視明寶顆粒對形覺剝奪性弱視貓視皮層谷氨酸受體（NMDAR1）表達(dá)的影響

王高峰，陳美榮，徐琨，王靜波

視明寶顆粒對形覺剝奪性弱視貓視皮層谷氨酸受體（NMDAR1）表達(dá)的影響

王高峰1，陳美榮1，徐琨2，王靜波1

目的觀察視明寶顆粒對形覺剝奪性弱視貓視皮質(zhì)17區(qū)、21a區(qū)N-甲基-D-天冬氨酸受體1（NMDAR1）mRNA表達(dá)的影響。方法家養(yǎng)幼貓（4～6周齡）30只，隨機(jī)分為正常組、模型組、生理鹽水對照組以及視明寶低、中、高劑量組，每組5只。除正常組外其余各組均左側(cè)眼瞼縫合制作形覺剝奪弱視模型，應(yīng)用視覺誘發(fā)電位（P-VEP）驗證造模是否成功。采用實時定量PCR（real-time PCR）技術(shù)，檢測各組幼貓雙側(cè)視皮質(zhì)17區(qū)和21a區(qū)NMDAR1 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果1.弱視模型幼貓左眼P-VEP與同期正常幼貓左眼P-VEP比較，P波潛伏期延長，波幅降低（P＜0.001）。2.模型組雙側(cè)17區(qū)、21a區(qū)的NMDAR1 mRNA表達(dá)均較正常組明顯降低（P＜0.05），生理鹽水對照組、視明寶低劑量組各腦區(qū)指標(biāo)與模型組接近（P＞0.05）；中劑量組左側(cè)21a區(qū)的表達(dá)與正常組接近（P＞0.05），其他檢測部位數(shù)值與模型組、生理鹽水對照組及視明寶低劑量組相當(dāng)（P＞0.05）；高劑量組雙側(cè)21a區(qū)NMDAR1 mRNA表達(dá)高于其他干預(yù)組并與正常組接近（P＞0.05），左側(cè)17區(qū)數(shù)值與各干預(yù)組大致相同（P＞0.05），低于正常組（P＜0.05），右側(cè)17區(qū)數(shù)值高于正常組（P＜0.05）。3.雙側(cè)自身比較，在17區(qū)，視明寶高劑量組的右側(cè)NMDAR1 mRNA表達(dá)明顯高于左側(cè)（P=0.043），其他各組雙側(cè)差異不明顯（P＞0.05）；21a區(qū)，正常組、模型組、生理鹽水對照組、視明寶低劑量組，右側(cè)高于左側(cè)（P＜0.05），高劑量組右側(cè)低于左側(cè)（P＜0.05）。結(jié)論視明寶顆?？梢蕴岣咝斡X剝奪性弱視貓視皮質(zhì)NMDAR1的表達(dá)，高劑量組作用最明顯。

形覺剝奪性弱視；視覺可塑性；中藥；N-甲基-D-天冬氨酸受體1（NMDAR1）

弱視是一種嚴(yán)重影響兒童視覺功能發(fā)育的常見眼病，治療主要是遮蓋、配鏡、弱視訓(xùn)練及口服藥物等，治療周期長，患者依從性差，易反復(fù)，視明寶顆粒是我院已故知名眼科專家衣原良教授四十多年治療弱視的經(jīng)驗方，具有補(bǔ)肝脾，益氣血的作用，臨床治療效果顯著。前期我們已對視明寶顆粒的制劑、工藝、藥效等進(jìn)行了研究，并觀察了其對腎虛及脾氣虛中醫(yī)證型動物模型的有益作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于弱視的研究表明〔1〕，弱視的發(fā)病與初級視皮層17區(qū)及紋外皮層21a區(qū)有關(guān)，本課題通過觀察視明寶顆粒對行覺剝奪性弱視貓視皮質(zhì)17區(qū)、21a區(qū)N-甲基-D-天冬氨酸受體1（N-methyl-D-aspartic acid receptor 1, NMDAR1）作用的影響，進(jìn)一步探討中藥治療弱視的作用機(jī)制，為臨床治療弱視提供理論上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

家養(yǎng)幼貓（4～6周齡），體質(zhì)量約350 g，共30只，雌雄不分，活潑健康，常規(guī)檢查雙眼，排除其他眼部疾病。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗中心，溫度：18～25℃，濕度控制良好，通風(fēng)良好，符合醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境要求。

