中藥熱奄包對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液CRP、IL-1、TNF-α的影響

吳紅 王嵐 朱業(yè)崇

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

?

中藥熱奄包對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液CRP、IL-1、TNF-α的影響

吳紅1王嵐1朱業(yè)崇2

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

中藥熱奄包； 兔； 膝； 骨關(guān)節(jié)炎； C-反應(yīng)蛋白; 白細(xì)胞介素-1; 腫瘤壞死因子-α

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA) ，又稱增生性膝關(guān)節(jié)炎、退行性骨關(guān)節(jié)炎等，是一種以膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為病理特點(diǎn)的慢性關(guān)節(jié)病，膝關(guān)節(jié)腫脹疼痛、功能障礙甚至畸形為主要臨床表現(xiàn),現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響中老年人生活質(zhì)量的疾病之一[1]。因此,研究該病的治療意義重大。已有研究[2]表明，KOA關(guān)節(jié)液中炎性介質(zhì)對(duì)滑膜炎癥的發(fā)展和軟骨基質(zhì)的破壞具有重要作用，而隨著KOA病情的變化,關(guān)節(jié)液中的炎性介質(zhì)的含量亦發(fā)生改變[3]。本研究旨在觀察中藥熱奄包對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)骨液C-反應(yīng)蛋白(CRF)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭大白兔60只，雌雄各30只，體質(zhì)量(2.0±0.4) kg，一次性購(gòu)置于貴陽(yáng)市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物分組：60只新西蘭大白兔采用單純隨機(jī)方法分為對(duì)照組、治療組、空白組,每組各20只。每天常規(guī)飼養(yǎng),室溫15～25 ℃，空氣流通，定時(shí)喂食、自由飲水。實(shí)驗(yàn)藥品：中藥熱奄包(附方：紅花15 g、防風(fēng)15 g、花椒10 g、艾葉20 g、伸筋草15 g、草烏20 g、桂枝10 g、川芎13 g、大血藤12 g、澤蘭10 g、木瓜10 g、牛膝15 g、透骨草10 g、當(dāng)歸10 g、蘇木10 g):貴陽(yáng)中醫(yī)二附院骨一科提供。木瓜蛋白酶:上海依赫生物科技有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20060802；；鹽酸氨基葡萄糖片：江蘇正大清江制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H21060840；利多卡因、酒精、生理鹽水:購(gòu)于貴陽(yáng)中醫(yī)二附院藥房。

1.2 主要試劑及儀器 CRP、IL-1、TNF-α試劑盒: 由貴陽(yáng)市化學(xué)試劑批發(fā)公司一次性購(gòu)入；電子天平(ME2355型，SARTORIUS公司)，系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭、KDC-40低速離心機(jī)、快速混勻器、一次性無(wú)菌注射器、兔固定臺(tái)、冰箱等,由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 方法 造模方法：適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,按照兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶造成骨關(guān)節(jié)病變模型的方法對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行造模。方法為:正常飼養(yǎng)1周后, 將所有兔子的右后肢膝前區(qū)剪毛、消毒后，將0.5%利多卡因注射到動(dòng)物右后肢膝前區(qū)周圍進(jìn)行局部麻醉，待麻醉生效后,屈曲膝關(guān)節(jié)45°以髕骨下極髕腱外緣為進(jìn)針點(diǎn)，向髁間窩方向進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后后撤2 mm，向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入1.6%木瓜蛋白酶溶液1 mL，分別于造模實(shí)驗(yàn)的第1，4，7天注射，共3次，每次劑量均為1 mL。術(shù)中注意盡量不刺激關(guān)節(jié)軟骨及滑膜。于第3次注射完畢后，對(duì)60只大白兔右膝關(guān)節(jié)照射X線片，以確定獲得穩(wěn)定的退行性膝骨關(guān)節(jié)炎模型。給藥方法：確定造模成功后，治療組造模膝關(guān)節(jié)外敷中藥熱奄包(中藥熱奄包按照上述配方要求取量，置清水中浸泡12 h，煎煮20 min，將毛巾置于藥液中浸漬待用),用浸漬藥液的毛巾包裹造模關(guān)節(jié)表面,每日早晚各1次，30 min/次；對(duì)照組予以鹽酸氨基葡萄糖片灌服，每日早晚各1次，1片/次；空白組造模后不給于任何特殊處理，僅常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 觀測(cè)指標(biāo) 經(jīng)4周治療后，所有兔子均在耳緣靜脈處注射空氣30 mL,快速處死后固定于解剖架上,造模膝關(guān)節(jié)快速消毒；切開造模膝關(guān)節(jié)，用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)，收集沖洗液，用免疫組化方法檢測(cè)各組沖洗液中CRP、IL-1、TNF-α的水平,將關(guān)節(jié)混合液置6 000 r/min離心8 min,吸出上清液約0.5mL,裝入試管中,置-20 ℃低溫冰箱保存待測(cè)。關(guān)節(jié)液的CRP、IL-1、TNF-α含量按試劑盒內(nèi)說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

