甲狀腺乳頭狀癌組織中Smad4基因表達(dá)水平及其意義研究

黃盈瑞，陳 潔，周玲玲，梁 勇

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·論著·

甲狀腺乳頭狀癌組織中Smad4基因表達(dá)水平及其意義研究

黃盈瑞，陳 潔，周玲玲，梁 勇

目的 探討Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)水平及其意義。方法 選取2013年1—8月臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科收治的甲狀腺乳頭狀癌患者20例作為甲狀腺乳頭狀癌組，另選取同期本院收治的行結(jié)節(jié)性甲狀腺腫手術(shù)患者20例作為對(duì)照組。收集甲狀腺乳頭狀癌組甲狀腺乳頭狀癌手術(shù)切除組織，對(duì)照組結(jié)節(jié)性甲狀腺腫手術(shù)中腺腫旁正常組織。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)兩組Smad4陽(yáng)性表達(dá)率；Western blotting法檢測(cè)兩組Smad4表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組Smad4 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 甲狀腺乳頭狀癌組Smad4陽(yáng)性表達(dá)率為35.0%(7/20)，低于對(duì)照組的90.0%(18/20)(χ2=10.667，P=0.001)。不同性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的甲狀腺乳頭狀癌患者Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。甲狀腺乳頭狀癌組Smad4表達(dá)水平為(0.352±0.012)，低于對(duì)照組的(0.722±0.007)(t=46.130，P<0.001)。Smad4在甲狀腺乳頭狀癌組和對(duì)照組中均有表達(dá)，甲狀腺乳頭狀癌組Smad4 mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的(0.348±0.006)倍。結(jié)論 Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)下調(diào)，Smad4基因的表達(dá)缺失和下調(diào)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Smads信號(hào)通路受抑制是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制之一。

甲狀腺腫瘤；癌，乳頭狀；Smad4基因；信號(hào)傳導(dǎo)

黃盈瑞，陳潔，周玲玲，等.甲狀腺乳頭狀癌組織中Smad4基因表達(dá)水平及其意義研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(32)：3961-3965.[www.chinagp.net]

HUANG Y R，CHEN J，ZHOU L L，et al.Expression and significance of Smad4 gene in papillary thyroid cancer[J].Chinese General Practice，2016，19(32)：3961-3965.

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Smads信號(hào)通路參與胚胎細(xì)胞和組織細(xì)胞的多項(xiàng)活動(dòng)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等[1]，Smad4基因作為該信號(hào)通路的核心調(diào)控蛋白，被廣泛證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)，其突變失活可導(dǎo)致組織細(xì)胞過(guò)度增長(zhǎng)而發(fā)生癌變[2]。但Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)與調(diào)控國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究主要探查Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)水平及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1—8月臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科收治的甲狀腺乳頭狀癌患者20例作為甲狀腺乳頭狀癌組，其中男3例，女17例；年齡21～59歲，平均年齡(44.6±7.2)歲，<45歲6例，≥45歲14例；腫瘤直徑0.6～3.7 cm，平均腫瘤直徑(1.6±0.1)cm，≤1.0 cm者3例，>1.0 cm者17例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ期7例；患者術(shù)前均未行放療或化療，術(shù)后經(jīng)病理科切片明確診斷為甲狀腺乳頭狀癌。另選取同期本院收治的行結(jié)節(jié)性甲狀腺腫手術(shù)患者20例作為對(duì)照組，其中男5例，女15例；年齡23～65歲，平均年齡(42.3±11.4)歲。

