Healthcare，美國)、低溫高速離心機(Eppendorf5430R，德國)、600V電泳儀(GE Healthcare EPS601，美國)、Agilent 1200液相色譜儀(Agilent，美國)；溴酚藍(161-0404)購于生工生物工程(上海)股份有限公司，十二烷基硫酸鈉(SDS，161-0302)、尿素(Urea，161-0731)、二羥甲基氨基甲烷(Tris，161-0719)、二硫蘇糖醇(DTT，161-0404)、吲哚-3-乙酸(IAA，163-2109)均購于美國Bio-Rad公司，碳酸氫銨(NH4HCO3，A6141，美國Sigma公司)。

根據(jù)上述結(jié)論，給出以下建議：（1）不僅要促進中間品進口貿(mào)易，還要繼續(xù)增加進口中間產(chǎn)品品種類型的多樣性，尤其注重從發(fā)達國家的進口，提高我國制造業(yè)的自主創(chuàng)新意愿并提升企業(yè)的創(chuàng)新能力；（2）從高質(zhì)量進口中間品的技術(shù)溢出效應(yīng)出發(fā)，采用不同的政策措施擴大企業(yè)創(chuàng)新集約邊際，縮小企業(yè)的創(chuàng)新成本，進而確保企業(yè)創(chuàng)新成功轉(zhuǎn)化率的提升。

1.4.2 采集血樣并提取血清蛋白 治療前后采集清晨空腹外周靜脈血2 ml，冰盒取回后4 ℃冰箱靜置2～3 h待血液凝固。低溫下以3 500 r/min離心10 min(離心半徑為9.3 cm)，吸取上清液分裝，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 篩選和鑒定目標蛋白 (1)蛋白iTRAQ標記：取等量血清蛋白，經(jīng)去除高豐度蛋白、Bradford法蛋白濃度測定、聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白酶解和肽段定量等步驟后，取等量混合為內(nèi)參，并取等量肽段約100 μg，根據(jù)AB公司提供的iTRAQ(AB SCIEX)試劑盒說明書要求進行標記，標記試劑114用于標記治療前，標記試劑115用于標記治療后，標記試劑116用于標記內(nèi)參，均重復(fù)iTRAQ標記兩次。(2)蛋白定量分析和鑒定：采用納升流速高效液相系統(tǒng)EASY-nLC將樣品進行高效液相色譜分離，再經(jīng)Q-Exactive質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析及鑒定，一級質(zhì)譜分辨率為70 000(質(zhì)荷比200)，多肽和多肽碎片質(zhì)荷比采集方法為每次采集10個碎片圖譜(MS2 scan)進行全掃描；二級質(zhì)譜分辨率為17 500(質(zhì)荷比200)。質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，將肽段報告離子峰強度值采用Proteome Discovere 1.4軟件進行定量分析，通過Proteome Discovere 1.4將RAW文件提交至Mascot 2.2服務(wù)器，結(jié)果按誤判率≤0.01進行篩選及過濾。

1.4.4 生物信息學分析 依據(jù)治療后/治療前蛋白比值>1.40或<0.60選取差異蛋白，其中比值>1.40表示表達上調(diào)，比值<0.60表示表達下調(diào)，分析Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中生物信息的分布狀況，將蛋白功能用Cluster軟件進行注釋。對差異蛋白基于KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路注釋，獲取差異蛋白基因參與的所有信號通路，每個信號通路的水平運用Fisher確切概率法進行檢驗，校正假設(shè)檢驗結(jié)果獲得誤判率，篩選出差異蛋白顯著參與的信號通路(P<0.05)。

1.5 質(zhì)量控制 (1)選取患者均嚴格按照納入、排除標準；(2)充分考慮患者年齡、營養(yǎng)狀況、藥物和治療等多因素的影響；(3)確保儀器及使用條件的一致性，以避免或降低其對結(jié)果所造成的誤差，所用試管、離心管、試劑等購自同一廠家，并為同一批商品，并經(jīng)過相同條件嚴格消毒；(4)血樣從采集到離心、分裝的時間均在規(guī)定時間內(nèi)，避免因凝固時間不同而產(chǎn)生的影響，采取低溫運送血樣，保存過程防止反復(fù)凍融；(5)優(yōu)化高效液相色譜分離以及質(zhì)譜檢測的條件，以確保所產(chǎn)生蛋白質(zhì)譜的質(zhì)量；(6)保持操作的一致性，操作過程嚴格按操作規(guī)程進行；(7)統(tǒng)一培訓(xùn)研究人員。