視明寶顆粒（魯藥制字20120030199），主要組成：枸杞子、熟地黃、當(dāng)歸、菟絲子、白芍、黨參、黃柏、陳皮等。

主要儀器、設(shè)備及試劑：LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀（美國Roche集團(tuán)），NanoDrop2000微量紫外可見分光光度計（美國Thermo Scientific公司），MilliQ plus超純水系統(tǒng)（Millipore），高溫烤箱（上海市實驗儀器總廠），Eppendorf冷凍離心機(jī)（OUPONT），Polytron（IKA○R-WERKE），Storm680掃描儀（Molecular Dynamics）恒溫水浴槽（Joudan,LKG Bromma），微波爐（格蘭仕），REFI-PORT德國羅蘭眼電生理儀，TRIZOL試劑（GIBCO-BRL公司）；RNA LA PCR TM kit（AMV）試劑盒（TaKaRa公司）；25%戊二醛（鄭州雅盛電子科技有限公司），SYBR○RPremix Ex Taq TM（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa公司）。1.2實驗方法

1.2.1形覺剝奪弱視模型制備左眼造模。手術(shù)前30 min肌肉注射阿托品注射液0.04 mg/kg，肌肉注射氯胺酮注射液麻醉（20 mg/kg）。麻醉效果欠佳者可適當(dāng)加大氯胺酮用量，固定幼貓，應(yīng)用慶大霉素注射液沖洗結(jié)膜囊，常規(guī)碘伏消毒術(shù)眼，參照文獻(xiàn)〔2〕中所述方法施行改進(jìn)的眼瞼縫合術(shù)：剪除上下瞼緣各1.5 mm，瞼裂的顳側(cè)皮膚上做一個水平單純縫合，打結(jié)后剪掉短線頭，用帶針的長線從上瞼緣進(jìn)針，平行瞼緣距該點(diǎn)3 mm處的瞼緣內(nèi)側(cè)緣處出針，進(jìn)針深度約3 mm，再從下瞼緣的相應(yīng)位置進(jìn)針，沿瞼緣向鼻側(cè)平移3 mm，從下瞼緣的內(nèi)側(cè)緣出針，再在上瞼緣相同的位置進(jìn)針，拉緊縫線，直到內(nèi)眥側(cè)，最后一針采用上游雙線打結(jié)，涂適量紅霉素眼膏，待幼貓?zhí)K醒后送回動物房。造模幼貓1周后拆除左側(cè)造模眼的縫線，行圖形視覺誘發(fā)電位（pattern visual evoked potential,P-VEP）檢查。方法：肌肉注射氯胺酮（15mg/kg）麻醉后，置于固定儀上，結(jié)膜囊內(nèi)滴入1%阿托品擴(kuò)大瞳孔并收縮瞬膜，剃除幼貓額部、枕部及右耳背的毛，在電屏蔽暗室內(nèi)進(jìn)行實驗。檢影驗光，矯正屈光不正，調(diào)整受檢眼，使視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)對準(zhǔn)視屏中央視標(biāo)，角膜頂點(diǎn)距視屏40 cm，查左眼，每次記錄時間20～30 min，采用方格圖形翻轉(zhuǎn)刺激，其平均亮度50 cd/m2，面積相當(dāng)于視屏12°×12°，空間頻率0.16 c/d，時間頻率1 Hz，對比度57%，放大器通頻帶0.5～100 Hz，分析時間250 ms，疊加128次，采用銀針電極，采集的信號送入計算機(jī)處理存盤。測量P波潛伏期、振幅，參照文獻(xiàn)〔3〕的結(jié)果，以潛伏期≥55.50 ms，振幅≤30.91 μV為造模成功。造模成功后左側(cè)眼不予縫合。

1.2.2實驗分組及干預(yù)方法將實驗動物采用簡單隨機(jī)分配法分為6組，分別為正常組、模型組、生理鹽水對照組，以及視明寶低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組5只。除正常組外其余各組均按照實驗?zāi)Ｐ椭苽浞椒ㄓ枳髠?cè)眼造模。模型組造模1周后取腦組織；對照組造模1周后每日灌胃一次2 ml 0.9%氯化鈉溶液1個月，低劑量組、中劑量組和高劑量組造模1周后分別給予劑量依次為1.39 g/kg，2.79 g/ kg，5.58 g/kg視明寶顆粒灌胃，根據(jù)每只貓的體質(zhì)量稱取相應(yīng)質(zhì)量的視明寶顆粒，溶解在2 ml的0.9%氯化鈉溶液中，每日1次，連用1個月。對照組、視明寶顆粒低、中、高劑量組灌胃給藥后1個月后取腦組織，正常組正常飼養(yǎng)1個月后取腦組織。

