表柔比星聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球的制備及抗腫瘤活性研究

劉 煒，王曉彤，劉 菊（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

表柔比星聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球的制備及抗腫瘤活性研究

劉 煒＊，王曉彤，劉 菊（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

目的：制備表柔比星聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球，并考察其體外抗腫瘤活性。方法：以PLGA為載體，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備表柔比星PLGA微球。利用透射電子顯微鏡觀察微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)，激光粒度分布測量儀檢測其粒徑分布；紫外分光光度法測定其主藥含量，計(jì)算載藥量和包封率；通過體外釋放試驗(yàn)考察10 d內(nèi)的累積釋放度；采用MTT法檢測所制微球和表柔比星對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率。結(jié)果：所制表柔比星PLGA微球的粒徑為（175.2±16.8）μm，載藥量為（8.6± 1.3）%，包封率為（46.7±8.6）%（n＝7）；4 h、24 h、10 d累積釋放度分別為27.8%、41.7%、92.3%。與表柔比星比較，表柔比星PLGA微球能延長對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率至96 h（表柔比星48 h的抑制率為96.7%，表柔比星PLGA微球96 h的抑制率為99.3%）。結(jié)論：成功制得表柔比星PLGA微球，其具有良好的體外緩釋效果和抗腫瘤活性。

表柔比星；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；微球；抗腫瘤活性

化學(xué)藥物治療是當(dāng)前最常用的腫瘤治療手段，但由于大部分化療藥物對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性，因此化療反應(yīng)率低，易引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，從而限制了其臨床應(yīng)用[1-2]。將藥物制成微球后，由于微球中藥物的緩釋性，可以延長藥作用時(shí)間，提高生物利用度，降低毒副作用，增強(qiáng)療效，因此微球已成為近年來研究的熱點(diǎn)[3-4]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一類人工合成的親脂性多聚物材料，具有良好的生物相容性和可生物降解性，在體內(nèi)降解成乳酸和羥基乙酸，最終代謝為水和二氧化碳，無毒性和免疫原性[5]，近年來常應(yīng)用于化療藥物和抗生素的緩釋研發(fā)，部分已應(yīng)用于臨床[6-7]。本研究選擇PLGA作為藥物載體包封材料，選擇表柔比星作為包裹藥物，制備表柔比星PLGA微球，考察其載藥量、包封率、體外釋藥和抗腫瘤活性，為開發(fā)抗腫瘤藥物的新型給藥系統(tǒng)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

JEM-200C透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Lambda25紫外-可見分光光度計(jì)（美國鉑金埃爾默公司）；Zetasizer-3000激光粒度分布測量儀（英國Malvern公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸表柔比星（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：150309，規(guī)格：每支10 mg）；聚乙烯醇（PVA，美國Sigma公司，批號：150309）；PLGA[中國科學(xué)院成都有機(jī)研究所，批號：111367，丙交酯（LA）-乙交酯（GA）（50∶50）]。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由中國科學(xué)院成都有機(jī)研究所提供。

2 方法

2.1 微球的制備

將注射用鹽酸表柔比星配制成質(zhì)量濃度為4 mg/ml的表柔比星水溶液，緩慢加入質(zhì)量濃度為25 mg/ml的PLGA二氯甲烷溶液中，超聲1 min后形成初乳，滴加到15 ml 1%PVA溶液中，繼續(xù)超聲乳化1 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使二氯甲烷揮發(fā)完全，混懸液即為表柔比星PLGA微球混懸液。10 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，將沉淀用超純水洗滌并離心3次，冷凍干燥得固化的表柔比星PLGA微球。

2.2 微球的形態(tài)及粒徑分布

將表柔比星PLGA微球粉末均勻分散地黏附于導(dǎo)電膠上，表面噴鍍金膜，在透射電子顯微鏡下觀察微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)。取表柔比星PLGA微球分散于2 ml超純水中，應(yīng)用激光粒度分布測量儀測定微球的平均粒徑和分布。

2.3 表柔比星線性關(guān)系考察

精密稱取注射用鹽酸表柔比星10 mg，置于50 ml量瓶中，加入水溶解并稀釋至刻度，得到鹽酸表柔比星溶液。取稀釋至系列梯度濃度的表柔比星溶液，采用可見光480 nm作為表柔比星的檢測波長，測定吸光度（A）。以表柔比星的質(zhì)量濃度（c）與其對應(yīng)的A值作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 微球載藥量與包封率的測定

