鱈魚皮寡肽對人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究

張國強(qiáng) 胡曉斐 續(xù)力云 吳麗萍

鱈魚皮寡肽對人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究

張國強(qiáng) 胡曉斐 續(xù)力云 吳麗萍

目的 探討鱈魚皮寡肽（cod skin of oligopeptide，CSO）對人胃癌細(xì)胞（BGC-823）增殖的影響。方法 用不同濃度（20、40、60、80mg/ml）CSO處理體外培養(yǎng)的BGC-823，72h后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況；分別于24、48、72h，應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況并計(jì)算50%細(xì)胞抑制率（IC50）；處理后24h采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變情況。結(jié)果 與對照組相比，經(jīng)CSO處理后，鏡下BGC-823數(shù)目減少。CCK-8檢測結(jié)果顯示，BGC-823數(shù)目減少呈劑量、時(shí)間依懶性（均P＜0.05），并且CSO對BGC-823作用24、48和72h的IC50分別是87.34、68.14、44.55mg/ml。對照組BGC-823存活率為（86.62±10.32）%，60mg/ml組BGC-823存活率為（24.18±6.59）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組BGC-823晚期凋亡率為（1.81±0.35）%，60mg/ml組BGC-823晚期凋亡率為（55.84±5.89）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在G1期，對照組BGC-823細(xì)胞分布為（61.13±10.32）%，60mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為（79.74±10.21）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在S期，對照組BGC-823細(xì)胞分布為（23.04±8.64）%，60mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為（10.42±5.36）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在G2期，20mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為（9.96±2.68）%，40mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為（6.93±1.25）%，60mg/ml組BGC-823細(xì)胞分布為（9.84± 3.79）%，與對照組BGC-823細(xì)胞分布（15.83±5.89）%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 CSO可阻滯BGC-823生長周期，促進(jìn)BGC-823凋亡，抑制增殖，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

鱈魚皮寡肽 人胃癌細(xì)胞 BGC-823 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡

胃癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，很多患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，其復(fù)發(fā)率較高，5年生存率不高[1]。晚期胃癌患者大多需要化學(xué)治療，但化療藥物無靶向性，不良反應(yīng)多，已成為影響胃癌治愈率的關(guān)鍵[2]。近年來，各國學(xué)者致力于尋找低毒、高效的新型抗癌藥物[3]。海洋生物中的活性物質(zhì)寡肽因其具有抗癌、抗氧化、降脂等多種生理功能，而逐漸成為全世界科學(xué)家研究的熱點(diǎn)[4-5]。本課題組于2015年8月，研究鱈魚皮寡肽（cod skin of oligopeptide，CSO）體外對人胃癌細(xì)胞（BGC-823）增殖的影響，并初步闡述其抑癌作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BGC-823由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。鱈魚皮寡肽（Cod Skin of Oligopeptide，CSO）為鱈魚深加工時(shí)鱈魚皮的酶解產(chǎn)物。主要試劑：美國Gibco公司Trypsin-EDTA胰酶細(xì)胞消化液、10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基；PI染液：10×PI配制，5mg PI（美國，Sigma公司），0.1ml Triton X-100，3.7mg EDTA，10ml PBS，RNaseA 2mg；AnnexinV-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒（KGA1017）。FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國，BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 BGC-823培養(yǎng)及傳代 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。待BGC-823在6cm dish中培養(yǎng)至80%～90%密度時(shí)，傾去培養(yǎng)液，用3ml PBS洗滌細(xì)胞2次。加1ml Trypsin-EDTA solution，混勻后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置5min。再加入2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋至5×105細(xì)胞/ml。再傳代培養(yǎng)至80%～90%密度待用。