1.2 方法 收集兩組患者的組織標(biāo)本，其中甲狀腺乳頭狀癌組標(biāo)本來(lái)源于甲狀腺乳頭狀癌手術(shù)切除組織，對(duì)照組標(biāo)本來(lái)源于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫手術(shù)中腺腫旁正常組織；每份標(biāo)本取其中一半置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；標(biāo)本其余部分提取蛋白質(zhì)用于Western blotting檢測(cè)，提取RNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Smad4陽(yáng)性表達(dá)率 切片常規(guī)脫水脫蠟處理，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后用3%去離子水孵育，枸櫞酸鈉3 g+枸櫞酸0.4 g配水1 000 ml高壓抗原修復(fù)，清洗擦干后10%山羊血清封閉，滴加一抗Smad4(Santa Cruz公司，1∶100)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫45 min，滴加二抗稀釋液37 ℃孵育1 h，PBS清洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察，判讀結(jié)果。根據(jù)HAHN等[3]半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分，著色強(qiáng)度無(wú)色為0分、淡棕色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；后在高倍鏡(40×)下每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞/視野，共計(jì)2 500個(gè)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)按照<5%、5%～35%、36%～70%、>70%分別計(jì)為0、1、2、3分；將上述兩個(gè)分值相乘得出該組織標(biāo)本的細(xì)胞染色積分，按積分結(jié)果可判為陰性(-)：≤1分，弱陽(yáng)性(+)：2～3分，中度陽(yáng)性(++)：4～5分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：≥6分。

1.2.2 Western blotting法檢測(cè)Smad4表達(dá)水平 每份標(biāo)本取約50 mg，加入裂解液，冰上充分研磨裂解，12 000×g，離心5 min，取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度，取30 μg總蛋白進(jìn)行電泳。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，濃縮膠80 V，分離膠120 V進(jìn)行凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)至聚氯乙烯(PVC)膜上，5%脫脂奶粉搖床封閉1.5 h，PBS清洗加入一抗，Smad4(1∶400)，GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜，二抗室溫?fù)u床孵育2 h，化學(xué)顯色，加入配好的ECL發(fā)光液顯影，在成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Smad4 mRNA表達(dá)水平 取約50 mg組織在液氮中研磨成粉末，常規(guī)Trizol方法提取總RNA，分析純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用TIANGEN Quant cDNA第一鏈合成試劑盒KR103，20 μl體系，PCR檢測(cè)使用TIANGEN Real Master Mix PF202試劑盒，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、68 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)，最終95 ℃延伸15 s；降溫至60 ℃ 60 s；然后按每15 s上升0.3 ℃至95 ℃后，保持15 s。分別收集熒光信號(hào)，進(jìn)行熔解曲線分析?；蛞镉缮虾＝萑鹕锕こ逃邢薰竞铣?，引物序列Smad4上游引物5′-CCTTGCAACGTTAGCTGTTG-3′，下游引物5′-CTTCAGTGGACAACGATG-3′；GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。Smad4 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組和對(duì)照組的表達(dá)結(jié)果采用相對(duì)定量2-ΔΔCt方法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 Smad4在胞核和胞質(zhì)中均有陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1，本文彩圖詳見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)，甲狀腺乳頭狀癌組Smad4陽(yáng)性表達(dá)率為35.0%(7/20)，對(duì)照組Smad4陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%(18/20)，甲狀腺乳頭狀癌組Smad4陽(yáng)性表達(dá)率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.667，P=0.001)。

注：A為Smad4在正常甲狀腺組織中的陰性表達(dá)，B為Smad4在正常甲狀腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)，C為Smad4在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陰性表達(dá)，D為Smad4在甲狀腺乳頭狀癌組中的陽(yáng)性表達(dá)

2.2 不同臨床病理特征的甲狀腺乳頭狀癌患者Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較 不同性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的甲狀腺乳頭狀癌患者Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

表1 不同臨床病理特征的甲狀腺乳頭狀癌組患者Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較(n/N)

2.3 Western blotting結(jié)果 以Smad4目的條帶與GAPDH內(nèi)參條帶的灰度值比作為Smad4的相對(duì)表達(dá)水平，甲狀腺乳頭狀癌組Smad4表達(dá)水平為(0.352±0.012)，低于對(duì)照組的(0.722±0.007)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=46.130，P<0.001，見(jiàn)圖2)。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌組和對(duì)照組Smad4表達(dá)水平Western blotting檢測(cè)結(jié)果