2 結(jié)果

2.1 效果評價 治療期間，無患者失訪及脫落，無不良事件發(fā)生。治療前后疼痛VAS分別為(4.8±1.3)、(2.0±1.0)分，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.077,P<0.01)；治療前后JOA評分分別為(13.3±2.6)、(23.4±4.6)分，差異有統(tǒng)計學意義(t=-10.676,P<0.01)；治療后臨床控制19例，顯效8例，有效2例，無效1例，總有效率為96.7%(29/30)。

表1 血瘀證LIDP患者治療后表達上調(diào)的蛋白

表2 血瘀證LIDP患者治療后表達下調(diào)的蛋白

2.3 生物信息學分析 本研究對20個差異蛋白進行KEGG富集結(jié)果顯示，9個差異蛋白富集到27條信號通路。補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)富集到3個差異蛋白，PPAR信號通路、百日咳、美洲錐蟲病、金黃色葡萄球菌感染及系統(tǒng)性紅斑狼瘡富集到2個差異蛋白。百日咳、美洲錐蟲病、金黃色葡萄球菌感染及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等11條信號通路富集到補體C3，PI3K-Akt信號通路、黏著斑、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)等9條信號通路富集到纖維連接蛋白1(見表3)。

3 討論

LIDP為因創(chuàng)傷、勞損、退變等原因引發(fā)椎間盤變性、纖維環(huán)完全或部分破裂致髓核膨出、突出乃至游離，壓迫或刺激神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)、血管等引起腰痛和/或下肢放射性疼痛、麻木、無力等臨床癥狀的疾病。LIDP是骨科常見病、多發(fā)病，通常反復(fù)發(fā)作、遷延時長，且發(fā)病群體日趨年輕化。LIDP常規(guī)的治療方法包括非手術(shù)療法、手術(shù)治療及介于兩者之間的經(jīng)皮穿刺切吸技術(shù)等。神經(jīng)損害持續(xù)加重、大小便障礙是手術(shù)治療LIDP的絕對適應(yīng)證，手術(shù)切除突出的椎間盤、擴大神經(jīng)根管從而解除腰神經(jīng)根及馬尾神經(jīng)壓迫的機制明確。但臨床上診斷為LIDP的患者僅10%～20%需行手術(shù)治療[1]。故有學者報道非手術(shù)療法仍為該病目前最基本的治療方法，且LIDP是自愈性疾病，絕大多數(shù)患者可經(jīng)非手術(shù)治療得到緩解、改善或臨床痊愈[12-13]。

LIDP的西醫(yī)分型通常按突出部位分為側(cè)突型、中央型，或按發(fā)生進程分為膨出型、突出型、破裂型、游離型等。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學大多按血瘀(氣滯)證、寒濕證、肝腎虧虛證、濕熱證等辨證施治。文獻研究顯示，血瘀證LIDP更多見，且其影像學表現(xiàn)與其他證型不同[14-16]。大量臨床研究報道，活血化瘀治療LIDP的療效確切，但其作用機制未明[17-20]，有待深入研究。本研究顯示，血瘀證LIDP患者經(jīng)活血化瘀治療后，患者腰腿痛減輕，疼痛VAS較治療前下降，JOA評分較治療前升高，總有效率達96.7%，說明本研究中運用活血化瘀治療血瘀證LIDP是對癥的。

表3 治療前后表達差異蛋白參與的信號通路

蛋白組學可跨越基因組和臨床應(yīng)用之間的鴻溝，通常以1個細胞或組織的基因組所表達全部蛋白為研究內(nèi)容，這一特點與中醫(yī)的辨證論治類似，尋求蛋白靶點和中醫(yī)辨證的目的均是針對臨床個性化治療[21-22]。整體觀念、辨證論治是中醫(yī)學的特點及核心，而辨證論治的核心是證，開展辨證論治與蛋白組學相關(guān)研究，則有可能跨越單純的實體結(jié)構(gòu)或功能模擬研究的局限性，為證實質(zhì)方面研究開辟新途徑，從而實現(xiàn)微觀與整體有效對接[23-24]。日本學者利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對血瘀證LIDP患者的血漿進行蛋白組學分析，結(jié)果檢測到患者所特有的質(zhì)譜峰，在采用活血祛瘀方劑桂枝茯苓丸治療后，隨著血瘀的改善，質(zhì)譜峰也出現(xiàn)變化，提示使用該蛋白芯片系統(tǒng)篩選血瘀及疾病標志物可診斷血瘀[25]。而更新的iTRAQ技術(shù)則可同時對4種或8種標本進行相對和絕對定量研究，其重復(fù)性好，能夠利用同位素標記的方法準確掌握差異蛋白的動態(tài)變化，更適用于低豐度蛋白研究[26]。iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS具有自動化、高敏感、多元化的特點，適用于檢測各種酸堿度、離子強度、分子量不同的蛋白，特別適用于不同樣本的蛋白的篩選[27]。