1.2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)（CCK-8法） 取對數(shù)生長期的BGC-823，按5×103細(xì)胞/孔的濃度接種96孔板，每孔加入培養(yǎng)基100μl。待培養(yǎng)過夜后，加入不同劑量的CSO處理，分為20、40、60、80mg/ml 4個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)立對照組（不加藥物），并做好標(biāo)識(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)，每24h更換1次培養(yǎng)液，至72h后，傾去培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基100μl后，每孔避光加入CCK8試劑10μl，避光培養(yǎng)1.5h后，選擇450nm波長，用在酶標(biāo)儀上測定各孔光密度值D450，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：腫瘤細(xì)胞抑制率（%）=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組）×100%。使用OriginPro 8.5軟件做抑制曲線，計(jì)算IC50。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測（流式細(xì)胞術(shù)） 用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液消化處于對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞離心收集，在含10%FBS的Ham F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為CSO20、40、60、80mg/ml 4個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)立對照組（不加藥物）。細(xì)胞貼壁后，各濃度組作用24h，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1～5×106cells/ml。用100%乙醇（-20℃）1.5ml，使其終濃度為75%，4℃過夜固定。取出固定單細(xì)胞懸液在室溫下1 000r/min離心5min后棄上清液，按照150μlRNaseA重懸細(xì)胞，37℃消化30min，加入100μl PI工作液，4℃避光染色30min。用流式細(xì)胞儀分析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期的百分率。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測（流式細(xì)胞術(shù)） 細(xì)胞傳代后培養(yǎng)至24h，分別加入CSO處理，分為20、40、60、80mg/ml組，同時(shí)設(shè)立對照組（不加藥物）。作用至24h后，PBS洗3遍，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速2 000r/min，離心時(shí)間5min，棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次（2 000r/min，離心時(shí)間5min收集細(xì)胞）；在50μl的Binding Buffer中加入5μl7-AAD染液，混勻。在收集的細(xì)胞中加入上述7-AAD染液，混勻；室溫、避光、反應(yīng)15min。反應(yīng)后再加入450μl的Binding Buffer混勻；加入1μlAnnexin V-PE混勻，室溫、避光、反應(yīng)15min。在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CSO對BGC-823增殖的影響 見圖1-2，表1。

由圖1可見，經(jīng)不同濃度CSO（20、40、60、80mg/ ml）處理后各組與對照組比較，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞變圓，細(xì)胞碎片增多，且呈劑量依懶性。由表1及圖2可見，隨著時(shí)間與CSO濃度的增加，檢測到OD值呈降低趨勢，CSO對BGC-823的抑制率逐漸增大，作用24、48和72h的IC50分別是87.34、68.14、44.55mg/ml。

圖1 CSO作用后BGC-823的鏡下形態(tài)（a：對照組；b：20mg/ml組；c：40mg/ml組；d：60mg/ml組；e：80mg/ml組）

2.2 CSO對BGC-823凋亡的影響 見圖3，表2。

由圖3、表2可見，20、40、60、80mg/ml CSO處理BGC-823，觀察24h細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞存活率與60mg/ml組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組細(xì)胞晚期凋亡率與60mg/ml組比較差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而兩組早期凋亡率及死亡細(xì)胞率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。當(dāng)濃度為80mg/ml，24h后活細(xì)胞極少，已無法染色，故無該濃度流式細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.3 CSO對BGC-823增殖周期的影響 見圖4、表3。

由圖4、表3可見，20、40、60、80mg/ml CSO處理BGC-823 24h后發(fā)現(xiàn)，在G1期，對照組與60mg/ml組細(xì)胞分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在S期，對照組與60mg/ml組細(xì)胞分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在G2期，對照組與20mg/ml組、40mg/ml組、60mg/ml組細(xì)胞分布比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 CSO對BCG-823細(xì)胞增殖的抑制作用（n=5）

圖2 CSO作用于BGC-823不同時(shí)間后IC50（a：24h；b：48h；c：72h）

圖3 不同濃度CSO作用于BGC-823后細(xì)胞凋亡圖（a：對照組；b：20mg/ml組；c：40mg/ml組；d：60mg/ml組）

表2 BGC-823細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（%）

3 討論

上世紀(jì)50年代各國開始進(jìn)行海洋生物抗腫瘤活性物質(zhì)的研究，目前已有多項(xiàng)研究提示海洋生物寡肽具有抗癌的作用。Huang等[6]證實(shí)烏賊墨寡肽能顯著抑制人前列腺癌DU-145細(xì)胞的增殖。Bach等[7]在鹽場中發(fā)現(xiàn)一種嗜鹽鏈霉菌屬放線菌（Salternamide A，SA），能誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡。Costa等[8]對208株海洋藍(lán)藻的抗癌作用研究后，認(rèn)為海洋藍(lán)藻具有一定的細(xì)胞毒性，是一類很有前途的具有潛在抗癌活性的海洋生物。

