谷胱甘肽合成酶系CLEAs的制備及應(yīng)用

田慧 楊峰晨 盧泓宇 徐期 楊勇

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺(tái)州 318000）

谷胱甘肽合成酶系CLEAs的制備及應(yīng)用

田慧 楊峰晨 盧泓宇 徐期 楊勇

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺(tái)州 318000）

為在谷胱甘肽合成工藝中降低成本，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)酶的可存儲(chǔ)性、商品化性，將谷胱甘肽合成酶系經(jīng)過合適的沉淀劑沉淀，戊二醛交聯(lián)制備成共固定交聯(lián)酶聚集體。通過優(yōu)化沉淀?xiàng)l件，交聯(lián)條件，蛋白濃度及添加劑的使用，最終得到最優(yōu)的制備方法為：在4℃，30 g/L蛋白濃度條件下，加入PEI-600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）與酶液進(jìn)行充分混合，然后加入60%飽和度硫酸銨沉淀4 h，最后以0.5%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。最終蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對(duì)照組的28.7%及2.57 U/g提高了19.5%和2.33 U/g，GSH最高產(chǎn)量達(dá)到11.26 g/L，在轉(zhuǎn)化第12批次時(shí)GSH產(chǎn)量為9.03 g/L，相對(duì)酶活力為78.4%，4℃條件下儲(chǔ)藏33 d后相對(duì)酶活力為92.12%。經(jīng)優(yōu)化制備條件后得到的谷胱甘肽合成酶系CLEAs有較高的初始酶活力，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化10批次以上，儲(chǔ)藏穩(wěn)定性佳，具有優(yōu)良的工業(yè)化前景。

谷胱甘肽合成酶系；固定化；交聯(lián)酶聚集體；添加劑

谷胱甘肽（GSH）是一種含γ2谷氨酰基和巰基的生物活性三肽類化合物，在蛋白質(zhì)和DNA的合成、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的保護(hù)等重要的生物學(xué)現(xiàn)象中起著直接或間接作用。酶法合成谷胱甘肽是以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸為底物，在谷氨酰半胱氨酸合成酶（酶A）、谷胱甘肽合成酶（酶B）、乙酰磷酸激酶的催化作用下合成。但在生產(chǎn)上未純化過的游離酶的使用導(dǎo)致生產(chǎn)后期雜質(zhì)較多，分離純化工藝復(fù)雜，同時(shí)由于游離酶的一次性使用，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下。相比游離酶，固定化酶具有存儲(chǔ)穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，能夠使得生產(chǎn)過程簡(jiǎn)化，生產(chǎn)效率得到提高。目前對(duì)于谷胱甘肽的固定化酶生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少，日本的Murata等［1］最早將釀酒酵母固定在聚丙烯酰胺凝膠中，利用釀酒酵母自身的糖酵解途徑作為ATP再生系統(tǒng)進(jìn)行GSH的生物合成，國(guó)內(nèi)很多學(xué)者也利用酵母細(xì)胞的糖酵解系統(tǒng)產(chǎn)生ATP進(jìn)行GSH的合成［2］；李華鐘、陳堅(jiān)等［3］將酵母菌的糖酵解酶系與重組大腸桿菌的谷胱甘肽合成酶系共固定化于改進(jìn)的聚乙烯醇（PVA）-卡拉膠混合載體；趙旭東等［4］將酵母細(xì)胞固定化，再與GSH合成酶合成GSH，最終GSH產(chǎn)量為0.91 g/L，轉(zhuǎn)化率為14.9%。華東理工大學(xué)沈立新等［5］分別以卡拉膠、明膠、海藻酸鈉包埋E. coli BL21（pTrc-gsh）細(xì)胞催化合成谷胱甘肽GSH。南昌大學(xué)謝雷波等［6］提出了κ-卡拉膠與魔芋粉混合載體固定化微生物細(xì)胞進(jìn)行生物合成谷胱甘肽的研究。總體來說，關(guān)于固定化酶生產(chǎn)GSH的報(bào)道較少，已報(bào)道的固定化細(xì)胞或酶都存在機(jī)械強(qiáng)度低，傳質(zhì)阻力大，酶活不高等問題，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)上述的很多文獻(xiàn)都提到利用酵母菌的糖酵解系統(tǒng)產(chǎn)生ATP來解決酶法生產(chǎn)的成本問題。但這種耦合體系中ADP的積累往往會(huì)抑制GSH合成酶的活性，造成GSH產(chǎn)率低下。