本研究應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS篩選經(jīng)活血化瘀治療血瘀癥LIDP患者的差異蛋白，共篩選到與活血化瘀法治療血瘀證LIDP相關(guān)的差異蛋白209個，選取治療后與治療前蛋白比值>1.40或<0.60為顯著差異蛋白重點研究，共得到差異蛋白20個，其中上調(diào)及下調(diào)表達蛋白各10個，涉及轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白、細胞生長分化相關(guān)蛋白、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤相關(guān)蛋白等。載脂蛋白M是血液中主要與高密度脂蛋白結(jié)合的一類蛋白，功能上能夠促進高密度脂蛋白的生成，如膽固醇逆轉(zhuǎn)運、抗炎以及抗氧化等。載脂蛋白A1是載脂蛋白A族最多的一種組分，也是高密度脂蛋白中的主要載脂蛋白，其能夠激活卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，并識別高密度脂蛋白受體，在膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。載脂蛋白C3為脂蛋白脂酶(LPL)抑制劑，主要經(jīng)過抑制脂肪酶、肝脂酶的活性來影響脂代謝，在調(diào)節(jié)脂代謝過程中具有十分重要的作用。載脂蛋白C3與血管內(nèi)皮細胞受損有關(guān)，而血管內(nèi)皮細胞受損與血瘀證相關(guān)。研究顯示，載脂蛋白A1在冠心病、糖尿病血瘀證患者血清中表達下調(diào)，而載脂蛋白C3在冠心病、糖尿病及高血壓等患者血清中均呈高表達，提示冠心病血瘀證相關(guān)蛋白主要作用于炎性反應(yīng)和脂質(zhì)代謝，脂質(zhì)代謝紊亂與糖尿病血瘀證相關(guān)[28-30]。補體C3是血清中補體水平最高的一種炎性因子，具有調(diào)節(jié)免疫功能和抗感染的作用。纖維連接蛋白1是一種重要的細胞外基質(zhì)，參與細胞重建、黏附及遷移過程，還可調(diào)動肌動蛋白聚合來調(diào)節(jié)細胞運動。

本研究對20個差異蛋白的KEGG富集結(jié)果顯示，9個差異蛋白富集到27條信號通路；差異蛋白涉及的主要信號通路包括轉(zhuǎn)運相關(guān)、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)、細胞生長分化相關(guān)等。補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)富集到3個差異蛋白，PPAR信號通路、百日咳、美洲錐蟲病、金黃色葡萄球菌感染及系統(tǒng)性紅斑狼瘡富集到2個差異蛋白。百日咳、美洲錐蟲病、金黃色葡萄球菌感染及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等11條信號通路均富集到補體C3，推測補體C3在血瘀證LIDP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。另外，PI3K-Akt信號通路、黏著斑、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)等9條信號通路富集到纖維連接蛋白1，提示纖維連接蛋白1在活血化瘀治療血瘀證LIDP中發(fā)揮特殊作用。載脂蛋白M、載脂蛋白A1、載脂蛋白C3均為血瘀證LIDP患者治療前后的差異表達蛋白，可能是潛在的生物標志物?；谕犯患治?，載脂蛋白A1和載脂蛋白C3進一步被注釋到PPAR信號通路中。馮仲鍇等[31]研究報道，黃芪甲苷可能通過激活PPAR信號通路促進LIDP髓核細胞的增殖和存活，說明LIDP與PPAR信號通路具有一定相關(guān)性，載脂蛋白A1和載脂蛋白C3可能為活血化瘀治療血瘀證LIDP患者潛在的血清標志物。在本研究中，載脂蛋白M雖未被注釋到信號通路中，但本研究發(fā)現(xiàn)血瘀證LIDP患者經(jīng)活血化瘀治療后載脂蛋白M表達上調(diào)。謝沛根等[32]通過雙向電泳及對差異蛋白質(zhì)譜鑒定、酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測結(jié)果顯示，載脂蛋白L1、載脂蛋白M、免疫球蛋白輕鏈及四連接素可作為LIDP的血清生物標志物。所以，筆者推測載脂蛋白M可能也是活血化瘀治療血瘀證LIDP的潛在血清生物標志物。

