不育男性精子DCXR mRNA表達與頂體酶陽性反應(yīng)率的關(guān)系

馬曉萍 高曉勤 丁賢勝 周樺

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，貴州 貴陽,550004;2.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563006;3.六盤水市人民醫(yī)院病理科，貴州 六盤水 553000;4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,貴州 貴陽,550004)

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不育男性精子DCXR mRNA表達與頂體酶陽性反應(yīng)率的關(guān)系

馬曉萍1,2高曉勤2△丁賢勝3周樺4

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，貴州 貴陽,550004;2.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563006;3.六盤水市人民醫(yī)院病理科，貴州 六盤水 553000;4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,貴州 貴陽,550004)

目的 探討原因不明男性不育患者精子DCXR mRNA的表達與頂體酶陽性反應(yīng)率和受精力的關(guān)系。方法 收集88例精液標(biāo)本，其中正常生育組20例，不育男性68例。參照世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)方法對標(biāo)本進行精液常規(guī)分析，68例不育標(biāo)本分為不育A組和不育B組。采用實時熒光定量PCR 法，檢測DCXR 基因mRNA 的相對表達量；以固定底物膜法觀察頂體酶陽性反應(yīng)率；以人精子穿透去透明帶金黃地鼠卵異種體外受精試驗(SPA)檢測精子受精力。結(jié)果 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:正常生育組的精子DCXR 基因mRNA 的相對表達量明顯高于不育A、B兩組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均有顯著性差異(P<0.05)；不育A、B兩組的精子頂體酶陽性反應(yīng)率和受精率與正常生育組比較均有顯著性下降(P<0.05)。相關(guān)性分析提示精子DCXR 基因mRNA 的相對表達量與頂體酶陽性反應(yīng)率存在正相關(guān)性(r=0.440，P<0.01)，精子DCXR 基因mRNA 的相對表達量與受精率存在正相關(guān)性(r=0.422，P<0.01)。結(jié)論 原因不明男性不育患者精子DCXR mRNA 的表達減少，精子DCXR mRNA 的表達與頂體酶陽性反應(yīng)率和受精率有一定相關(guān)性。

男性不育； DCXR； 頂體酶陽性反應(yīng)率

男性不育可由多種疾病或多種原因引起，如內(nèi)分泌功能失調(diào)、睪丸生精功能障礙、精子結(jié)構(gòu)與功能異常等等。精液常規(guī)分析是目前判斷男性不育的常用指標(biāo)，但精液分析結(jié)果不能準(zhǔn)確反映精子受精能力。因此，結(jié)合多種指標(biāo)分析，才能提高臨床的診斷水平，準(zhǔn)確評估男性生育潛能[1]。隨著研究的不斷深入，受精過程中參與精子獲能和精卵識別的精子蛋白與男性不育的關(guān)系越來越引起廣泛關(guān)注[2]。由于精子必須經(jīng)過附睪管道內(nèi)的成熟過程才能獲得受精能力，附睪內(nèi)精子達到功能上成熟的過程主要依賴于雄激素調(diào)控下的附睪蛋白的合成和分泌[3-4]。有文獻報道，人腎臟的雙羰基/L-木酮糖還原酶(dicarbonyl/L-xylulose reductase，DCXR)與附睪精子蛋白P34H可能是同一個蛋白[5]。 P34H是在研究人精子透明帶相互作用時發(fā)現(xiàn)的精子表面蛋白，主要分布在附睪體部的近端和遠端。初步研究表明，P34H能夠介導(dǎo)精子和透明帶的結(jié)合，并可作為精子附睪成熟的標(biāo)志物，而且低水平的附睪精子蛋白P34H與原發(fā)性男性不育相關(guān)[6]。通過對附睪精子蛋白P34H基因克隆及表達的初步研究，首次從cDNA 水平上證明，附睪精子蛋白P34H 與腎臟中的雙羰基/ L-木酮糖還原酶( DCXR)是同一個蛋白；同時發(fā)現(xiàn)P34H 序列與人腎臟的雙羰基還原酶cDNA序列完全一致[7]。我們采用實時熒光定量PCR檢測正常生育組和不育組人精子中DCXR mRNA的表達水平，改良明膠底物膜法[8]評價頂體酶陽性反應(yīng)率，用人精子穿透去透明帶金黃地鼠卵異種體外受精試驗(SPA)測定其受精力。通過比較正常者與不育患者精子的DCXR mRNA表達水平，并分析DCXR mRNA表達量與頂體酶陽性反應(yīng)率、受精率的相關(guān)性，從而進一步探明DCXR mRNA表達對精子功能的影響，明確其在男性生殖過程中的功能提供理論和實驗依據(jù)，為臨床診斷和治療男性不育拓寬思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 金黃地鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司

