桔皮素對人肝癌HepG2細胞體外增殖和侵襲的影響及機制研究

孫志欣，張 瑩（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院急癥病房，天津 300193）

桔皮素對人肝癌HepG2細胞體外增殖和侵襲的影響及機制研究

孫志欣＊，張 瑩（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院急癥病房，天津 300193）

目的：考察桔皮素對人肝癌HepG2細胞體外增殖和侵襲的影響，并探討其作用機制。方法：以0（空白對照組）、10、20、40、60、80μmol/L桔皮素分別作用于細胞24、48 h后，采用CCK-8法檢測細胞增殖率，并計算其半數抑制濃度（IC50）。以0、20、30 μmol/L桔皮素作用細胞48 h后，采用Transwell侵襲實驗考察其對細胞侵襲的影響；并分別采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法和Western blot法考察其對細胞中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Notch-1、免疫細胞表面抗原44（CD44）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）mRNA及其蛋白表達的影響；采用Western blot法考察蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的磷酸化水平。結果：10～80μmol/L桔皮素對人肝癌HepG2細胞的體外增殖均具有明顯的抑制作用，且呈時間和劑量依賴性，增殖率較空白對照組顯著降低（P＜0.05），作用24、48 h后的IC50分別為55.7、23.4 μmol/L。20、30 μmol/L桔皮素作用48 h后，細胞侵襲能力明顯受到抑制；細胞中N-cadherin、Vimentin、Notch-1、CD44和MMP-9 mRNA及其蛋白水平表達明顯降低，E-cadherin mRNA及其蛋白表達水平明顯升高，且Akt、GSK-3β磷酸化水平升高，較空白對照組差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：桔皮素可抑制人肝癌HepG2細胞的體外增殖和侵襲；其機制可能與下調細胞中Notch-1表達、抑制細胞的上皮-間質轉化而抑制CD44和MMP-9的表達，以及抑制其上游Akt-GSK-3β信號途徑有關。

桔皮素；人肝癌HepG2細胞；增殖；侵襲；上皮-間質轉化

肝癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，且近年其發(fā)病率和病死率均有上升的趨勢[1]。即使采取以手術為主、化療和放療為輔的方法進行綜合治療，其預后仍不理想[2]。目前，腫瘤轉移仍然是肝癌患者死亡的最主要原因，也是困擾臨床醫(yī)師的主要問題之一[3]。天然黃酮類物質桔皮素（Tangeretin）廣泛存在于蕓香科植物川橘果皮、酸橙果皮和柑橘莖葉中，具有化痰消痞、理氣和胃、抗真菌等功效[4-5]。近年來，大量體外研究證實了其可有效地抑制肝癌、乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的生長、增殖，并具有毒副作用較低的特點[6-9]，是一種具有潛在肝癌治療開發(fā)價值的天然藥物，但其作用機制尚不清楚。基于此，本研究旨在探究桔皮素對人肝癌HepG2細胞增殖和侵襲的影響并探討其作用機制，為將桔皮素開發(fā)用于肝癌的治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Multiskan FC酶標儀（美國Thermo公司）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；7500實時熒光定量聚合酶鏈式（RT-PCR）分析儀（美國ABI公司）；高速離心機（美國Beckman公司）。

1.2 藥品與試劑

桔皮素（南京科朗醫(yī)藥化工有限公司，批號：CS80005，純度：98%）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：C0038）；Trizol總RNA提取試劑盒（武漢科昊佳生物科技有限公司，批號：15596026）；染料法熒光PCR定量（SYBR Premix Ex Taq）試劑盒（批號：RR820A）均購自大連寶生物公司；細胞侵襲試劑盒（美國Corning公司）；抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）和內參β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；Notch-1、免疫細胞表面抗原（CD）44、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK-3β）抗體和辣根過氧化物酶標記兔抗人免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；胎牛血清（FBS）和RPMI 1640細胞培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 細胞

人肝癌HepG2細胞系購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 細胞的維持

將人肝癌HepG2細胞維持于含10%FBS及100 u/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素培養(yǎng)液的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長滿后，常規(guī)更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶溶液消化，以1∶2的比例傳代。

2.2 細胞增殖試驗

按照“2.1”項下條件進行細胞培養(yǎng)，待細胞長滿后更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶溶液消化后進行試驗。將細胞分為空白對照組（即0μmol/L組）和藥物處理組（10、20、40、60、80μmol/L桔皮素），每組設6個復孔，分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入CCK-8溶液10μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，酶標儀測定其在450 nm波長處的吸光度（A）。試驗重復3次，取A平均值計算細胞的增殖率[增殖率（%）＝（藥物處理組平均A值/空白對照組平均A值）×100%]；采用GraphPad Prism 6.0軟件計算半數抑制濃度（IC50）。