交聯(lián)酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）是一種無需活性載體的加入而直接將不同形式的酶用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)進(jìn)而制得固定化酶的技術(shù)。該固定化技術(shù)對(duì)酶純度要求不高，酶的負(fù)載量高，操作簡(jiǎn)便，成本低，很有可能發(fā)展成為從宏觀角度提高酶選擇性及催化活性的修飾手段，是一種極具開發(fā)前景的固定化方法。交聯(lián)酶聚集體已經(jīng)應(yīng)用于手性化合物拆分［7］、有機(jī)合成［8，9］、藥物中間體合成［10］、生物柴油［11］及生物傳感器領(lǐng)域，還可用于醫(yī)療蛋白的釋放、化妝品和洗滌劑，工業(yè)廢物、污染水的環(huán)境治理等?，F(xiàn)階段，已經(jīng)有數(shù)十種酶如?；D(zhuǎn)移酶、葡萄糖異構(gòu)酶、脂肪酶［12-14］、蛋白酶等的CLEAs已實(shí)現(xiàn)商品化。共固定CLEAs（Coimmobilized in CLEAs，combi-CLEAs）是將多個(gè)酶聚集在一起，形成多種酶復(fù)合的CLEAs，從而實(shí)現(xiàn)多步反應(yīng)一步催化，減少了單元操作數(shù)和反應(yīng)器體積。Mateo［15］將光學(xué)選擇性為S型的醇腈酶和無選擇性的腈水解酶共沉淀制備出復(fù)合 CLEAs，該復(fù)合CLEAs能夠利用苯甲醛和氰化物合成S-扁桃酸。López-Serrano等［16］將7種不同的商業(yè)脂肪酶共固定合成一種CLEAs，其酶活相對(duì)原始酶提高了超過10倍。Timo等［17］將PepX、PepN兩種X-脯氨酰二肽酰氨肽酶1∶1加入進(jìn)行CLEAs制備時(shí)，兩個(gè)酶的酶活均達(dá)到最高。Taboada-Puig等［18］將Bjerkandera adusta過氧化物酶（VP）與Bjerkandera adusta（GOD）葡萄糖氧化酶進(jìn)行共固定制備VP-GOD-CLEAs的酶活回收率為89%，而單獨(dú)VP-CLEAs的酶活回收率只有67%，此聯(lián)合CLEAs對(duì)H2O2表現(xiàn)出更高的耐受性，同時(shí)在葡萄糖添加的情況下，VP的酶活更高。Jung［19］將淀粉蔗糖酶AS、麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTS）、糖基海藻糖水解酶（MTH）被共同交聯(lián)在一起，制備成聯(lián)合CLEAs，進(jìn)而達(dá)到一步生物轉(zhuǎn)化蔗糖為海藻糖的目的，3種酶的比例分別為 8∶0.5∶0.5（AS 4 mg∶MTS 0.25 mg∶MTH 0.25 mg），此聯(lián)合CLEAs在使用5批后酶活無任何損失，但由于其存在不易分離回收的缺點(diǎn)，導(dǎo)致影響其工業(yè)化應(yīng)用及重復(fù)使用。

基于以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)室通過基因改造手段強(qiáng)化gshA的表達(dá)，弱化gshB及ackA的表達(dá)，有效解決了產(chǎn)物積累對(duì)gshA的酶活抑制，構(gòu)建了谷胱甘肽合成酶產(chǎn)生菌E.coli-gshA-gshB-ackA。在此基礎(chǔ)上，本研究著重考察此多酶體系的CLEAs的制備及條件優(yōu)化，旨在解決谷胱甘肽項(xiàng)目雜質(zhì)及成本問題。

1 材料與方法

1.1 材料

谷胱甘肽合成酶產(chǎn)生菌E.coli-gshA-gshB-ackA（gshA為谷氨酰半胱氨酸合成酶、gshB為谷胱甘肽合成酶、ackA為乙酰磷酸激酶）保藏于浙江海正藥業(yè)股份有限公司中央研究院酶工程研究所，菌種編號(hào)pEL915，通過基因改造3個(gè)酶的表達(dá)比例約為10∶3∶1。