綜上所述，經(jīng)生物信息學等綜合分析顯示，載脂蛋白A1、載脂蛋白M、載脂蛋白C3、纖維連接蛋白1、補體C3可能為活血化瘀治療血瘀證LIDP潛在的血清標志物。本研究納入樣本量偏少，相關(guān)材料與數(shù)據(jù)主要為同組患者治療前后自身對照，故有一定的局限性，下一步研究將增加樣本量、設(shè)立對照組，以進一步驗證本研究結(jié)論。

作者貢獻：關(guān)鵬負責資料收集整理、統(tǒng)計學處理、成文；尹利軍、韋家鼎、李智斐、邰志洪、桂裕昌、韋玉蘭協(xié)助課題實施、資料收集整理；許建文進行課題設(shè)計與評估、質(zhì)量控制，并對文章負責。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Screening and Identifying the Target Protein of Blood Activating and Stasis Removing for Lumbar Intervertebral Disk Protrusion

GUANPeng,YINLi-jun,XUJian-wen,WEIJia-ding,LIZhi-fei,TAIZhi-hong,GUIYu-chang,WEIYu-lan.TheFirstClinicalFacultyofGuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530023,China

XUJian-wen,DepartmentofRehabilitationMedicine，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021,China；E-mail：1049662254@qq.com

Background Promoting blood circulation and removing blood stasis treatment is the characteric therapy used by traditional Chinese medicine,and it′s also one of the main effective non-surgical therapy for lumbar intervertebral disk protrusion (LIDP) in clinic.In the past,scholars had carried out a great deal of researches from the pathology,imaging,immunology and gene about the disease,but the mechanism of LIDP treated by blood circulation was still unknown.Objective To obtain the target protein by screening and identifying the differentially expressed proteins before and after promoting blood circulation and removing blood stasis treatment for LIDP patients,using iTRAQ isobaric tags coupled with LC-MS/MS.Methods 30 LIDP patients diagnosed as blood stasis syndrome by Chinese differentiation clinically from July 2013 to December 2014 in the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine were selected as the experiment subjects.Promoting blood circulation and removing blood stasis treatment were given for 4 weeks and clinical efficacy of patients were observed.The serum of the peripheral blood was extracted before and after the treatment.To screen and identify the differentially expressed proteins before and after the treatment through removing the high abundance protein,measuring the protein concentration,enzymatic hydrolysis of proteins,peptide iTRAQ labeling,high performance liquid chromatography and LC-MS/MS analysis.The functional and metabolic pathways of the differentially expressed proteins were analyzed by the combination of gene ontology annotation and KEGG pathway-related bioinformatics.Results The results showed that 19 cases were clinical controlled,8 cases were excellent,2 cases were effective,1 case was invalid,and the total effective rate of treatment was 96.7%(29/30).In total,300 non-redundant proteins were identified by using the technique of iTRAQ and LC-MS/MS.There were quantitative information on each channel tag in 209 of these proteins.Twenty differentially expressed proteins were screened out,10 upregulated proteins and 10 downregulated proteins.In this study,the KEGG enrichment results of 20 differentially expressed proteins showed that 9 differential proteins were enriched to 27 related signal pathways.The complement and coagulation cascades were enriched to three differential proteins.PPAR signal pathways,pertussis,trypanosomiasis,staphylococcus aureus infection and systemic lupus erythematosus were enriched to two differentially expressed proteins.11 signal pathway,such as pertussis,trypanosomiasis,staphylococcus aureus infection and systemic lupus erythematosus,et al.were enriched to Complement C3.Nine signal pathways,such as PI3K-Akt signal pathway,focal adhesion,actin cytoskeleton regulation,et al.were enriched to Fibronectin 1.Conclusion The therapy of promoting blood circulation and removing blood stasis is remarkable on treating LIDP patients with blood stasis syndrome.Apolipoprotein A1,Apolipoprotein M,Apolipoprotein C3,Fibronectin 1 and Complement C3may be the potential target serum protein of therapy of promoting blood circulation and removing blood stasis for the LIDP patients with blood stasis syndrome.

Intervertebral disc displacement；Pattern of syndrome；Blood act stasis remov agents；Proteomics

國家自然科學基金資助項目(81260544)；廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019194)；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)課題(S201307-1)

530023廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院研究生(關(guān)鵬，邰志洪，桂裕昌);廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科(尹利軍，韋家鼎，李智斐)；廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學科(許建文)；廣西中醫(yī)藥大學生物化學教研室(韋玉蘭)

許建文，530021廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學科；E-mail：1049662254@qq.com

R 681.53

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.32.011

2016-04-16；

2016-09-27)