轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究Δ

劉 云，朱金權(quán)，孫增先（連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 222002）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究Δ

劉 云＊，朱金權(quán)，孫增先（#連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 222002）

目的：研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）凋亡的可能機(jī)制。方法：以無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)（SD），MTT法檢測(cè)0.1、1、5、10 ng/ml的TGF-β1對(duì)SD誘導(dǎo)PASMCs細(xì)胞存活率的影響。Hoechst 33342染色觀察正常對(duì)照組、SD組、SD+LY294002[磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑]+TGF-β1組、SD+Wortmannin（PI3K抑制劑）+TGF-β1組、SD+TGF-β1組細(xì)胞凋亡情況。分別用Western blot法考察正常對(duì)照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B（Akt）、磷酸化（p）-Akt蛋白的表達(dá)，正常對(duì)照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+LY294002組、SD+LY294002+TGF-β1組細(xì)胞環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、p-CREB蛋白表達(dá)，正常對(duì)照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+Wortmannin組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細(xì)胞CREB和p-CREB蛋白表達(dá)，LY294002、Wortmannin、TGF-β1的加入濃度分別為10 μmol/L、50 nmol/L、10 ng/ml。結(jié)果：與SD比較，TGF-β1作用后細(xì)胞存活率呈劑量依賴性增加，其中5、10 ng/ml質(zhì)量濃度下細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，SD組、SD+LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細(xì)胞凋亡率均增加（P＜0.05）；與SD組比較，SD+TGF-β1組細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)增強(qiáng)，p-Akt/Akt增加；與SD組比較，SD+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)增強(qiáng)，p-Akt/Akt增加。與正常對(duì)照組比較，SD組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)減弱；與SD組比較，SD+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)增強(qiáng)；與SD+TGF-β1組比較，SD+LY294002+TGF-β1組和SD+Wortmannin+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)均減弱，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：TGF-β1可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制PASMCs凋亡。

肺動(dòng)脈高壓；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B；凋亡

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是一種致命性疾病，其特點(diǎn)是肺血管過度收縮和平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡失衡引起血管壁不規(guī)則重構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等過度分化增生，并積累到血管壁各層，會(huì)造成血管閉塞性病變、肺動(dòng)脈壓及肺血管阻力升高、右心室后負(fù)荷增加，從而導(dǎo)致右心室衰竭，甚至死亡[1]。所以，肺血管重構(gòu)的防治研究日益受到人們的重視。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖和凋亡的失衡是導(dǎo)致PASMCs增殖累積和肺部血管壁重構(gòu)的重要因素之一，抑制PASMCs過度增殖、誘導(dǎo)其凋亡可以作為治療和控制PAH的有效方法。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是體內(nèi)最強(qiáng)且最廣泛的促纖維化介質(zhì)之一，具有調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡的功能，其對(duì)軟骨組織代謝有重要作用[2]，也可促進(jìn)PAH中肺血管重構(gòu)過程[3-4]，但是其作用機(jī)制尚不清楚。Akt，亦被稱為蛋白激酶B（PKB），是一種分子質(zhì)量為60 kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）依賴的方式調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，活化的PI3K/Akt通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活、增殖與凋亡、細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞周期等多種細(xì)胞活動(dòng)和生物學(xué)效應(yīng)。PI3K/Akt通路在PAH的發(fā)病機(jī)制中已有廣泛研究[5]。本研究假設(shè)TGF-β1通過PI3K/Akt通路抑制PASMCs凋亡從而引起PAH，現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料

1.1 儀器

MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；體視顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；IX 70-SIF2型倒置顯微鏡、IX73-奧林帕斯倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；核酸蛋白定量?jī)x（瑞士Amersshams公司）。

1.2 藥品與試劑

TGF-β1（美國(guó)PeproTech公司，批號(hào)：0719029，規(guī)格：2 μg/ml）；環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國(guó)Santa公司）；Akt抗體、磷酸化Akt（p-Akt）抗體、p-CREB抗體（美國(guó)Cell Signaling公司）；Hoechst 33342試劑盒、MTT試劑、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）和PI3K抑制劑LY294002、Wortmannin（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠25只，♀♂不限，體質(zhì)量160～200 g，鼠齡7～9周，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 PASMCs的來源