PEI-600、PEI-10000、PEI-70000（阿拉丁試劑），BSA（上海生工）、BSA水溶液（thermo公司），50%戊二醛（北京百靈威科技有限公司），（NH4）2SO4、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、吐溫-20、SDS、TritonX-100、蔗糖、葡糖糖、Lys、D-山梨醇、可溶性淀粉、吐溫-80、瓊脂糖、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O及其他試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備

1.2.1.1 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：酵母抽提物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏4 g/L，蛋白胨8 g/L，甘油10 g/L，KH2PO45 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH7.2。

1.2.1.2 酶液制備 將培養(yǎng)后的工程菌915進(jìn)行10 000 r/min離心收集菌體，-20℃冷凍儲(chǔ)存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需取出適量進(jìn)行重懸，均質(zhì)機(jī)破碎得到酶液。

1.2.2 沉淀?xiàng)l件研究

1.2.2.1 沉淀劑的選擇 分別選取（NH4）2SO4、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯共6種沉淀劑進(jìn)行沉淀，其中，（NH4）2SO4選取30%、40%、50%、60%、70%和80%飽和度對(duì)酶液進(jìn)行沉淀，其余試劑均選用體積比20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%對(duì)酶液進(jìn)行沉淀。

1.2.2.2 沉淀速度對(duì)酶活回收率的影響 考察一次性加入和緩慢加入對(duì)酶活回收率的影響。

1.2.2.3 沉淀時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響 分別考察不同的沉淀時(shí)間（0.5、1、2、4、6、8和17 h）對(duì)酶活回收率的影響。

1.2.3 交聯(lián)條件的摸索

1.2.3.1 戊二醛濃度對(duì)酶活的影響 考察不同戊二醛終濃度（0.1%、0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%和7.5%）對(duì)酶活回收率的影響。

1.2.3.2 交聯(lián)pH對(duì)酶活回收率影響 考察不同交聯(lián)pH（5、6、7、8、9、10和11）對(duì)酶活回收率的影響。

1.2.3.3 交聯(lián)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)酶活的影響 考察不同交聯(lián)時(shí)間（0.5、1、2、3、4、5、6、7、8和9 h）對(duì)酶活回收率的影響。

1.2.3.4 交聯(lián)溫度對(duì)酶活的影響 考察不同溫度（4℃、15℃、25℃、30℃和37℃）條件下交聯(lián)對(duì)酶活回收率的影響。

1.2.4 蛋白濃度對(duì)酶活回收率的影響 考察不同酶液蛋白濃度（51.07、40.8、30.6、20.4、10.2、5.1和2.5 g/L）及不同戊二醛濃度（0.25%、0.5%、0.75%、1%和1.25%）對(duì)CLEAs制備及酶活的影響。

1.2.5 添加劑對(duì)CLEAs制備及酶活的影響 考察在戊二醛濃度為0.25%及0.5%時(shí)，終濃度為1 g/L的各種添加劑對(duì)CLEAs酶活的影響。酶液濃度為30 g/L，先將添加劑加入到破胞酶液中，充分混勻后進(jìn)行冷室4℃過夜沉淀，隔天進(jìn)行20℃，220 r/min條件下交聯(lián)反應(yīng)，交聯(lián)1 h后取2 mL進(jìn)行離心收集CLEAs，用0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，最終收集到的CLEAs進(jìn)行酶活檢測(cè)。

1.2.6 酶活力測(cè)定 經(jīng)優(yōu)化確定轉(zhuǎn)化體系酶活檢測(cè)方法為：在10 mL轉(zhuǎn)化體系中，各底物濃度分別為半胱甘酸60 mmol/L、甘氨酸180 mmol/L、谷氨酸鈉180 mmol/L、七水氯化鎂40 mmol/L、乙酰磷酸二鋰鹽（ACP）180 mmol/L、ATP 1 mmol/L、磷酸緩沖液（磷酸氫二鉀100 mmol/L）。按上述濃度將半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸鈉、七水氯化鎂、ACP、K2HPO4配置成母液，pH調(diào)至7.2，ATP配置200 mmol/L的母液，在100 mL轉(zhuǎn)化瓶中稱取0.5 g CLEAs或者50 μL蛋白酶液，加入上述母液9.90 mL，混合均勻，30℃恒溫?fù)u床預(yù)熱10 min，最后加入50 μL ATP母液，30℃，150 r/min震蕩，開始計(jì)時(shí)，0.5 h后取樣進(jìn)行GSH含量檢測(cè)。酶活定義：在檢測(cè)條件下，每分鐘催化生成 1 mol GSH所需的酶量為 1 U。