精密稱取表柔比星PLGA微球10 mg，加入10 ml超純水中，形成表柔比星PLGA微球混懸液；再加入二氯甲烷1 ml，超聲10 min，待PLGA充分溶解后，4 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min。吸取全部上清液，在480 nm波長處檢測A，代入回歸方程計(jì)算表柔比星含量。按公式計(jì)算包封率和載藥量，包封率（%）＝微球中藥物質(zhì)量/投入的藥物總量×100%；載藥量（%）＝微球中藥物質(zhì)量/微球的質(zhì)量×100%。

2.5 體外釋放試驗(yàn)

稱取定量的表柔比星PLGA微球，分散于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，置于密封透析袋內(nèi)，PBS為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于37℃恒溫水浴振搖，分別于1、2、4、6、8、10、12、24、48、96、144、192、240 h吸取釋放接收液2 ml，并補(bǔ)入空白釋放介質(zhì)2 ml。于480 nm波長處測定各時(shí)間點(diǎn)釋放接收液的吸光度，計(jì)算累積釋放度，繪制釋放曲線。另稱取適量注射用鹽酸表柔比星，按照上述相同方法考察鹽酸表柔比星對照品的釋藥特性。

2.6 體外抗腫瘤試驗(yàn)

應(yīng)用MTT法檢測表柔比星PLGA微球?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞的抑制率，用0.25%胰酶消化細(xì)胞后稀釋至細(xì)胞密度為5×106L－1的細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板中，每孔加入200 μl懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，分別加入待測藥物，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。以表柔比星PLGA微球中表柔比星的含量作為定量，取相同含量的表柔比星作為陽性對照，試驗(yàn)分為對照組（不加藥）、表柔比星組和表柔比星PLGA組，每組5個(gè)平行孔。分別處理12、24、48、72、96 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μl質(zhì)量濃度為0.5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加入200 μl的二甲基亞砜（DMSO）。用酶標(biāo)儀于570 nm波長檢測各孔光密度（OD）。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率＝（1－給藥組OD值/對照組OD值）×100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 微球的基本特性

表柔比星的回歸方程為c＝36.205A－0.315 8（r＝0.999 75），檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.01～0.1 mg/ml。所制備的表柔比星PLGA微球呈規(guī)則圓整的球狀，分散性良好，平均粒徑為（175.2±16.8）μm，載藥量為（8.6±1.3）%，包封率為（46.7± 8.6）%（n＝7）。表柔比星PLGA微球的透射電鏡圖見圖1。

圖1 表柔比星PLGA微球的透射電鏡圖（×200）Fig 1 TEM photos of epirubicin-loaded PLGA microspheres（×200）

3.2 體外釋放分析

表柔比星PLGA微球在前4 h釋放較快，累積釋放度迅速達(dá)27.8%；此后微球釋放平穩(wěn)緩慢，24 h累積釋放度為41.7%；10 d累積釋放度為92.3%。此現(xiàn)象原因在于部分未包封藥物游離在微球表面，被迅速釋放出來，引起前期若干小時(shí)的迅速釋放；后期被包裹在微球內(nèi)部的表柔比星逐漸釋放出來，因此該階段的釋放緩慢。表柔比星PLGA微球和表柔比星的24 h內(nèi)以及表柔比星PLGA微球10 d內(nèi)的體外釋放曲線見圖2。

圖2 體外釋放曲線Fig 2 The release curves in vitro

3.3 體外抗腫瘤活性

表柔比星PLGA微球和表柔比星對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用，表柔比星PLGA微球和表柔比星對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外抑制作用在96 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，抑制作用增強(qiáng)。表柔比星和表柔比星PLGA微球在12、24 h時(shí)的增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。48 h時(shí)表柔比星的細(xì)胞增殖抑制率為96.7%，此后進(jìn)入平臺期。表柔比星PLGA微球在48 h時(shí)的增殖抑制率為62.3%，顯著低于表柔比星（P＜0.05）；在96 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率為99.3%，與表柔比星比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表柔比星PLGA微球和表柔比星對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制曲線見圖3。

4 討論

化學(xué)治療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞、延長腫瘤患者生存期的同時(shí)，由于其選擇性較低，易產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，限制了其臨床應(yīng)用。近年來采用降解生物材料為囊材包裹化療藥物制備載藥微球的研究和應(yīng)用越來越廣泛，其中PLGA是廣泛用作控釋和緩釋給藥系統(tǒng)的一種合成高分子材料。其制備的微球體系具有以下特點(diǎn)：能夠控制微球的大小，延長藥物釋放時(shí)間，降低藥物毒副作用和刺激性[8]。目前已報(bào)道的應(yīng)用PLGA包裹的化療藥物有氟尿嘧啶、多柔比星、絲裂霉素、喜樹堿等[9]。