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 經(jīng)紫外分光測(cè)定標(biāo)本組織OD值為1.87，RNA提取物純度較好，瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)18、28 s兩條條帶(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明提取RNA完整性較好，無(wú)降解。Smad4在甲狀腺乳頭狀癌組和對(duì)照組中均有表達(dá)，甲狀腺乳頭狀癌組Smad4 mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的(0.348±0.006)倍。

圖3 RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

Smad4基因位于人染色體18q21.1位點(diǎn)，具有2 680 bp轉(zhuǎn)錄單位，編碼552個(gè)氨基酸。1996年，在胰腺癌患者的腫瘤細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了Smad4基因的缺失[4]，研究者們又陸續(xù)在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膽管癌等其他眾多腫瘤中發(fā)現(xiàn)Smad4基因普遍呈低表達(dá)[2，5]。Smad4是TGF-β/Smads信號(hào)通路中的核心調(diào)控蛋白，同時(shí)也參與MAPK、PI3K等信號(hào)通路的調(diào)控，在腫瘤的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起重要作用[6]。在正常組織細(xì)胞，TGF-β信號(hào)與Ⅱ型受體結(jié)合形成復(fù)合物激活Ⅰ型受體使其磷酸化，再與R-Smad結(jié)合，活化的復(fù)合物結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Smad4至細(xì)胞核參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7]。當(dāng)Smad4基因發(fā)生突變，TGF-β/Smads信號(hào)通路對(duì)腫瘤的抑制作用也隨之發(fā)生變化，容易誘導(dǎo)癌變的發(fā)生。

Smad4基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已被探討，但目前關(guān)于其在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)與調(diào)控的研究并不多，甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤[8]，在全球的發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，我國(guó)沿海地區(qū)也是甲狀腺癌的高發(fā)地區(qū)之一[9]。D′INZEO等[10]對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC-1與BCPAP進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Smad4基因在TPC-1與BCPAP細(xì)胞中均表現(xiàn)為明顯下調(diào)，其通過(guò)介導(dǎo)TGF-β信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖與侵襲等行為。本研究選取20例甲狀腺乳頭狀癌組織和20例甲狀腺結(jié)節(jié)腺腫旁正常組織，通過(guò)免疫組織化學(xué)、Western blotting、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在蛋白水平和mRNA水平探查Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)。結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組Smad4陽(yáng)性表達(dá)率低于對(duì)照組；且甲狀腺乳頭狀癌組Smad4低表達(dá)與性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期無(wú)關(guān)；Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組Smad4及其mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，證實(shí)Smad4基因在甲狀腺乳頭狀癌中呈低表達(dá)，Smad4基因的失活在甲狀腺乳頭狀癌與其他腫瘤中普遍存在。

抑癌基因Smad4作為T(mén)GF-β/Smads信號(hào)通路的核心調(diào)控蛋白在眾多腫瘤中的低表達(dá)被廣泛證實(shí)[11]，其失活常被認(rèn)為是18q21染色體突變引起，但是否有更多原因?qū)е耂mad4基因的低表達(dá)還在進(jìn)一步研究中。AITCHISON等[12]在對(duì)前列腺癌標(biāo)本和細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)18q21染色體上的基因突變，但發(fā)現(xiàn)Smad4基因的低表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化密切相關(guān)。SAMEER等[13]也在腸癌中發(fā)現(xiàn)Smad4基因啟動(dòng)子存在甲基化。甲狀腺乳頭狀癌組織中Smad4基因的低表達(dá)是否也與其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化有關(guān)，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探查。同時(shí)，microRNA的調(diào)控也是Smad4基因低表達(dá)的可能機(jī)制之一。ZHANG等[14]在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Smad4基因表達(dá)受microRNA-199a的調(diào)控，其主要靶點(diǎn)位于Smad4基因的UTR區(qū)；HIRATA等[15]對(duì)膀胱癌細(xì)胞的microRNA-182-5p進(jìn)行沉默干擾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Smad4基因表達(dá)上調(diào)，腫瘤細(xì)胞增殖變緩，可見(jiàn)microRNA-182-5p對(duì)膀胱癌中的Smad4基因起調(diào)控作用。LIU等[16]則發(fā)現(xiàn)microRNA-146a在成纖維肌細(xì)胞中對(duì)Smad4基因起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。隨著microRNA對(duì)靶基因的調(diào)控越來(lái)越多的被研究和證實(shí)，可確認(rèn)microRNA對(duì)腫瘤Smad4基因起調(diào)控作用，但是一種microRNA還是多種microRNA一起參與調(diào)控目前還在廣泛研究中，甲狀腺癌中是否也存在microRNA調(diào)控Smad4基因的表達(dá)是本課題組下一步實(shí)驗(yàn)研究范疇之一。