1.2.7 CLEAs的收集方法 采用離心法進(jìn)行CLEAs的收集，收集條件為6 000 r/min離心12 min，0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，最終收集到的CLEAs，4℃冰箱放置備用。

1.2.8 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.2.9 蛋白質(zhì)沉淀率測(cè)定 蛋白質(zhì)沉淀率/%=（1 -a1/a2）×100%，式中：a1為固定化后酶液剩余蛋白質(zhì)含量；a2為固定化前酶液的蛋白質(zhì)含量。

1.2.10 CLEAs酶活回收率測(cè)定 酶活回收率/%=固定化酶酶活力/固定化前游離酶酶活力×100%

1.2.11 CLEAs催化合成GSH

1.2.11.1 使用批次 使用0.5%戊二醛濃度條件下分別添加了BSA及PEI 600為添加劑制備得到的CLEAs連續(xù)反應(yīng)12批次，測(cè)定各次轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶活力，以第1次反應(yīng)酶活力為100%，分別計(jì)算相對(duì)酶活力，同時(shí)繼續(xù)進(jìn)行GSH轉(zhuǎn)化合成實(shí)驗(yàn)，考察最終生成GSH的產(chǎn)量。

1.2.11.2 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 將制備好的CLEAs儲(chǔ)藏在4℃冰箱中，隔段時(shí)間取出進(jìn)行酶活檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 沉淀?xiàng)l件研究

2.1.1 沉淀劑的選擇 硫酸銨對(duì)915產(chǎn)酶的沉淀效果影響（圖1）顯示，當(dāng)硫酸銨為60%飽和度時(shí)，蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為93%，具有較好的酶活回收率及蛋白沉淀率。

圖1 硫酸銨飽和度對(duì)915產(chǎn)酶的沉淀效果影響

如圖2所示，各種有機(jī)溶劑對(duì)915產(chǎn)酶進(jìn)行沉淀，在有機(jī)溶劑體積比為40%以上時(shí)，蛋白沉淀率均能達(dá)到90%以上，但所有實(shí)驗(yàn)的有機(jī)溶劑的酶活回收率均較低，幾乎均在10%以下。因此，對(duì)比硫酸銨及各種有機(jī)溶劑對(duì)蛋白的沉淀效果，最終確定以硫酸銨作為CLEAs制備的蛋白沉淀劑。

2.1.2 沉淀速度對(duì)酶活回收率的影響 一次性投入時(shí)酶活回收率為77.7%，緩慢投入時(shí)酶活回收率為78.4%，二者相差無幾，由此說明以硫酸銨為沉淀劑的蛋白沉淀過程相比用其它有機(jī)溶劑為沉淀劑時(shí)，沉淀過程相對(duì)比較溫和，對(duì)酶活的損失較小，硫酸銨投入的速度對(duì)酶活影響較小。

2.1.3 沉淀時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)酶活回收率的影響 如表1所示，在沉淀時(shí)間2 h以內(nèi)，隨著沉淀時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活回收率逐漸提高，但是2 h以后，沉淀時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)酶活回收率的影響較小。

圖2 有機(jī)溶劑對(duì)915產(chǎn)酶蛋白沉淀率（A）及酶活回收率（B）的影響

表1 沉淀時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響

2.2 交聯(lián)條件優(yōu)化

2.2.1 戊二醛濃度對(duì)酶活回收率的影響 如圖3所示，最適的戊二醛濃度為0.25%，此時(shí)的酶活回收率為29.68%，隨著戊二醛濃度的進(jìn)一步增大，CLEAs的酶活呈線性快速下降，至1%濃度時(shí)，CLEAs的酶活近乎為0。

2.2.2 交聯(lián)pH對(duì)酶活回收率的影響 如表2所示，最適的交聯(lián)pH為6.0，酶活回收率為45.6%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在pH6.0-9.0范圍內(nèi)酶活回收率差別較小。

圖3 戊二醛濃度對(duì)酶活回收率的影響

表2 0.25%戊二醛條件下交聯(lián)pH對(duì)酶活的影響

2.2.3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響 結(jié)果（圖4）顯示，0.25%和0.5%戊二醛濃度下，交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活影響較小，酶活回收率主要與戊二醛濃度有關(guān)。