圖3 表柔比星PLGA微球和表柔比星對MCF-7細(xì)胞的抑制曲線Fig 3 The proliferation inhibitory curves of epirubicin-loaded PLGAmicrospheres and epirubicin to MCF-7 cells

表柔比星是阿霉素的同分異構(gòu)體，通過直接嵌入DNA堿基對之間、干擾轉(zhuǎn)錄過程、阻止mRNA的形成而發(fā)揮抗腫瘤作用，對乳腺癌、惡性淋巴瘤、頭頸部癌等多種腫瘤均具有顯著的抑制作用[10]。本研究利用載藥微球技術(shù)制備表柔比星PLGA微球，探討其對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的毒性作用，以尋找適合臨床應(yīng)用的藥物傳遞系統(tǒng)。

本文以PLGA作為緩釋載體、PVA為交聯(lián)劑，制備表柔比星PLGA微球。經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，微球表面光滑規(guī)則；經(jīng)測定，載藥量為（8.6±1.3）%，包封率為（46.7±8.6）%。包封率和載藥量是評價(jià)微球體系的重要參考指標(biāo)，包封率是指包裹進(jìn)入微球的藥量與投藥量的比值，包封率越高，說明制備條件控制越好。而載藥量則與具體的治療所需藥物濃度相關(guān)[11]。由于表柔比星作為一種化療藥，其活性很高，較小的用藥劑量、較低的載藥量就能滿足臨床治療。

通過對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表柔比星PLGA微球?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞有顯著的抑制效果，其抑制細(xì)胞增殖的作用首先與納米微球的緩釋特性有關(guān)。微球?qū)⑺幬锇趦?nèi)部，隨著微球的降解，藥物緩慢釋放出來，達(dá)到長效治療的目的，因此達(dá)到減少給藥次數(shù)、提高藥物利用率的目的。其次與納米微球進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)。載藥微球以細(xì)胞內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，其荷載的藥物在胞質(zhì)中被釋放[12-13]，長效持久地作用于腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮殺傷效應(yīng)[12，14]。已有相關(guān)研究報(bào)道，以PLGA為載體制備的藥物納米微球通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并使藥物在細(xì)胞內(nèi)緩慢釋放[15]。表柔比星PLGA微球在96 h時(shí)對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖抑制率達(dá)99.3%，而表柔比星在96 h時(shí)抑制率為99.1%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這提示表柔比星能從載藥微球中緩慢釋放出來，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，且其效應(yīng)未受到載藥材料的影響。

綜上所述，本研究所制備的表柔比星PLGA微球具有良好的緩釋效果。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on Preparation and Antitumor Activity of Epirubicin-loaded PLGA Microspheres

LIU Wei，WANG Xiaotong，LIU Ju（Dept.of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China）

OBJECTIVE：To prepare epirubicin-loaded PLGA microspheres and study its in vitro antitumor activity.METHODS：Using PLGA as carrier，epirubicin-loaded PLGA microspheres were prepared by using emulsification-solvent evaporation method.The morphology of microspheres was observed by TEM；the distribution of particle size was determined by laser granularity distribution measuring instrument；the content of main component was determined by UV spectrophotometry.The drug-loading amount and entrapment efficiency were calculated，and accumulative release rate（Q）was investigated by in vitro release test within 10 d.The proliferation inhibitory rates of prepared microspheres and epirubicin to human breast cancer MCF-7 cells were detected by MTT assay.RESULTS：The particle size，drug-loading amount and encapsulation efficiency of epirubicin-loaded PLGA microspheres were（175.2±16.8）μm，（8.6±1.3）%and（46.7±8.6）%（n＝7）；Q4h，Q24hand Q10dwere 27.8%，41.7%and 92.3%，respectively.Compared with epirubicin，epirubicin-loaded PLGA microspheres could prolong inhibitory rate of epirubicin to MCF-7 cells for 96 h（48 h inhibitory rate of epirubicin was 96.7%，96 h proliferation inhibitory rate of Epirubicin-loaded PLGA microspheres was 99.3%）.CONCLUSIONS：Epirubicin-loaded PLGA microspheres are prepared successfully，and show good in vitro sustained-release effect and antitumor activity.

Epirubicin；PLGA；Microspheres；Antitumor activity

R943；R736

A

1001-0408（2016）34-4845-03

2016-03-26

2016-07-05）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥物制劑。電話：010-63926411。E-mail：liuwei8090@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.29