圖4 不同濃度CSO作用BGC-823后各組細(xì)胞周期圖（a：對照組；b：20mg/ml組；c：40mg/ml組；d：60mg/ml組）

表3 BGC-823分布周期比較（%）

CSO是以水解、酶解蛋白和蛋白質(zhì)多肽吸收理論為基礎(chǔ)研發(fā)的一種全新海洋功能性食品，產(chǎn)品不僅實(shí)現(xiàn)了邊角料高附加值利用的產(chǎn)業(yè)化問題，而且針對人體營養(yǎng)學(xué)需要，利用細(xì)胞和基因技術(shù)，研究魚皮膠原蛋白肽在抗癌作用和增強(qiáng)免疫力生理功能，在滿足人體氨基酸需求的同時(shí)又滿足對腫瘤患者在放療、化療、術(shù)后恢復(fù)的抗癌輔助作用提供理論依據(jù)。為了研究開發(fā)新型海洋生物抗癌藥物，充分利用海洋深加工下腳料，本課題組從深海鱈魚皮中提取寡肽，并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)、顯微鏡觀察、CCK-8法檢測、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，研究不同濃度（20、40、60、80mg/ml）CSO體外對BGC-823增殖及細(xì)胞周期與凋亡情況的影響。結(jié)果顯示，CSO能抑制BGC-823增殖，且隨著CSO濃度增高，增殖抑制更加明顯。采用CCK-8法檢測CSO作用后BGC-823 24、48、72h增殖情況變化，發(fā)現(xiàn)OD值隨著CSO的濃度增加而降低，24、48、72h的 IC50分別是 87.34、68.14、44.55mg/ml，可見藥物對細(xì)胞的抑制率隨著濃度增加而增高，上述結(jié)果表明，CSO對BGC-823的增殖有抑制作用，且呈時(shí)間、量效關(guān)系。CSO細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BGC-823細(xì)胞隨著CSO濃度增加，晚期凋亡細(xì)胞的比率增加，而活細(xì)胞比率則降低。60mg/ml的CSO加藥后，細(xì)胞的晚期凋亡率平均值甚至從對照組的1.81%達(dá)到55.84%，活細(xì)胞比率平均值從對照組的86.62%降低至24.18%，說明高濃度CSO對于BGC-823細(xì)胞凋亡進(jìn)展有顯著影響。同時(shí)CSO的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CSO藥物濃度達(dá)到60mg/ml時(shí)，G1期細(xì)胞分布由對照組的61.13%提升至79.74%，而S期和G2期細(xì)胞分布則由對照組的23.04%和15.83%降低至10.42%和9.84%。表明隨著藥物濃度的增大，S期細(xì)胞的數(shù)量明顯降低，細(xì)胞均被抑制在G1期，導(dǎo)致了細(xì)胞增殖的停滯。

課題組應(yīng)用酶法從鱈魚皮中提取CSO，通過BGC-823體外加藥實(shí)驗(yàn)，來研究CSO體外抗胃癌作用，結(jié)果證實(shí)CSO能抑制BGC-823增殖，促進(jìn)凋亡，且呈時(shí)間、量效關(guān)系；同時(shí)能將細(xì)胞周期抑制在S/G2期，雖其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究，但本研究結(jié)果為海洋生物應(yīng)用價(jià)值和新型抗癌藥物的開發(fā)利用提供了新的思路。

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Effect of cod skin oligopeptide on proliferation of human gastric carcinoma BGC-823 cells

ZHANG Guoqiang,HU Xiaofei,XU Liyun,et al.Department of Gastrointestinal Surgery,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

【 Abstract】 Objective To explore the effect of cod skin oligopeptide (CSO)on the proliferation of human gastric carcinoma BGC-823 cells. Methods BGC-823 cells were treated with different concentrations(20,40,60,80mg/mL)of CSO. Cell morphology was observed under the microscope,cell viability was determined by CCK-8 assay,and ell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry. Results CSO significantly suppressed the proliferation of BGC-823 cells in a time-and dose-dependent manner.IC50of CSO with 24h,48h and 72h were 87.34mg/ml,68.14mg/ml and 44.55mg/ml,respectively.The early apoptosis rate of BGC-823 cells was(17.55±5.48)%and the late apoptosis rate was(55.84±5.89)%,when the cells were treated with 80mg/ml CSO.After BGC-823 cells were treated with CSO for 24h,the cell cycle arrested at S/G2stage.The number of G1cells increased with the increasing of CSO concentration,peaked at(79.74±10.21)%when CSO concentration was 60mg/ml,the number of S/G2cells were decreased with the increasing of CSO concentration,reached the lowest value of(9.84± 3.79)%when CSO was 60mg/ml. Conclusion CSO can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of human gastric cancer BGC-823 cells.

Cod skin of oligopeptide Human gastric carcinoma cellBGC-823 Cell cycle Apoptosis

2016-06-21）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY12C20002）；浙江省科技廳公益類項(xiàng)目（2011C23034）

316021 舟山醫(yī)院胃腸外科

吳麗萍：E-mail：13605800815@126.com