圖4 0.25%及0.5%戊二醛條件下交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活的影響

2.2.4 交聯(lián)溫度對(duì)酶活的影響 結(jié)果（表3）顯示，較低溫度更利于CLEAs酶活的保留，4℃最適交聯(lián)溫度，酶活回收率為46.43%。與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同溫度條件下交聯(lián)得到的CLEAs顏色有較大差別。

表3 交聯(lián)溫度對(duì)酶活的影響

2.3 蛋白濃度對(duì)酶活回收率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，在相同交聯(lián)劑存在的條件下，較高濃度的酶溶液制備得到的CLEAs的酶活回收率較高，而低濃度酶液即使在很低濃度戊二醛條件下制備的CLEAs的酶活回收率也很低。蛋白濃度在＞20.4 g/L以上時(shí)，在0.25%戊二醛濃度條件下交聯(lián)得到的CLEAs的酶活回收率在53%以上。由此得出，酶液的蛋白濃度是影響CLEAs酶活的一個(gè)非常重要的因素。由于均質(zhì)破胞時(shí)菌懸液濃度不宜過高，故后期選定蛋白濃度為30 g/L的酶液進(jìn)行CLEAs的后續(xù)研究。

圖5 蛋白濃度及戊二醛濃度對(duì)CLEAs酶活回收率的影響

2.4 添加劑對(duì)酶活回收率的影響

2.4.1 添加劑初篩 如圖6所示，在0.5%戊二醛條件下，對(duì)一系列添加劑進(jìn)行初篩，1 g/L添加劑對(duì)CLEAs的酶活有明顯促進(jìn)作用的是SDS、BSA、Lys及PEI-600。

2.4.2 添加劑復(fù)篩 分別在0.25%及0.5%戊二醛濃度條件下，對(duì)SDS、BSA、Lys及PEI-600的相對(duì)最適濃度進(jìn)行進(jìn)一步摸索。結(jié)果（圖7）顯示，在0.25%戊二醛濃度條件下，除了PEI（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶20）對(duì)酶活有相對(duì)較明顯的促進(jìn)作用外，其余添加劑的作用均不明顯；而在0.5%戊二醛條件下，BSA及PEI-600對(duì)CLEAs酶活均有很明顯的促進(jìn)作用，BSA在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶1時(shí)對(duì)酶活的促進(jìn)作用最明顯，酶活回收率達(dá)到54.2%；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5時(shí)對(duì)酶活的促進(jìn)作用最明顯，酶活回收率達(dá)到50.7%。

圖6 各種添加劑對(duì)CLEAs酶活的影響（初篩）

在0.25%及0.5%戊二醛條件下，分別繼續(xù)對(duì)上述復(fù)篩結(jié)果中各最適添加劑濃度進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果（圖8）顯示，在0.25%及0.5%戊二醛條件下，BSA及PEI 600對(duì)CLEAs酶活均有很明顯的促進(jìn)作用。在0.25%戊二醛濃度條件下，BSA在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶120時(shí)酶活回收率達(dá)到57.7%，單位CLEAs的酶活為5.9 U/g；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶20時(shí)酶活回收率達(dá)到64.2%，單位CLEAs的酶活為6.1 U/g，分別相比對(duì)照組的54%及4.9 U/g提高了3.7%、1 U/g及10.2%、1.2 U/g；在0.5%戊二醛濃度條件下，BSA在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶1時(shí)酶活回收率達(dá)到50.2%，單位CLEAs的酶活為4.0 U/g；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5時(shí)酶活回收率達(dá)到48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對(duì)照組的28.7%及2.57 U/g提高了21.5%、1.43 U/g及19.5%、2.33 U/g。

2.5 轉(zhuǎn)化批次

分別以添加BSA與PEI 600制備得到的CLEAs聚集體進(jìn)行批次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。如圖9-A所示，以BSA為添加劑時(shí)，GSH最高產(chǎn)量達(dá)10.78 g/L，轉(zhuǎn)化率為58.6%，在轉(zhuǎn)化第12批次時(shí)GSH產(chǎn)量為7.5 g/L，相對(duì)酶活力為69.7%，轉(zhuǎn)化率為40.8%；如圖9-B所示，在以PEI 600為添加劑時(shí)，GSH最高產(chǎn)量達(dá)11.26 g/L，轉(zhuǎn)化率為61.2%，在轉(zhuǎn)化第12批次時(shí)GSH產(chǎn)量為9.03 g/L，相對(duì)酶活力為78.4%，轉(zhuǎn)化率為50.2%。 2.6 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

