從細胞自噬角度探討紫草多糖抑制H22肝癌實體瘤細胞增殖的作用機制

陳 奇，陳松海，陳小凱（廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥學(xué)部，廣州 510080）

從細胞自噬角度探討紫草多糖抑制H22肝癌實體瘤細胞增殖的作用機制

陳 奇＊，陳松海，陳小凱（廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥學(xué)部，廣州 510080）

目的：探討紫草多糖是否通過誘導(dǎo)自噬而抑制H22肝癌實體瘤細胞的增殖。方法：將40只KM小鼠隨機分為模型組、環(huán)磷酰胺組（陽性藥物，30 mg/kg，ip，每4 d給藥1次）和紫草多糖低、高劑量組（100、300 mg/kg，ig，每天給藥1次），每組10只。各組小鼠均腋下接種H22細胞株復(fù)制H22肝癌實體瘤模型，造模同時各給藥組小鼠給予相應(yīng)藥物，模型組小鼠ig等體積生理鹽水。末次給藥后，記錄并測定小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量系數(shù)和胸腺、脾臟指數(shù)；采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法測定小鼠瘤組織中自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA表達水平；Western blot法測定瘤組織中自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3A/B（LC3A/B）蛋白表達水平。結(jié)果：紫草多糖可顯著降低H22實體瘤小鼠的瘤質(zhì)量系數(shù)，抑瘤率達34.7%；可顯著上調(diào)瘤組織中自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA的表達和LC3A/B蛋白的表達，較模型組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：紫草多糖通過促進肝癌細胞的自噬，從而抑制H22肝癌實體瘤細胞的增殖、延緩腫瘤生長。

紫草多糖；自噬；H22肝癌實體瘤；小鼠；增殖

紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或內(nèi)蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根，春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥即得[1]。研究表明，紫草具有多種生理、藥理活性，如抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病原微生物、抗腫瘤等[2]，具有涼血活血、解毒透疹等功效。紫草多糖是紫草中一種重要的活性成分，也是紫草發(fā)揮抗腫瘤作用的主要活性成分，對多種腫瘤（如宮頸癌U14實體瘤、S180腹水瘤等）均具有明顯的抑制作用[3-4]。自噬是一種依賴溶酶體的胞內(nèi)降解過程，普遍存在于真核細胞中，細胞通過自噬能清除細胞中損傷或衰老的細胞器及生物大分子，是一種維持自身穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機制[5]，影響著細胞的多種生理功能。研究表明，自噬與腫瘤細胞的增殖存在一定關(guān)系，促進自噬可以抑制腫瘤細胞的增殖[6]。目前，尚未見關(guān)于紫草多糖對人H22肝癌實體瘤的增殖及自噬水平的影響的研究，故本研究從H22肝癌實體瘤增殖情況、小鼠免疫和自噬水平出發(fā)，考察紫草多糖對H22肝癌實體瘤小鼠的免疫、自噬水平和瘤細胞增殖的影響，旨在從自噬角度考察紫草多糖抑制H22肝癌實體瘤的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

EL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；MEGAFUGE2.0R低溫高速離心機（德國Hermle公司）；7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）儀（美國ABI公司）；Tanon 5200天能凝膠成像系統(tǒng)（上海天能化學(xué)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號：20140308，規(guī)格：每支0.2 g）；自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3A/B（LC3A/B）抗體（美國CST公司）；內(nèi)參GAPDH抗體（上海吉泰依科賽生物科技有限公司）；羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Abbkine公司）；PCR試劑盒、RNA提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，批號：K6101、A7505-1）；其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

紫草（康美藥業(yè)股份有限公司，批號：140513），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)博物館張秋鎮(zhèn)副教授鑒定為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.的干燥根。

1.4 細胞株與動物

小鼠肝癌H22瘤株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心（資源編號：3111C0001CCC000309）。SPF級KM小鼠40只，♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0020]，自由攝食，在室溫為20～25℃、相對濕度為50%～70%、晝夜循環(huán)（12 h∶12 h）的環(huán)境下飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 紫草多糖的制備