造模后的兔子均有精神欠佳,食量減少,部分出現(xiàn)跛行,未做特殊處理。造模3 d后精神、食量逐漸恢復(fù)。三組各數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布，且具有方差齊性，兔膝骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，關(guān)節(jié)滑液中CRP、IL-1、TNF-α水平較高，可間接說(shuō)明造模成功；通過(guò)不同方法治療后，治療組、對(duì)照組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明兩種治療方法均能降低兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中CRP、IL-1、TNF-α含量，即能抑制關(guān)節(jié)液中的炎性因子；治療組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可間接說(shuō)明中藥熱奄包治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎具有明確的治療作用。見表1。

表1 三組兔膝關(guān)節(jié)液中CRP、IL-1、TNF-α含量的比較

3 討 論

KOA發(fā)病機(jī)理目前尚未清楚,一般都認(rèn)為其與衰老、創(chuàng)傷、炎癥、肥胖、代謝障礙、免疫異常和遺傳等多因素的變化有關(guān)[4-5]。KOA臨床發(fā)病率較高,目前對(duì)其治療主要集中在藥物鎮(zhèn)痛、軟骨修復(fù)及后期外科手術(shù)干預(yù)上,其治療目前尚無(wú)特效的方法,只能治療癥狀和延緩疾病的進(jìn)程。因此,對(duì)本病的治療已被醫(yī)療界所重視。已有研究[6-7]表明，隨著KOA病情的加重,關(guān)節(jié)液中CRP、IL-1、TNF-α含量明顯增加,顯示出二者存在明顯的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中CRP、IL-1、TNF-α的含量來(lái)探討中藥熱奄包對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制,同時(shí)利用關(guān)節(jié)液中CRP、IL-1、TNF-α含量的變化反映病情嚴(yán)重程度亦具有一定的研究?jī)r(jià)值，可作為下一步研究的重點(diǎn)。

目前中醫(yī)藥在治療KOA上方法多種多樣,如內(nèi)服中藥、中藥外敷、針灸、針刀等。課題中選用的中藥熱奄包屬于中醫(yī)外治法中的中藥外敷，因此具有中醫(yī)外治法的毒副作用小、可長(zhǎng)期使用等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用并取得較好的臨床療效。武鈺等[8]通過(guò)中藥熱敷的方法治療退行性膝骨關(guān)節(jié)炎,以外治之法、治內(nèi)之病，取得滿意的臨床療效。譚銳泉等[9]用中藥?kù)贍C外治法治療膝骨關(guān)節(jié)炎60例，總有效率達(dá)到93.3%，其總有效率明顯高于對(duì)照組的西藥治療且毒副作用小。