圖7 0.25%（A）及0.5%（B）戊二醛條件下添加劑對(duì)CLEAs酶活復(fù)篩

考察了在0.5%戊二醛條件下，添加了PEI 600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）制備得到的CLEAs在4℃條件下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。結(jié)果（圖10）顯示，在儲(chǔ)藏33 d時(shí)間內(nèi)，CLEAs催化GSH合成時(shí)，GSH的產(chǎn)量最大達(dá)到了12.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為65.9%，儲(chǔ)藏33 d以后，GSH的產(chǎn)量為10.56 g/L，轉(zhuǎn)化率為57.4%，具有良好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

3 討論

在交聯(lián)酶聚集體的制備中，酶聚集體的形成是保持酶活性最關(guān)鍵的步驟。聚集體中酶分子之間以次級(jí)鍵相互作用，在水溶液中會(huì)出現(xiàn)解聚。酶聚集體的活性大小、緊密程度、均勻性等特性都可通過選擇不同的沉淀劑、控制沉淀劑的濃度、添加速度、攪拌速度及溶液系統(tǒng)的體積大小、溶液的pH、溫度等來調(diào)節(jié)。Schoevaart等［20］采用14種沉淀劑對(duì)12種脂肪酶酶蛋白進(jìn)行沉淀，發(fā)現(xiàn)不同的沉淀劑對(duì)同一種酶的沉淀效果差異顯著，其提出酶的沉淀過程存在著酶分子聚集與變性的競(jìng)爭(zhēng)。Dong等［21］也提出高沉淀劑濃度導(dǎo)致聚集成為主導(dǎo)，而低沉淀劑濃度則導(dǎo)致變性成為主導(dǎo)。本研究選取了硫酸銨、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯6種文獻(xiàn)普遍報(bào)道的沉淀劑對(duì)谷胱甘肽合成酶系進(jìn)行沉淀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到60%飽和度時(shí)，蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為93%，具有較好的酶活回收率及蛋白沉淀率，而其他幾種沉淀劑雖然隨著濃度的增加，酶活沉淀率幾乎趨近于100%，但是酶活損失巨大，幾乎都只有10%左右的酶活殘留率。與此同時(shí)，我們也考察了硫酸銨的加入方式及沉淀時(shí)間的長(zhǎng)短，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個(gè)沉淀過程對(duì)酶活的損失較小，甚至硫酸銨對(duì)酶活還起到了一定的保護(hù)作用，因?yàn)橹坝袑?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)均質(zhì)處理過的酶液在4℃條件下極易失活，而以硫酸銨沉淀處理后的酶液在較長(zhǎng)時(shí)間仍存在較高的酶活，酶活回收率較高。