取干燥紫草200 g，按照文獻[7]中方法提取紫草多糖，得紫草粗多糖9.34 g（得率為4.67%）。經(jīng)苯酚-硫酸法測定多糖含量為20.31%，用生理鹽水溶解成以粗多糖計質(zhì)量濃度分別為100、300 mg/ml的溶液，過濾除菌，分裝后于4℃條件下保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為4組，分別為模型組、環(huán)磷酰胺（陽性藥物）組和紫草多糖低、高劑量組，每組10只。各組小鼠均采用腋下接種H22肝癌細胞株復(fù)制H22實體瘤小鼠模型[7]。造模5 d左右，可在接種部位摸到小圓球的實體腫瘤塊，提示造模成功。在造模同時給藥，紫草多糖低、高劑量組小鼠分別ig紫草多糖100、300 mg/kg（給藥劑量依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置），每天1次，連續(xù)3周；環(huán)磷酰胺組小鼠ip環(huán)磷酰胺30 mg/kg（根據(jù)臨床給藥劑量換算而得），每4天給藥1次，連續(xù)3周，共給藥5次；模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)3周。

2.3 標本收集

小鼠末次給藥后禁食12 h，稱定體質(zhì)量，然后頸椎脫臼處死，剪取腫瘤塊組織，稱定瘤質(zhì)量并計算瘤質(zhì)量系數(shù)[瘤質(zhì)量系數(shù)＝瘤質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）]和抑瘤率[抑瘤率＝（模型組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%]。剪取瘤組織于－80℃條件下保存，備用。剪取胸腺、脾臟，稱定質(zhì)量并計算臟器指數(shù)[臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）]。

2.4 RT-PCR法測定瘤組織中自噬相關(guān)基因mRNA的表達水平

嚴格按RNA提取試劑盒說明書提取瘤組織總RNA，加入20 μl無RNA酶水溶解沉淀；核酸蛋白分析儀檢測A260/A280值，比值大于1.8而小于2.2為宜。將RNA逆轉(zhuǎn)錄后進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Primer Express 5.0軟件在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列：Atg5，上游為5′-GCCTTTCATCCAGAAGCTG-3′，下游為5′-TCATCACCTGGCTCCTCTTC-3′，產(chǎn)物長度為131 bp；Beclin1，上游為5′-AGCCTCTGAAACTGGACACG-3′，下游為5′-CCTCTTCCTCCTGGGTCTCT-3′，產(chǎn)物長度為117 bp。反應(yīng)體系：cDNA 2.4 μl，SYBR Premix Ex TaqⅡ混合物10 μl，上、下游引物各0.4 μl，校正染料ROX Reference DyeⅡ0.4 μl，蒸餾水6.8 μl，體系共20 μl；反應(yīng)條件：95℃、30 s，95℃、15 s，60℃、1 min，共40個循環(huán)，進行PCR擴增。以擴增公式2－ΔΔct對目的基因mRNA的表達量進行分析計算。

2.5 Western blot法測定瘤組織中LC3A/B蛋白的表達水平

取瘤塊加入裂解液，全自動勻漿機制備瘤組織勻漿，離心后得到總蛋白提取物；采用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒說明書配制10%分離膠和5%濃縮膠。上樣：每20 μl蛋白提取液加入5 μl加樣緩沖液（Loading buffer，5×），將樣品（20 μl）和預(yù)染標志蛋白（Marker）5 μl上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)。恒壓80 V、20 min跑濃縮膠，恒壓120 V、110 min跑分離膠。電泳后取出凝膠，200 mA恒流轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜45 min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用TBST緩沖液搖床洗膜，5%小牛血清蛋白（BSA）封閉1 h。根據(jù)一抗的說明書，采用5%BSA封閉液稀釋一抗LC3A/B（1∶1 000）、內(nèi)參GAPDH抗體（1∶500），4℃孵育過夜；室溫孵育羊抗兔IgG二抗90 min，TBST洗膜。利用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)進行發(fā)光檢測，Image Pro Plus 6.0軟件分析凝膠圖像的光密度值。以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶光密度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 紫草多糖對H22荷瘤小鼠臟器系數(shù)的影響