2.3 細胞侵襲試驗

按照“2.1”項下條件進行細胞培養(yǎng)，待細胞長滿后更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶溶液消化后進行試驗。將細胞分為空白對照組（0μmol/L）和藥物處理組（20、30 μmol/L桔皮素），培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶溶液消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基混懸細胞密度為5×105個/ml。取200μl細胞混懸液（相當于1×105個細胞）加至Transwell小室，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室用棉簽小心拭去基質膠及上室細胞，4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫室溫染色25 min。顯微鏡下隨機選5個視野進行拍照計數，計算平均每個視野的細胞數，以穿過濾膜進入下室的細胞數來表示細胞的侵襲能力，侵襲抑制率（%）＝（藥物處理組下室細胞數/空白對照組下室細胞數）×100%。試驗重復3次取平均值。

2.4 蛋白印跡試驗

細胞的培養(yǎng)、分組情況同“2.3”項下。培養(yǎng)48 h后，RIPA裂解液裂解細胞，以12 000×g、4℃離心10 min收集總蛋白。取40 μg總蛋白上樣，經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，分別加入稀釋比例為1∶2 000的抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-9抗體和稀釋比例為1∶1 500的抗Notch-1、CD44、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β抗體以及稀釋比例為1∶2 500的抗β-actin（內參）抗體，4℃孵育過夜。以辣根過氧化物酶標記兔抗人IgG二抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光劑發(fā)光、顯影，采用Quntity One軟件進行各蛋白灰度值的測定。以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，以p-Akt、p-GSK-3β蛋白條帶灰度值與Akt、GSK-3β蛋白條帶灰度值的比值表示Akt、GSK-3β的磷酸化水平。

2.5 RT-PCR試驗

細胞的培養(yǎng)、分組情況同“2.3”項下。培養(yǎng)48 h后，采用Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定其濃度，并取2μg總RNA反轉錄合成cDNA。反應程序：94℃預變性3 min；95℃變性50 s，退火30 s，72℃延伸95 s，35個循環(huán)；72℃最后延伸5 min，結束反應。以GAPDH作為內參基因，采用2－ΔΔct法[10]計算目的基因的相對表達量。引物序列、退火溫度及產物大小見表1。

表1 RT-PCR引物、退火溫度及產物大小Tab 1 RT-PCR primer，annealing temperature and product length

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 桔皮素對人肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用

10～80μmol/L桔皮素培養(yǎng)細胞24、48 h后，細胞增殖明顯受到抑制，并具有劑量和時間依賴性，細胞增殖率較空白對照組明顯降低（P＜0.05）；且培養(yǎng)48 h后細胞增殖率較培養(yǎng)24后明顯降低（P＜0.05），結果見圖1。培養(yǎng)24、48 h后的IC50分別為55.7、23.4 μmol/L。

圖1 不同濃度桔皮素作用不同時間后對人肝癌HepG2細胞體外增殖的影響注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與作用24 h比較，#P＜0.05Fig 1 Effects of different concentrations of tangeretin on in vitro proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell after different periodsNote：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.24 h group，#P＜0.05

3.2 桔皮素對人肝癌HepG2細胞體外侵襲的抑制作用

20、30μmol/L桔皮素培養(yǎng)細胞48 h后，對細胞的體外侵襲有明顯的抑制作用，并具有量效關系，細胞的體外侵襲能力分別下降至45.2%和22.1%，較空白對照組明顯降低（P＜0.05），結果見圖2。

圖2 不同濃度桔皮素作用48 h后對人肝癌HepG2細胞侵襲能力的影響（×200）Fig 2 Effects of different concentrations of tangeretin on invasion ability of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells after 48 h（×200）

3.3 桔皮素對人肝癌HepG2細胞中腫瘤相關基因mRNA及其蛋白表達的影響

20、30 μmol/L桔皮素培養(yǎng)細胞48 h后，細胞中N-cadherin、Vimentin、Notch-1、CD44、MMP-9 mRNA及其蛋白表達均顯著下調，E-cadherinin mRNA及其蛋白表達均顯著上調，細胞中Akt、GSK-3β磷酸化水平降低，與空白對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。這提示Akt/GSK-3β信號途徑在桔皮素抑制肝癌細胞侵襲中發(fā)揮著重要作用，結果見圖3、表2、表3。