1.2.3實驗取材水合氯醛深度麻醉幼貓后，快速斷頭，取腦組織。將腦組織置于冰的0.9%氯化鈉溶液中，迅速切取雙側(cè)視皮質(zhì)17區(qū)和21a區(qū)，用焦碳酸二乙酯水處理過的冰0.9%氯化鈉溶液沖洗視皮質(zhì)后，放入凍存管，液氮內(nèi)保存。

1.2.4實時定量PCR（real-time PCR）檢測NMDAR1 mRNA所用內(nèi)參照基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）。提取總RNA，從總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，引物序列為：（1）NMDAR1：forward primer：5’-GTG ACC ACT GGC CTG TTC TTC-3’，reverse primer：5’-CGT CTT GTC CAG GTC TTC CAT-3’；（2）GAPDH：forward primer：5’-GAG ATC CCG CCA ACA TCA AAT-3’，reverse primer：5’-GTT CAC GCC CAT CAC AAA CAT-3’。具體步驟：Trizol法提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。建立20 μl PCR反應(yīng)體系：2×Master Mix 10.0 μl、水6.0 μl、引物2.0 μl、cDNA 2.0 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 s；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，擴(kuò)增45個循環(huán)；95℃變性5 s，65℃延伸60 s，97℃酶瞬間滅活；40℃冷卻10 s。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算出模型組與對照組間對應(yīng)基因的表達(dá)差異。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行分析，各組計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗均服從正態(tài)分布（P＞0.05），用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。經(jīng)Levene檢驗，各組幼貓左側(cè)17區(qū)、21a區(qū)及右側(cè)21a區(qū)NMDAR1 mRNA表達(dá)方差不齊（P＜0.05），各指標(biāo)的多組間差異比較采用Kruscal-Wallis檢驗；雙側(cè)同一腦區(qū)mRNA比較采用配對t檢驗。所有檢驗方法均采用雙尾檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1正常組幼貓與弱視模型幼貓P-VEP比較

弱視模型幼貓P-VEP與同期正常幼貓左眼PVEP相比較，P波潛伏期延長，波幅降低（P＜0.001）（表1）。2.2視皮質(zhì)17區(qū)、21a區(qū)NMDAR1 mRNA表達(dá)比較

表1 形覺剝奪弱視幼貓造模后與同期正常幼貓左眼P-VEP比較（x±s）

模型組雙側(cè)17區(qū)、21a區(qū)的NMDAR1 mRNA表達(dá)均較正常組明顯降低（P＜0.05），生理鹽水對照組、視明寶低劑量組各腦區(qū)指標(biāo)與模型組接近（P＞0.05）；中劑量組在左側(cè)21a區(qū)的表達(dá)相對較高，與正常組接近（P＞0.05），其余檢測部位數(shù)值與模型組、生理鹽水對照組及視明寶低劑量組相當(dāng)（P＞0.05）；高劑量組雙側(cè)21a區(qū)NMDAR1 mRNA表達(dá)高于其他干預(yù)組并與正常組接近（P＞0.05），左側(cè)17區(qū)數(shù)值與各干預(yù)組大致相同（P＞0.05），低于正常組（P＜0.05），右側(cè)17區(qū)數(shù)值高于其他干預(yù)組（P＜0.05），也高于正常組（P＜0.05）。具體見表2，圖1。

雙側(cè)自身配對比較，在17區(qū)，視明寶高劑量組的右側(cè)NMDAR1 mRNA表達(dá)明顯高于左側(cè)（左側(cè)-右側(cè)=-0.42±0.19，P=0.043），其他各組雙側(cè)差異不明顯（P＞0.05）；21a區(qū)，正常組、模型組、生理鹽水對照組、視明寶低劑量組，右側(cè)高于左側(cè)（P＜0.05），高劑量組右側(cè)低于左側(cè)（P＜0.05）。具體見表3。