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠的脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)均顯著降低（P＜0.01），這提示環(huán)磷酰胺對小鼠脾臟和胸腺有較強毒性，對免疫系統(tǒng)具有明顯的抑制作用；而紫草多糖低、高劑量紫草多糖均可一定程度地增加H22荷瘤小鼠脾臟、胸腺系數(shù)，這提示紫草多糖可一定程度改善小鼠免疫系統(tǒng)功能，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果詳見表1。

表1 各組小鼠臟器系數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Viscera indexes of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠臟器系數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Viscera indexes of mice in each group（±s，n＝10）

注：與模型組比較，＊＊P＜0.01Note：vs.model group，＊＊P＜0.01

組別模型組環(huán)磷酰胺組紫草多糖低劑量組紫草多糖高劑量組劑量，mg/kg 30 100 300胸腺系數(shù)，mg/g 2.42±1.07 0.66±0.39＊＊3.01±1.13 3.20±1.07脾臟系數(shù)，mg/g 3.24±0.75 1.14±0.43＊＊3.50±1.05 3.74±1.28

3.2 紫草多糖對H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量系數(shù)和抑瘤率的影響

與模型組比較，各給藥組小鼠瘤質(zhì)量系數(shù)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；低、高劑量紫草多糖對H22肝癌實體瘤有明顯的抑制作用，且抑瘤率隨著劑量增加而升高，結(jié)果詳見表2。

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量系數(shù)和抑瘤率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Tumor weight coefficient and tumor inhibitory rate of mice in each grou（p±s，n＝10）

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量系數(shù)和抑瘤率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Tumor weight coefficient and tumor inhibitory rate of mice in each grou（p±s，n＝10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.model group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組環(huán)磷酰胺組紫草多糖低劑量組紫草多糖高劑量組劑量，mg/kg 30 100 300瘤質(zhì)量系數(shù)，mg/g 38.08±13.01 14.43±5.02＊＊28.02±8.19＊21.12±9.27＊＊抑瘤率，% 54.9 13.5 34.7

3.3 紫草多糖對H22荷瘤小鼠瘤組織中自噬相關(guān)基因mRNA表達的影響

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和紫草多糖低、高劑量組小鼠瘤組織中Atg5、Beclin1 mRNA表達水平均升高（P＜0.05或P＜0.01），這提示紫草多糖可一定程度地促進腫瘤細胞的自噬，從而抑制腫瘤增殖，結(jié)果詳見圖1。

3.4 紫草多糖對H22荷瘤小鼠瘤組織中自噬調(diào)控蛋白LC3A/B蛋白表達的影響

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和紫草多糖低、高劑量組小鼠瘤組織中LC3A/B蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），這提示紫草多糖可通過促進腫瘤細胞的自噬活動從而抑制H22肝癌細胞的異常增殖，結(jié)果詳見圖2、圖3。

圖1 各組小鼠瘤組織Atg5、Beclin1 mRNA表達水平測定結(jié)果注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 1 The mRNA levels of Atg5 and Beclin1 in tumor tissue of mice in each groupNote：vs.model group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖2 各組小鼠瘤組織中LC3A/B蛋白表達測定結(jié)果注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 2 The protein expression of LC3A/B in tumor tissue of mice in each groupNote：vs.model group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖3 各組小鼠瘤組織中LC3A/B蛋白表達電泳圖Fig 3 Electrophorogram of protein expression of LC3A/B in tumor tissue of mice in each group

4 討論

紫草多糖是紫草水溶性提取物，多糖含量在30%左右，具有增強機體特異性和非特異性免疫的作用[8]。此外，紫草多糖還對S180荷瘤小鼠具有明顯的抑瘤作用，其機制與紫草多糖改善紅細胞膜流動性和帶3蛋白有關(guān)[9]，隨后也被證實其可影響荷瘤小鼠紅細胞膜磷脂脂肪酸的含量與組分，增強了膜的流動性，從而調(diào)整紅細胞的免疫功能[10]。此外，紫草多糖還可以誘導(dǎo)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）的生成，增加機體免疫功能，抑制瘤體增殖[3]。本研究結(jié)果表明，紫草多糖對H22肝癌實體瘤的增殖有顯著的抑制作用，高劑量紫草多糖作用下抑瘤率達34.7%；紫草多糖還可以明顯提高H22荷瘤小鼠胸腺、脾臟系數(shù)，這提示紫草多糖可以改善H22荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)功能。