1.1.2 主要試劑 Percol1分離液購自美國Pharmacia公司；人輸卵管液HTF購自美國InVitroCare公司； 精子細胞BWW培養(yǎng)液購自美國Toscience公司；TRIzol RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司； RNA 抽提液購自美國Gibco 公司； cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒，購自日本TaKaRa公司； 孕馬血清促性腺激素(PMSG)、絨毛膜促性腺激素(HCG)為上海生化制藥廠產(chǎn)品；透明質(zhì)酸酶、胰酶為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本來源 選擇貴州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖檢驗中心就診者。生育組:20例身體健康，有生育史的正常成年男性，年齡22～40歲，其精液常規(guī)各項指標(biāo)符合WHO 規(guī)定的正常精液常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，精漿及血清抗精子抗體陰性；不育A組:28例婚后2年以上未育，已排除女方不孕因素，且精液常規(guī)各項指標(biāo)在正常范圍的不明原因原發(fā)不育癥患者。不育B組:40例婚后2 年以上未育，已排除女方不孕因素，精液常規(guī)檢查結(jié)果中有一項以上異常的不育患者。

1.2.2 精子標(biāo)本制備 所有供精者均禁欲5～7 d，手淫方式取全部精液于無菌塑料杯中，置37 ℃恒溫水浴箱孵育約30 min，完全液化后用40:80梯度的Percoll液進行密度梯度離心分離成熟精子。收集80%層精子，用HTF洗滌兩次并在顯微鏡下確認純化效果并計數(shù)精子密度，取自同一份精液標(biāo)本的精子，一部分用于總RNA 提??；另一部分用于頂體反應(yīng)陽性率和SPA的測定。

1.2.3 實時熒光定量PCR法 純化后的精子室溫500r/min離心5 min，棄上清，精子沉淀用于RNA提取。用TRIzol提取RNA，按TRIzol試劑說明書進行，用適量的DEPC 水溶解RNA 沉淀，-80 ℃保存。測定RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在實時定量PCR 中作為模板，以qPCR檢測各組DCXR mRNA的表達量。DCXR引物序列為正向: 5’-TCGTGAATGTCTCCAGCAGTG-3’，反向: 5’-GGATTCGGTTCAGCATAGTCTTG-3’，產(chǎn)物174 bp；管家基因β肌動蛋白引物序列為正向: 5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，反向: 5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，產(chǎn)物285 bp；引物由上海生工生物有限公司合成。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min(預(yù)變性)后進入循環(huán)(40個):95 ℃ 變性30 s； 60 ℃ 30 s 。整個反應(yīng)過程中熒光信號的變化由qPCR儀監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動分析并顯示計算結(jié)果，2-△△CT為DCXR的相對表達量。

1.2.4 固定底物膜法評價頂體反應(yīng)陽性率 Percol1分選的人精子以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，調(diào)整精子濃度為4×107/mL，將上述精子懸浮液取50、l涂于改良明膠底物膜片[9]上，置于37 ℃恒溫恒濕箱孵育，3 h后取出，室溫下干燥，終止孵育后，每份孵育片于Leica DME光學(xué)顯微鏡下均勻選取5～6個視野，隨機觀察200個精子頭部，出現(xiàn)周圍暈環(huán)者視為頂體酶陽性反應(yīng)。計算頂體酶陽性反應(yīng)率。