常規(guī)麻醉大鼠，75%乙醇沖洗頸部和腹部，開胸，取完整的心肺組織放入培養(yǎng)皿內(nèi)，分離肺動(dòng)脈。將取出的肺動(dòng)脈放入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）里，去除纖維外膜和內(nèi)皮，剪成1～2 mm的組織塊，用1.5%Ⅱ型膠原酶消化1～2 h，直至組織塊變成細(xì)胞團(tuán)，加入含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，終止消化，400×g離心5 min，棄上清，加入1 ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞瓶中，常規(guī)靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)皿面積的80%左右對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)PASMCs存活率

收集對(duì)數(shù)期PASMCs，胰酶消化，用培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，加至96孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每孔5 000～10 000個(gè)，鋪板后置于溫箱中培養(yǎng)24 h，分別加入含0.1、1、5、10 ng/ml TGF-β1的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，每個(gè)質(zhì)量濃度6個(gè)復(fù)孔。另取6個(gè)孔加入不含TGF-β1的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)（記為SD）。共同孵育48 h后，加入20 ml MTT試劑，孵育4 h，棄上清，每孔加入150 ml二甲基亞砜（DMSO），低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）＝（加藥孔吸光度－本底吸光度）/（對(duì)照孔吸光度－本底吸光度）×100%。

2.3 Hoechst 33342染色觀察PASMCs的凋亡情況

收集對(duì)數(shù)期PASMCs，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)皿面積70%左右對(duì)其進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)24 h，然后分為正常對(duì)照組、SD組、SD+ LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組、SD+TGF-β1組，每組6個(gè)復(fù)孔，LY294002、Wortmannin、TGF-β1的加入濃度分別為10 μmol/L、50 nmol/L、10 ng/ml。除正常對(duì)照組細(xì)胞加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基外，其余各組細(xì)胞分別加入相應(yīng)含藥或不含藥的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每次5 min，棄PBS，加入Hoechst 33342染料與細(xì)胞共同孵育20 min。加入抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡觀察藍(lán)色熒光產(chǎn)生情況，評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡情況，激發(fā)波長(zhǎng)為352 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400～500 nm。

2.4 Western blot法檢測(cè)PASMCs內(nèi)Akt、p-Akt、CREB和p-CREB蛋白表達(dá)

收集對(duì)數(shù)期PASMCs，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)皿面積70%左右對(duì)其進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)24 h，然后分為正常對(duì)照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組、SD+LY294002組、SD+Wortmannin組、SD+ LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組，每組4個(gè)復(fù)孔，LY294002、Wortmannin、TGF-β1的加入濃度分別為10 μmol/L、50 nmol/L、10 ng/ml。除正常對(duì)照組和TGF-β1組細(xì)胞加入20%FBS DMEM培養(yǎng)基外，其余各組細(xì)胞分別加入相應(yīng)含藥或不含藥的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。作用24 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次，加入細(xì)胞蛋白裂解液，冰上裂解30 min后，收集液體，超聲破碎細(xì)胞，3 000×g離心15 min后收集上清。根據(jù)Bradford法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜完畢后，取出膜放入平皿中的TBST緩沖液中，搖洗5 min，洗凈轉(zhuǎn)膜液，封閉1 h后取出膜，再用TBST緩沖液洗5 min，加入Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、CREB（1∶1 000）、p-CREB（1∶1 000）一抗（溶于3%牛血清白蛋白），4℃過夜孵育。一抗孵育完畢后，用TBST緩沖液洗30 min，然后將HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗溶于5%脫脂牛奶中（1∶5 000），室溫孵育1 h，二抗孵育完畢后，TBST緩沖液洗30 min。均勻滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑的A、B液（1∶1）混合液，靜置5 min，放入凝膠成像儀曝光，Quantity One軟件分析光密度（OD）。以目的蛋白灰度值與β-actin（內(nèi)參）灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)含量[6]。分別考察正常對(duì)照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)，正常對(duì)照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+LY294002組、SD+ LY294002+TGF-β1組細(xì)胞CREB、p-CREB蛋白表達(dá)，正常對(duì)照組、SD組、SD+TGF-β1組、SD+Wortmannin組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細(xì)胞CREB、p-CREB蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行分析。計(jì)量結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率