自噬是自噬溶酶體對其包裹的細胞質(zhì)內(nèi)含物進行降解的一種分解代謝過程[11]。自噬過程一般是在營養(yǎng)匱乏的條件下被激活，但是也與一些生理過程有關(guān)，如感染、腫瘤等[12]。自噬與腫瘤的關(guān)系是近年來的研究熱點。自噬在許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中均占有重要地位，其通過溶酶體降解胞質(zhì)蛋白和細胞器，調(diào)控腫瘤細胞的增殖[13]。Atg5是形成自噬體必不可少的蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，Atg5也參與了細胞凋亡，其可被鈣蛋白酶分解，抑制線粒體膜上的B淋巴細胞瘤2基因的活性，進而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細胞凋亡[14]。LC3最初被認定為是微管相關(guān)蛋白1A和1B的一個亞基，對于自噬起著至關(guān)重要的作用。LC3有LC3A、LC3B和LC3C 3種亞型，在自噬過程中翻譯后被修飾，在Atg家族體系蛋白作用下，LC3-Ⅰ被脂質(zhì)化為LC3-Ⅱ，從而將LC3與自噬小泡聯(lián)系起來，影響著細胞的自噬水平[15]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，紫草多糖可以明顯上調(diào)自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1的表達，顯著增加LC3的蛋白水平，與環(huán)磷酰胺作用趨勢一致，這提示紫草多糖可能通過誘導(dǎo)自噬而抑制H22肝癌實體瘤細胞的異常增殖。

綜上，紫草多糖可通過誘導(dǎo)H22肝癌實體瘤細胞的自噬，從而抑制瘤體增殖，但其作用機制有待進一步研究。

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（編輯：林 靜）

Discussion on Inhibitory Effect Mechanism of Lithospermum erythrorhizon Polysaccharide on the Proliferation of H22Hepatoma Solid Tumor Cells in Mice Based on Autophagy

CHEN Qi，CHEN Songhai，CHEN Xiaokai（Dept.of Pharmacy，Guangdong Provincial People’s Hospital/Guangdong Academy of Medical Science，Guangzhou 510080，China）

OBJECTIVE：To investigate whether Lithospermum erythrorhizon polysaccharide inhibit the proliferation of H22hepatoma solid tumor cells in mice through inducing autophagy.METHODS：40 KM mice were randomly divided into model group，cyclophosphamide group（30 mg/kg，ip，once for every 4 d），L.erythrorhizon polysaccharide low-dose and high-dose groups（100，300 mg/kg，ig，once a day），with 10 mice in each group.H22hepatoma solid tumor model was induced of mice in each group by incubating H22cell line.Treatment groups were given relevant medicine during modeling，and model group was given constant volume of normal saline intragastrically.After last medication，body weight，tumor weight coefficient，thymus and spleen index were recorded and determined.The mRNA expression of autophagy related genes，such as Atg5 and Beclin1，were measured by using Real-time PCR.The protein expression of autophagic microtubule-associated protein 3A/B（LC3A/B）was detected by Western blot assay.RESULTS：L.erythrorhizon polysaccharide could significantly reduce tumor weight coefficient of H22solid tumor，with tumor inhibitory rate of 34.7%；it also significantly up-regulated the mRNA expression of autophagy related genes Atg5 and Beclin1 and the protein expression of LC3A/B，with statistical significance compared to model group（P＜0.05 or P＜0.01）. CONCLUSIONS：L.erythrorhizon polysaccharide can inhibit the proliferation of H22hepatoma solid tumor cells and slow down the growth of tumor through promoting hepatoma cell autophagy.

Lithospermum erythrorhizon polysaccharide；Autophagy；H22hepatoma solid tumor；Mice；Proliferation

R965

A

1001-0408（2016）34-4811-03

2016-06-06

2016-10-11）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：020-81884713-80560。E-mail：1466692092@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.18