3 討論

弱視視覺發(fā)育的可塑性的研究主要集中在視覺神經(jīng)系統(tǒng)的各種遞質(zhì)及其受體，近年來現(xiàn)代醫(yī)學(xué)從形態(tài)學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)等角度研究探討敏感期內(nèi)單眼剝奪對視皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)單眼剝奪的效應(yīng)主要發(fā)生在視中樞系統(tǒng)，亦從形態(tài)學(xué)與生理學(xué)的實驗研究中得到了證實〔4-6〕，其中的離子型受體——N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR）

表2 實時定量PCR檢測各組幼貓視皮質(zhì)17區(qū)、21a區(qū)NMDAR1 mRNA的相對表達(dá)量（x±s）

圖1 各組幼貓視皮質(zhì)不同區(qū)域NMDAR1 mRNA相對表達(dá)量的箱式圖NMDAR1：N-甲基-D-天冬氨酸受體1

表3 表2各組雙側(cè)NMDAR1 mRNA相對表達(dá)量差值及配對假設(shè)檢驗結(jié)果（x±s）

注：NMDAR1 mRNA/GAPDH mRNA。組間比較采用Kruscal-Wallis檢驗，兩兩比較，字母上標(biāo)相同者P＞0.0.5 PCR：聚合酶鏈反應(yīng)NMDAR1：N-甲基-D-天冬氨酸受體1 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶在視皮層可塑性發(fā)育中發(fā)揮著重要作用〔7〕。NMDAR是調(diào)節(jié)突觸可塑性的關(guān)鍵進(jìn)程，是誘導(dǎo)長時程增強(qiáng)（LTP）/長時程抑制（LTD）的基本因素〔8-9〕。NMDAR在視皮質(zhì)發(fā)育過程中可塑性的調(diào)控、誘導(dǎo)c-fos基因的表達(dá)、成年后視皮層神經(jīng)元突觸聯(lián)系的可塑性的調(diào)節(jié)及與蛋白激酶C的相互作用中都起著重要作用〔10〕。弱視的發(fā)病機(jī)制中谷氨酸及其受體扮演著重要的角色，尤其是NMDAR1起著重要作用〔11〕。Murphy等〔12〕通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，單眼剝奪性弱視，剝奪眼輸入層NMDAR1表達(dá)下降。

弱視屬于中醫(yī)小兒“通睛”“胎患內(nèi)障”“小兒青盲”等范疇，中醫(yī)治療弱視已經(jīng)積累了豐富的臨床經(jīng)驗〔13〕，但對中藥治療弱視的作用機(jī)理研究較少?！锻馀_秘要》曰：“黑白分明，肝管無滯，外托三光，內(nèi)因神識，故有所見?！薄鹅`樞·海論》曰：“髓海有余，則輕勁多力，自過其度，髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥?！薄鹅`樞·邪氣藏府病形》曰：“十二經(jīng)絡(luò)，三百六十五絡(luò)，其血?dú)饨陨嫌诿娑呖崭[，其精陽氣上走于目而為睛?！逼渲小皟?nèi)因神識”“髓?！薄捌渚枤狻奔词侵复竽X、中樞系統(tǒng)對視覺的作用。視明寶顆粒源于我院已故全國名老中醫(yī)衣元良主任醫(yī)師總結(jié)多年治療弱視的經(jīng)驗，衣老認(rèn)為弱視的病機(jī)為脾胃虛弱、肝腎精虧、氣血不足，自擬經(jīng)驗方以健脾益氣，補(bǔ)益肝腎，養(yǎng)血為治療原則，在臨床和實驗研究中都取得了很好的療效。本研究比較了正常發(fā)育幼貓、單眼形覺剝奪性幼貓及在給予不同劑量的視明寶顆粒后視皮層17區(qū)、21a區(qū)中NMDAR1的表達(dá)情況時發(fā)現(xiàn)，正常組的NMDAR1表達(dá)明顯高于生理鹽水組、模型組，說明NMDAR1在幼貓視覺發(fā)育過程中起著重要的作用。高劑量組形覺剝奪性弱視貓右側(cè)視皮層17區(qū)NMDAR1、雙側(cè)視皮層21a區(qū)NMDAR1 mRNA表達(dá)高于模型組和生理鹽水組，說明足量的視明寶顆粒能夠提高形覺剝奪性弱視貓視皮質(zhì)17區(qū)及21a區(qū)NMDAR1的數(shù)量。同一腦區(qū)左、右側(cè)視皮質(zhì)17區(qū)NMDAR1比較，高劑量組右側(cè)明顯高于左側(cè)；同一腦區(qū)左、右側(cè)視皮質(zhì)21a區(qū)NMDAR1比較，正常組、模型組、對照組、視明寶低劑量組，右側(cè)高于左側(cè)（P＜0.05），可能是足量的中藥可以提高弱視眼對側(cè)視皮質(zhì)17、21a區(qū)NMDAR1的表達(dá)。但是同一腦區(qū)左、右側(cè)視皮質(zhì)21a區(qū)NMDAR1比較，高劑量組右側(cè)卻低于左側(cè)（P＜0.05），可能與實驗的誤差有關(guān)。同一腦區(qū)左右側(cè)比較研究較少，希望在今后的科研中進(jìn)一步研究。