1.2.5 人精子穿透去透明帶金黃地鼠卵異種體外受精試驗(SPA) 8～12周齡雌性金黃地鼠，用PMSG和hCG超數(shù)排卵，無菌條件下取出輸卵管并挑出卵塊，卵周圍顆粒細胞及透明帶分別用0.1%的透明質(zhì)酸酶和0.1%胰酶消除，用上游法制備精子懸液，并在倒置顯微鏡下將分離得到的精子用HTF液調(diào)至2×106個/mL，37 ℃，5% CO2條件下孵育2 h 以獲能。再將卵子轉(zhuǎn)入獲能精子懸液中，在5%CO2，37 ℃條件下孵育1 h受精。相差顯微鏡下觀察卵細胞漿，以卵內(nèi)有膨大的精子頭及其尾部存在作為被精子穿透的指標(biāo)，根據(jù)總卵數(shù)及受精卵數(shù)，計算受精率。

2 結(jié) 果

2.1 正常生育組與不育組精子的DCXR mRNA表達水平 實時熒光定量PCR熔解曲線顯示，熔解曲線均為單峰，無引物二聚體或其他雜峰出現(xiàn)，表明擴增特異性良好。正常生育組和不育A、B兩組的相對表達量分別為[(0.53±0.16)、(0.36±0.12)、(0.34±0.12)]，不育A、B兩組和正常生育組相比，DCXR 基因mRNA 的相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不育A、B兩組相比，DCXR 基因mRNA 的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 正常生育組與不育組的精子頂體酶陽性反應(yīng)率和受精率 正常生育組和不育各組的精子頂體反應(yīng)陽性率分別為[(72.79±8.66)、(49.99±10.56)、(38.24±8.34)]，正常組和不育各組的受精率分別為[(43.09±6.23)、(30.29±6.09)、(19.64±6.10)]，不育A、B兩組的精子頂體酶陽性反應(yīng)率和受精率與正常生育組比較均有顯著性下降(P<0.05)。正常生育組和不育A、B組的頂體反應(yīng)發(fā)生率見圖1。

注:A.正常生育組(20例): 頂體反應(yīng)發(fā)生率可達72.79%；B.不育A組(n=28): 頂體反應(yīng)發(fā)生率為49.99%；C.不育B組(40例): 頂體反應(yīng)發(fā)生率為38.24%。圖1 正常生育組和不育A、B組的頂體反應(yīng)發(fā)生率(光鏡×400)

2.3 精子DCXR mRNA表達水平與頂體酶陽性反應(yīng)率、受精率的相關(guān)性 相關(guān)性分析提示精子DCXR基因mRNA 的相對表達量與頂體酶陽性反應(yīng)率存在正相關(guān)性(r=0.440，P<0.01)；相關(guān)性分析提示精子DCXR 基因mRNA的相對表達量與受精率存在正相關(guān)性(r=0.422，P<0.01)。

3 討 論

DCXR是一個屬于短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族[5]的四聚體，DCXR具有二乙酰還原酶，L-木酮糖還原酶活性，主要在二羰基復(fù)合物和葡萄糖代謝中發(fā)揮作用[9]。 DCXR分布在哺乳動物的多種組織中，在肝臟、腎臟和附睪中均有表達。提示DCXR是一個“兼職蛋白”，參與眾多重要生命活動[10]。

目前尚未見文獻報道人精子中是否有DCXR mRNA的表達。有研究[11]報道，人類成熟精子mRNA的表達與精子發(fā)生、質(zhì)量及不育有關(guān)，成熟精子中的mRNA是精子發(fā)生過程中的殘留物，定量檢測可以間接反映精子發(fā)生過程中的基因表達情況。本研究通過熒光實時定量PCR證實DCXR mRNA在正常生育組和不育各組的精子中均有不同程度的表達，但表達量有所差別。其中正常生育組中精子DCXR mRNA表達顯著高于不育各組，但在不育A、B兩組的表達差異不顯著。本結(jié)果提示DCXR在精子成熟中起一定的作用，DCXR mRNA表達水平不足，可能伴有精子成熟障礙和精子功能異常，從而使DCXR合成受阻和表達障礙，引起不育。