4 討論

本研究通過CCK-8試驗證實，10～80μmol/L桔皮素能明顯抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，且其抑制作用呈時間和濃度依賴性，培養(yǎng)24、48 h后的IC50為別為55.7、23.4 μmol/L。為了體現桔皮素作用腫瘤細胞的濃度依賴性，并顯示出較好的抑制效果以便于觀察，本研究選取桔皮素培養(yǎng)48 h后IC50上、下兩個濃度（20、30 μmol/L）進行后續(xù)試驗。Transwell小室模型在體外進行腫瘤細胞侵襲能力的檢測，結果發(fā)現桔皮素顯著抑制HepG2細胞的體外侵襲能力。

圖3 不同濃度桔皮素作用48 h后人肝癌HepG2細胞中腫瘤相關基因蛋白表達的電泳圖Fig 3 Electrophoretogram of protein expression of tumor related gene in HepG2 cells after treated with different concentrations of tangeretin for 48 h

表2 不同濃度桔皮素作用48 h后對人肝癌HepG2細胞中腫瘤相關基因蛋白表達的影響（±s，n＝3）Tab 2 Effects of different concentrations of tangeretin on protein expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

表2 不同濃度桔皮素作用48 h后對人肝癌HepG2細胞中腫瘤相關基因蛋白表達的影響（±s，n＝3）Tab 2 Effects of different concentrations of tangeretin on protein expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

基因E-cadherin N-cadherin Vimentin Notch-1 CD44 MMP-9 p-Akt/Akt p-GSK-3β/GSK-3β 0 μmol/L（空白對照組）1.00±0.15 1.00±0.18 1.00±0.17 1.00±0.15 1.00±0.11 1.00±0.16 1.00±0.12 1.00±0.11 20 μmol/L 1.52±0.35＊0.54±0.14＊0.56±0.18＊0.49±0.11＊0.52±0.08＊0.45±0.08＊0.72±0.22＊0.68±0.16＊30 μmol/L 1.72±0.24＊0.47±0.09＊0.41±0.16＊0.40±0.11＊0.36±0.12＊0.35±0.13＊0.62±0.15＊0.58±0.18＊

表3 不同濃度桔皮素作用48 h后對人肝癌HepG2細胞中腫瘤相關基因mRNA表達的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of different concentrations of tangeretin on mRNA expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

表3 不同濃度桔皮素作用48 h后對人肝癌HepG2細胞中腫瘤相關基因mRNA表達的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of different concentrations of tangeretin on mRNA expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

基因E-cadherin N-cadherin Vimentin Notch-1 CD44 MMP-9 0 μmol/L（空白對照組）1.00±0.11 1.00±0.08 1.00±0.07 1.00±0.01 1.00±0.10 1.00±0.04 20 μmol/L 1.52±0.11＊0.54±0.20＊0.56±0.13＊0.49±0.20＊0.52±0.12＊0.45±0.05＊30 μmol/L 1.72±0.14＊0.47±0.12＊0.41±0.12＊0.40±0.02＊0.36±0.11＊0.35±0.03＊

上皮-間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）在細胞侵襲過程中扮演著重要角色，其在EMT過程中使有極性的上皮細胞失去極性，轉換成具有活動能力、能夠在細胞基質間自由移動的間質細胞，使沒有侵襲能力的細胞獲得浸潤能力并最終轉移到其他組織和器官，從而使腫瘤形成局部浸潤和遠端轉移。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是最主要的EMT標志物。細胞中E-cadherin表達減少可導致細胞間連接解體以及細胞分散；N-cadherin以及細胞角蛋白細胞骨架轉化為Vimentin后，細胞骨架重排，形成細胞-基質黏附，引起細胞表型的改變以及細胞運動能力增強。因此，阻斷或逆轉EMT過程有可能會成為腫瘤抗侵襲治療的新途徑。為了探討EMT在桔皮素抑制人肝癌HepG2細胞侵襲的作用，筆者檢測了EMT標志物的表達變化。本研究結果顯示桔皮素可抑制N-cadherin和Vimentin的表達，而使E-cadherin表達量明顯上升，這提示桔皮素可能通過抑制人肝癌HepG2細胞的EMT過程而抑制細胞的侵襲。