KOA屬于中醫(yī)的“痹癥”范疇，中醫(yī)認(rèn)為“痹癥”是由于“風(fēng)寒濕三氣雜致、合而為痹”，所以中醫(yī)在治療時(shí)主要是在于祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)止痛，研究中的中藥熱奄包由紅花、防風(fēng)、花椒、艾葉、伸筋草、草烏、桂枝、川芎、大血藤、澤蘭、木瓜、牛膝、透骨草、當(dāng)歸、蘇木組成。方中紅花、花椒、大血藤、澤蘭活血祛瘀消腫；木瓜、伸筋草舒經(jīng)活絡(luò)；防風(fēng)、草烏、川芎、透骨草、花椒祛風(fēng)散寒除濕止痛；桂枝、艾葉、大血藤溫經(jīng)通脈；牛膝、當(dāng)歸滋補(bǔ)肝腎；全方共奏祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)止痛之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[10]表明，紅花、花椒、大血藤、澤蘭能夠明顯的抑制血小板活性和血栓形成，；防風(fēng)、川芎、草烏、透骨草、花椒中含有鎮(zhèn)痛作用的揮發(fā)油成分和生物堿成分；木瓜、伸筋草有較強(qiáng)的抗菌作用；桂枝、艾葉、大血藤能加快機(jī)體血液循環(huán)的速度，從而起到活血化瘀的療效；牛膝、當(dāng)歸可保護(hù)腎臟的功能，同時(shí)具有消炎鎮(zhèn)痛的作用。外敷祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)止痛之中藥熱奄包,可能通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)液中的變異的細(xì)胞因子、消滅多余的氧自由基而抑制炎癥介質(zhì),進(jìn)一步改善關(guān)節(jié)腔內(nèi)微循環(huán)和代謝,減低骨內(nèi)及關(guān)節(jié)內(nèi)壓力,促進(jìn)關(guān)節(jié)積液吸收,保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的退變過(guò)程,同時(shí)有利于關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù),從而對(duì)KOA起到一定的治療作用。

[1] 胥少汀,葛寶豐,徐印坎.實(shí)用骨科學(xué)[M].4版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2014：1201-1202.

[2] 張延輝，高春陽(yáng)，李少華.骨性關(guān)節(jié)炎患者退變軟骨及滑膜組織中細(xì)胞因子的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究，2013，17(37):6671-6675.

[3] 管興發(fā),董金波,王維山,等.骨關(guān)節(jié)炎患者血清及關(guān)節(jié)液中TNF-A與MMP-3含量及臨床意義[J].青島醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,40(1):9-12.

[4] 申延清，劉風(fēng)霞，曹紅，等.膝骨關(guān)節(jié)炎患者的臨床表現(xiàn)及相關(guān)影響因素[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(9)：1643-1646.

[5] 王偉，王坤正，黨小謙，等.中老年膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的相關(guān)因素[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(44):15-18.

[6] 陳根強(qiáng),許慧娟,汪志明,等.骨性關(guān)節(jié)炎患者中血清與關(guān)節(jié)液的炎性因子水平變化及意義[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(1)：110-113.

[7] Largo R, Alvarez-Soria MA, Diez-Ortego I, et al. Glucosamine inhibits IL-1beta-induced NFKappa B acti-vation in human osteoarthritic chondrocytes[J] .Osteoarthritis Cartilage, 2003, 11 (4) : 290-298.

[8] 武鈺,朱偉,張戰(zhàn)行,等.中藥濕熱敷法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2013,8(3)：41.

[9] 譚銳泉,彭力平.中藥?kù)贍C外治法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎伴滑膜炎60例[J].中國(guó)醫(yī)藥指南, 2013,11(20),287-288.

[10] 侯家玉，方泰惠.中藥藥理學(xué)[M].2版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，200：121.

貴州省中管局課題(編號(hào)：QZYY-2014-035 )

R-332；R274.9

B

1000-744X(2016)11-1144-02

2016-06-20)