頂體反應(yīng)發(fā)生率以及穿過透明帶并與卵膜融合的能力是評價精子受精能力的重要功能指標(biāo)。正常情況下，頂體反應(yīng)是受精的前提，它可使精子頂體內(nèi)所含的頂體酶釋放出來，支持精子穿過卵透明帶，從而促使精卵融合而受精，頂體反應(yīng)發(fā)生障礙可引起不育[12]。本研究采用改良明膠底物膜法檢測頂體酶陽性反應(yīng)率，頂體酶陽性反應(yīng)率的高低在一定程度上可反映精子頂體反應(yīng)的發(fā)生率，不出現(xiàn)頂體酶陽性反應(yīng)的精子，是不能測出頂體酶活性強度的。因此，我們檢測了正常生育者和不育者精液標(biāo)本中精子DCXR mRNA表達水平、頂體反應(yīng)陽性率和受精能力，并且對DCXR mRNA表達水平、頂體反應(yīng)陽性率和受精率分別做相關(guān)性分析。從實驗結(jié)果可以看出，精子中DCXR mRNA含量與頂體反應(yīng)陽性率、受精率都有一定相關(guān)性，說明DCXR mRNA與精子功能有關(guān)。

綜上所述，精子中DCXR mRNA含量不僅反映了精子成熟過程的正常與否，還與精子頂體酶陽性反應(yīng)率和受精能力有一定關(guān)系。我們在研究過程中發(fā)現(xiàn)部分不育男性的精子DCXR mRNA水平接近于正常人，但其在某些原因不明的不育患者精子中的異常表達，說明附睪功能紊亂可能是造成其不育的原因之一。但DCXR mRNA在參與受精過程中與其他相關(guān)功能的關(guān)系還需進一步研究，從而為臨床診斷和治療男性不育提供詳盡的理論和實驗依據(jù)。

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The correlation between the level of DCXR mRNA expression and the positive rate of acrosin reaction in infertile males

MaXiaoping1,2,GaoXiaoqin2,DingXiansheng3,ZhouHua4.

1.DepartmentofHistologyandEmbryology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563006,China. 3.DepartmentofPathology,thefirstPeople＇sHospitalofLiupanshui,Liupanshui553000,China. 4.ReproductiveMedicineCenter,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the correlation between the level of DCXR mRNA expression and the fertilizing ability in unexplained infertility. Methods 88 semen samples were collected. 68 cases were in infertile group, and 20 in normal control group. Semen routine analysis was referred to WHO standard method. Real-time PCR was used to detect the level of DCXR mRNA expression on spermatozoa. Using a sperm penetration of zona-free hamster egg assay (SPA) to detect the fertilizing capability and the positive rate of acrosin reaction in each sample were examined by improved fixed-substrate film method. Results There were statistical significantly differences in the level of DCXR mRNA expression, the positive rate of acrosin reaction and the penetration rate of SPA between each infertile group and the control(P<0.05). The level of DCXR mRNA expression, the positive rate of acrosin reaction and the penetration rate of SPA in the each infertile group were significantly lower than that in control group. The relation between the DCXR mRNA expression and the positive rate of acrosin reaction had a significant positive correlation (r=0.440,P<0.01); the relation between the DCXR mRNA expression and the penetration rate of SPA had a significant positive correlation (r=0.422,P<0.01). Conclusion The level of DCXR mRNA expression is reduced in unexplained infertility, while the positive rate of acrosin reaction and the penetration rate of SPA are correlated with the level of DCXR mRNA expression.

Male infertility； DCXR； The positive rate of acrosin reaction

貴州省科技計劃項目[黔科合LH字(2015)7567號]；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊項目[黔科合人才團隊(2014)4005號]

R321.1

A

1000-744X(2016)11-1129-03

2016-06-08)

△通信作者，E-mail:gxq550301@163.com