0.1 、1、5、10 ng/ml TGF-β1和SD作用后PASMCs存活率分別為（62.65±3.76）%、（66.07±3.81）%、（83.46±4.80）%、（91.59±1.43）%、（63.12±2.64）%（n＝6）。與SD比較，加入TGF-β1作用后的PASMCs存活率呈劑量依賴性升高，其中5、10 ng/ml質(zhì)量濃度下細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.2 細(xì)胞凋亡情況

正常對(duì)照組、SD組、SD+LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組、SD+TGF-β1組PASMCs凋亡率分別為（4.83±0.60）%、（37.83±1.14）%、（34.50±1.33）%、（34.00± 1.59）%、（16.83±0.95）%（n＝6）。與正常對(duì)照組的正常細(xì)胞（圖1a）比較，SD組、SD+LY294002+TGF-β1組、SD+Wortmannin+TGF-β1組細(xì)胞在核染色質(zhì)形態(tài)上有明顯改變，例如細(xì)胞核呈鋸齒狀，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)（見圖1b1）；細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝集、邊緣化（見圖1b2）；細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（見圖1b3），這些形態(tài)的發(fā)生提示細(xì)胞的凋亡數(shù)均增加（P＜0.05）。與SD組比較，SD+TGF-β1組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少（P＜0.05）。各組細(xì)胞的凋亡染色圖見圖1。

3.3 細(xì)胞內(nèi)Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

正常對(duì)照組、SD組、TGF-β1組、SD+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)p-Akt/Akt分別為1±0、0.61±0.04、1.48±0.12、1.02±0.06（n＝4）。與正常對(duì)照組比較，TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)增強(qiáng)，p-Akt/Akt增加（P＜0.05）。與SD組比較，SD+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)增強(qiáng)，p-Akt/Akt增加（P＜0.05）。各組細(xì)胞內(nèi)Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2。

圖1 各組細(xì)胞的凋亡染色圖Fig 1 Apoptosis staining of cells in each group

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of the protein expression of Akt and p-Akt of cells in each group

3.4 細(xì)胞內(nèi)CREB、p-CREB蛋白表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，SD組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)減弱（P＜0.05）。與SD組比較，SD+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。與SD+TGF-β1組比較，SD+LY294002+ TGF-β1組和SD+Wortmannin+TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)均減弱（P＜0.05）。各組細(xì)胞內(nèi)CREB、p-CREB蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3，檢測(cè)結(jié)果見表1。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)p-CREB、CREB蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 3 Electrophoretogram of the protein expression of p-CREB and CREB of cells in each group

4 討論

TGF-β1是肺形態(tài)形成、肺纖維化發(fā)病、血管重構(gòu)重要的調(diào)節(jié)因子。筆者以往研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1參與肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，且在缺氧鼠肺動(dòng)脈中過表達(dá)[3]。目前研究中，筆者發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)Akt磷酸化，提示PI3K/Akt通路在TGF-β1抑制PASMCs凋亡中是必要的。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝4）Tab 1 The protein expression of CREB and p-CREB/CREB of cells in each grou（p±s，n＝4）

表1 各組細(xì)胞內(nèi)CREB蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝4）Tab 1 The protein expression of CREB and p-CREB/CREB of cells in each grou（p±s，n＝4）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與SD組比較，#P＜0.05；與SD+ TGF-β1組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.SD group，#P＜0.05；vs.SD+TGF-β1group，ΔP＜0.05

組別正常對(duì)照組SD組SD+TGF-β1組SD+LY294002組SD+LY294002+ TGF-β1組CREB/GAPDH 1.42±0.11 0.90±0.08＊1.24±0.08#0.80±0.01 0.73±0.03Δp-CREB/CREB 1.02±0.06 0.92±0.06 1.00±0.07 1.07±0.03 0.95±0.09組別正常對(duì)照組SD組SD+TGF-β1組SD+Wortmannin組SD+Wortmannin+ TGF-β1組CREB/GAPDH 1.47±0.03 0.83±0.06＊1.24±0.10#0.78±0.07 0.75±0.05Δp-CREB/CREB 0.90±0.05 1.04±0.03 0.98±0.02 1.10±0.07 1.05±0.07