Smad4是一種抑癌基因，其編碼的蛋白主要參與TGF-β信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)也參與MAPK等信號(hào)通路的調(diào)控[17]。Smad4基因的異常常導(dǎo)致上述信號(hào)通路的改變，從而促使細(xì)胞癌變。目前對(duì)Smad4的研究尚待進(jìn)一步的深入，對(duì)于Smad4調(diào)節(jié)的靶基因及調(diào)節(jié)機(jī)制是否是其他信號(hào)通路與TGF-β/Smads信號(hào)通路的整合點(diǎn)之一，并發(fā)揮何種作用，Smad4基因失活的機(jī)制等均需要進(jìn)一步的研究與證實(shí)。對(duì)Smad4基因的深入研究不僅對(duì)了解細(xì)胞調(diào)控機(jī)制及腫瘤的形成發(fā)展有重要意義，并對(duì)腫瘤的分子診斷和治療有著更迫切的現(xiàn)實(shí)意義。

作者貢獻(xiàn)：黃盈瑞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；陳潔、周玲玲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；梁勇進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Expression and Significance of Smad4 Gene in Papillary Thyroid Cancer

HUANGYing-rui，CHENJie，ZHOULing-ling，LIANGYong.TaizhouUniversityMedicalSchool，Taizhou318000，China

LIANGYong，TaizhouUniversityMedicalSchool，Taizhou318000，China；E-mail：hhhyr@163.com

Objective To explore the expression and significance of Smad4 gene in papillary thyroid cancer(PTC).Methods From January to August in 2013，20 cases of PTC admitted to Department of Tumor Surgery of Affiliated Hospital of Taizhou University were enrolled as the PTC group，and 20 patients with nodular goiter accepted surgery in the same period were enrolled as the control group.Surgically resected tissue of PTC in the PTC group and normal thyroid tissue adjacent to nodular goiter in the control group were collected.The positive expression of Smad4 protein in two groups was observed using immunohistochemistry，the expression level of Smad4 protein in two groups was detected using Western blotting and the expression level of Smad4 mRNA using real time-PCR.Results The positive expression rate of Smad4 protein in PTC group was 35.0%(7/20)，which was lower than 90.0%(18/20)in the control group(χ2=10.667，P=0.001).There was no statistically significant difference in the positive expression rate of Smad4 protein in the PTC patients among gender，age，tumor diameter，lymph node metastases and clinical stage of PTC(P>0.05).The expression of Smad4 protein in PTC group was(0.352±0.012)，which was lower than that in control group(0.722±0.007)(t=46.130，P<0.001).Smad4 gene expressed in both PTC and control group，the expression level of Smad4 mRNA in PTC tissue was(0.348±0.006) time as much as control group.Conclusion The expression of Smad4 gene was down-regulated in PTC.The inhibition of TGF-β/Smads signal pathway caused by the loss and down-regulation of Smad4 gene expression might be the possible mechanisms of the occurrence and development of PTC.

Thyroid neoplasms；Carcinoma，papillary；Smad4 gene；Signal transduction

2014年浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY14H160036)；2014年臺(tái)州學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目(2014QN028)

318000浙江省臺(tái)州市，臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院

梁勇，318000浙江省臺(tái)州市，臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院；E-mail：hhhyr@163.com

R 736.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.32.013

2016-02-02；

2016-08-20)