綜上所述視明寶顆?？梢蕴岣呙舾衅趦?nèi)形覺剝奪性弱視貓視皮質(zhì)17、21a腦區(qū)的NMDAR1 mRNA表達(dá)，提示了該藥的部分療效機(jī)制。對于視明寶顆粒是否能興奮神經(jīng)元突觸，誘導(dǎo)神經(jīng)元突觸的發(fā)育、存活和分化，逆轉(zhuǎn)弱視的形成，仍需要做進(jìn)一步的研究。

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Effects of Shimingbao granule on expression of NMDAR1 in visual cortex of cats with form deprivation amblyopia

WANG Gaofeng,CHEN Meirong,XU Kun,et al.Eye Hospital Affiliated to Shandong University of Chinese Medicine,Jinan 250011,China

OBJECTIVETo observe the effects of Shimingbao granule on cats with form deprivation amblyopia in visual cortex area of 17,21a areas by RT-PCR technique.METHODSThirty domestic cats(4-6 weeks) were randomly divided into six groups as normal group,model group,control group,low dose group,medium dose group,high dose group evenly.In addition to the normal group,cats in other groups were all sutured the left eyelid to establish form deprivation amblyopia model.The visual evoked potential(P-VEP)was applied to verify the success of the modeling.The expression of Shimingbao granule in the visual cortex glutamate receptors(NMDAR1)was detected by real-time quantitative PCR(real-time PCR)technique.RESULTS1.When compared with the amblyopic model cats,P-VEP of the normal cats showed longer incubation period and lower amplitude of P.2.In contrast to normal group,the expression of NMDAR1 mRNA in model group was lower(P＜0.05)in both sides of area 21a and 17.Indexes of the control group which were administrated with normal saline,the low dose group which were medicated with Shimingbao granule and the model group were close(P＞0.05).Expression of the left side of area 21a in middle dose group was closed to the normal group(P＞0.05),while expressions of other areas in that group were similar to model group,control group and low dose group(P＞0.05).The expression of NMDAR1 mRNA in the two sides of the area 21a in high dose group washigher than other intervention groups and was similar to results of normal group(P＞0.05);the index of the left area 17 was closed to other intervention groups(P＞0.05)but lower than normal group(P<0.05);the index of the right area 17 was higher than normal group(P<0.05).3.Intra-group comparison between two sides showed that in the area 17,expression of NMDAR1 mRNA at the right side was higher than the left in high dose group(P=0.043).The expressions of two sides in other groups were of insignificant difference(P＞0.05).In the area 21a,expression at the right side was higher than the left in normal group,model group,control group and the low dose group(P＜0.05),while expression of the right was lower than the left in the high dose group(P＜0.05).CONCLUSIONSShimingbao granule could increase the expression of NMDAR1 of the cats with form deprivation amblyopia and the high dose group received the most significant effects.

form deprivation amblyopia;visual plasticity;traditional Chinese medicine;NMDAR1(N-methyl-D-aspartic acid receptor 1)

R285.5

：A

：1002-4379（2016）04-0221-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.004

山東省科技發(fā)展計劃項目（2010GSF10257）

1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，濟(jì)南250011

2山東省食品藥品監(jiān)督管理局審評認(rèn)證中心，濟(jì)南250013

王靜波，E-mail：wangjingbosun@163.com