CREB是一種缺氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子，可選擇性結(jié)合環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件（CREs）的核蛋白。缺氧可以激活CREB的高表達(dá)，CREB已經(jīng)被認(rèn)為是PAH血管平滑肌細(xì)胞增殖的一個(gè)指標(biāo)[7]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1不僅可增加CREB磷酸化而且也可加強(qiáng)CREB總蛋白表達(dá)，抑制PASMCs中PI3K/Akt通路后，CREB表達(dá)受到抑制，而p-CREB/CREB的比例沒有發(fā)生變化，表明CREB磷酸化水平增加歸功于總蛋白水平增加。

綜上所述，PI3K/Akt通路涉及到TGF-β1誘導(dǎo)的PAH，這一研究為TGF-β1抑制PASMCs凋亡找到了新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和機(jī)制。TGF-β1調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路可能是治療PAH的重要機(jī)制，為將來治療PAH提供了新的靶點(diǎn)。

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Study on the Mechanism of TGF-β1Inhibiting the Apoptosis of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells

LIU Yun，ZHU Jinquan，SUN Zengxian（Dept.of Pharmacy，the First People’s Hospital of Lianyungang，Jiangsu Lianyungang 222002，China）

OBJECTIVE：To study the potential mechanism of TGF-β1inhibiting the apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells（PASMCs）.METHODS：The serum free medium was used for serum deprivation（SD）；MTT assay was used to detect the effects of 0.1，1，5，10 ng/ml TGF-β1on the survival rate of PASMCs.The apoptosis of PASMCs were observed by Hoechst 33342 staining in normal control group，SD group，SD+LY294002[PI3K inhibitor]+TGF-β1group，SD+Wortmannin（PI3K inhibitor）+TGF-β1group and SD+TGF-β1group.Western blot technique was applied to investigate the protein expression of Akt and p-Akt in normal control group，SD group，TGF-β1group and SD+TGF-β1group；the protein expression of CREB and p-CREB were investigated in normal control group，SD group，SD+TGF-β1group，SD+LY294002 group and SD+LY294002+TGF-β1group；the protein expression of CREB and p-CREB were investigated in normal control group，SD group，SD+TGF-β1group，SD+Wortmannin group and SD+Wortmannin+TGF-β1group.The concentrations of LY294002，Wortmannin and TGF-β1were 10 μmol/L，50 nmol/L，10 ng/ml，respectively.RESULTS：Compared with SD，survival rate of PASMCs increased as dosage after treated by TGF-β1，with statistical significance at 5，10 ng/ml（P＜0.05）.Compared with normal control group，apoptotic rate of PASMCs increased in SD group，SD+LY294002+TGF-β1group and SD+Wortmannin+TGF-β1group（P＜0.05）；compared with SD group，the apoptotic rate of PASMCs decreased in SD+TGF-β1group（P＜0.05）.Compared with normal control group，the protein expression of p-Akt and p-Akt/Akt ratio increased in TGF-β1group；compared with SD group，the protein expression of p-Akt and p-Akt/Akt ratio increased in SD+TGF-β1group.Compared with normal control group，the protein expression of CREB decreased in SD group；compared with SD group，the protein expression of CREB increased in SD+TGF-β1group；compared with SD+TGF-β1group，the protein expression of CREB decreased in SD+LY294002+TGF-β1group and SD+Wortmannin+TGF-β1group，with statistical significance（P＜0.05）.CONCLUSIONS：TGF-β1can inhibit the apoptosis of PASMCs by activating PI3K/Akt signaling pathway.

Pulmonary arterial hypertension；TGF-β1；PI3K/Akt；Apoptosis

R965

A

1001-0408（2016）34-4784-03

2016-07-29

2016-10-26）

（編輯：鄒麗娟）

江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.BK20161297）；連云港市第一人民醫(yī)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（No.BS15012）

＊主管藥師，博士。研究方向：肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制。電話：0518-85605518。E-mail：yunliu211315@163.com

#通信作者：主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0518-85605518。E-mail：sunzx715@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.10