Notch信號通路廣泛存在于多種生物體組織細胞中，是一種在進化過程中十分保守的信號轉導系統，該通路對細胞生長、發(fā)育、凋亡等生物學行為有著重要作用[11]?？缒な荏w蛋白Notch-1是Notch信號通路的關鍵蛋白。大量研究表明，Notch-1蛋白在多種腫瘤中異常表達，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤耐藥過程關系密切[12]。MMPs是一組能夠降解ECM的鋅離子（Zn2+）依賴型內肽酶，是能夠降解Ⅳ型膠原的重要基質蛋白酶之一。MMP-9已被證明在ECM降解、新血管生成、腫瘤細胞的生長和凋亡等重要過程，以及在腫瘤侵襲、轉移的復雜過程中起了關鍵性的作用[13]。Notch-1可通過影響Akt-GSK-3β以及下游轉錄因子活性而調節(jié)MMP-9的表達。本研究結果顯示，桔皮素可抑制人肝癌HepG2細胞中Notch-1的表達，而且Notch-1作用下游基因MMP-9的表達也明顯受抑制，這提示桔皮素可能通過調控Notch-1的表達而抑制肝癌細胞的侵襲。

GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Akt最早發(fā)現的直接底物之一。β-鏈蛋白（β-catenin）作為一種細胞骨架蛋白可在胞膜處與E-cadherin形成復合體，對維持細胞間黏附、防止腫瘤轉移而發(fā)揮重要作用。Akt-GSK-3β信號途徑參與細胞的生長分化、凋亡調控以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程?；罨腁kt可以磷酸化GSK，從而拮抗β-catenin的降解，胞漿中β-catenin積聚使其濃度增高，下調E-cadherin表達，進而促進腫瘤細胞運動[14]，最終誘導了EMT，并促進腫瘤的侵襲和轉移。本研究發(fā)現，桔皮素能抑制Akt和GSK-3β的活性，這提示桔皮素可通過調節(jié)Akt-GSK-3β信號途徑抑制肝癌HepG2細胞的增殖和侵襲過程。

綜上所述，本研究證明了桔皮素具有抑制肝癌HepG2細胞增殖和體外侵襲的能力，其機制可能為下調Notch-1表達、抑制細胞Akt-GSK-3β信號途徑和上皮-間質轉化而抑制CD44和MMP-9的表達?？梢?，桔皮素具有較好的抗肝癌細胞增殖和侵襲作用。本研究為桔皮素作為潛在的抗腫瘤藥物應用于臨床提供了實驗基礎和依據。

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（編輯：林 靜）

Effects of Tangeretin on in vitro Proliferation and Invasion of Human Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cells and Its Mechanism Study

SUN Zhixin，ZHANG Ying（Dept.of Emergency Ward，the First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of tangeretin on in vitro proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells，and to investigate its mechanism.METHODS：After treated with 0（blank control group），10，20，40，60，80μmol/L tangeretin for 24，48 h，the rate of cell proliferation was detected by CCK-8 assay，and IC50was calculated.After treated with 0，20，30 μmol/L tangeretin for 48 h，Transwell invasion test was used to investigate the effects of tangeretin on cell invasion.The effects of tangeretin on mRNA and protein expression of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，Notch-1，CD44 and MMP-9 were determined by RT-PCR and Western blot assay.The phosphorylation of Akt and GSK-3β were investigated by Western blot assay.RESULTS：10-80μmol/L tangeretin significantly inhibited in vitro proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells in time and dose-dependent manner；proliferation rates of them were significantly lowered，compared to blank control group（P＜0.05）；IC50were 55.7，23.4 μmol/L after treated for 24，48 h.After treated with 20，30 μmol/L tangeretin for 48 h，cell invasion was inhibited in HepG2 cells；mRNA and protein expression of N-cadherin，Vimentin，Notch-1，CD44 and MMP-9 decreased significantly，while those of E-cadherin increased significantly；the phosphorylated levels of Akt and GSK-3β increased；there was statistical significance between them and blank control group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Tangeretin can inhibit in vitro proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell，which may be associated with inhibiting the expression of CK44 and MMP-9 and signal pathway of upstream Akt-GSK-3β through up-regulating the expression of Notch-1 and inhibiting epithelial-mesenchymal transition.

Tangeretin；Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells；Proliferation；Invasion；Epithelial-mesenchymal transition

R966

A

1001-0408（2016）34-4800-04

2016-02-15

2016-07-18）

＊副主任醫(yī)師，碩士。研究方向：天然產物對腫瘤的抑制作用和機制研究。E-mail：zhix74@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.15