圖8 0.25%（A）及0.5%（B）戊二醛條件下添加劑對(duì)CLEAs酶活復(fù)篩

圖9 轉(zhuǎn)化批次考察

圖10 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性考察

交聯(lián)步驟是制備出高活性及高穩(wěn)定性的交聯(lián)酶聚集體的關(guān)鍵步驟。Cabiro等［22］在制備Linum usitatissimum的交聯(lián)酶聚集體時(shí)，發(fā)現(xiàn)在使用硫酸銨作為沉淀劑時(shí)，沉淀后活性保留80%以上，然而當(dāng)交聯(lián)之后，只保留其游離酶活性的20%，由此可見交聯(lián)步驟對(duì)酶活的損失之大。常用作交聯(lián)劑的有甲醛、乙醛、戊二醛、葡聚糖多醛、環(huán)氧基交聯(lián)劑、戊二醛結(jié)構(gòu)類似物（二甘醇、高碘酸氧化的糖類［23］），本研究選取通用的戊二醛作為交聯(lián)劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)戊二醛濃度為0.25%時(shí)，此時(shí)50 mL酶液收集到的CLEAs的濕重只有11.69 g，酶活回收率為29.68%達(dá)到最高，隨著戊二醛濃度的逐步提高，收集到的CLEAs的濕重逐步增加，但是總的酶活回收率反而迅速下降。這可能是由于戊二醛濃度過低導(dǎo)致交聯(lián)不充分，未交聯(lián)的聚集酶在后續(xù)洗滌過程中因?yàn)閺?fù)溶而流失，同時(shí)酶固定的不夠牢固，導(dǎo)致最終收集到的CLEAs濕重較低，而戊二醛濃度過高又導(dǎo)致與酶活性相關(guān)的胺基也發(fā)生交聯(lián)，損害了CLEAs的活性，同時(shí)使得形成的CLEAs結(jié)構(gòu)更加緊密，增加了傳質(zhì)阻力，從而降低了CLEAs的表觀酶活力。在此次實(shí)驗(yàn)中，雖然戊二醛濃度在0.25%時(shí)，酶活回收率達(dá)到最大，但是可能由于交聯(lián)不充分，導(dǎo)致交聯(lián)酶顆粒很小，過濾收集的方式導(dǎo)致CLEAs的回收十分困難。因此在后續(xù)考察添加劑使用時(shí)，均在0.25%及0.5%戊二醛濃度條件下同時(shí)進(jìn)行。另外，本研究也考察了交聯(lián)溫度對(duì)CLEAs酶活回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低的溫度更有利于CLEAs酶活的保留，4℃是最適的交聯(lián)溫度，其酶活回收率為46.43%，與江南大學(xué)楊緒娥［24］、北京大學(xué)張晶晶等［25］發(fā)現(xiàn)在交聯(lián)過程中，溫度是影響CLEAs制備的重要因素，隨溫度升高，相對(duì)酶活力逐漸降低的報(bào)道一致。

許多文獻(xiàn)報(bào)道，酶與非離子聚合物、蛋白添加劑、底物類似物等共沉淀能增加酶穩(wěn)定性，或者提高酶活力。這可能是由于它們能誘導(dǎo)酶分子處于活性狀態(tài)，然后這種狀態(tài)被隨后的操作“固定”下來；也有可能是它們一直保護(hù)著酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；或者是提供更多的氨基與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，特別是對(duì)于目的蛋白中所含賴氨酸殘基比例較少的酶的CLEAs的制備具有非常明顯的效果。在之前交聯(lián)實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)使用0.25%終濃度的戊二醛得到的CLEAs的酶活回收率只有29.68%，而我們的酶系中包含3種酶，是以3種酶共同參與反應(yīng)生成的終產(chǎn)物GSH進(jìn)行的酶活計(jì)算，由此，只要其中一種酶或幾種酶對(duì)戊二醛非常敏感，極易與戊二醛反應(yīng)導(dǎo)致酶失活，從而使得最終的酶活回收率很低，對(duì)此我們考察在CLEAs制備過程中加入添加劑等方式來對(duì)目的蛋白進(jìn)行一定程度的保護(hù)作用。Hormigo等［26］添加BSA制備了聚-3-羥基丁酸酯（PHB）解聚酶的CLEAs，PhaZSex-CLEAs的尺寸平均為50-300 μm，在重復(fù)使用20批后，酶活均沒有損失，表現(xiàn)出更好的溫度及pH穩(wěn)定性，具有更高的有機(jī)溶劑耐受性。Tükel等［27］添加了BSA的過氧化氫酶CLEAs的熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶，同時(shí)在連續(xù)使用400批后，其仍保留50%的酶活。Vaidya等［28］將L-氨基?；概cPEI共固定制備的CLEAs（AP-CLEA），其酶活及穩(wěn)定性較未加均有所提高。Saxena等［29］在制備交聯(lián)嗜熱絨毛菌聚集體的過程中添加SDS及TritonX-100，活性均得到了不同程度的提高。天津大學(xué)王夢(mèng)凡等［30］制備Thermomyces lanuginosa脂肪酶CLEAs時(shí)沉淀過程添加了SDS，酶活提高2倍，青霉素-G-酰基轉(zhuǎn)移酶制備CLEAs時(shí)加入葡萄糖、蔗糖及海藻糖，其酶活要高于沒有使用糖作為穩(wěn)定劑的，同時(shí)具有更高的熱穩(wěn)定性［31］。江南大學(xué)的楊雪等［32］在制備Lipozyme CLEAs的過程中添加D-山梨醇與PEG600共沉淀，得到的CLEAs具有較高的催化活性。本研究選取了大量的添加劑進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.5%戊二醛條件下，PEI 600及BSA對(duì)CLEAs保持較高酶活及酶活回收率具有明顯的促進(jìn)作用，BSA 在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶1時(shí)酶活回收率達(dá)到50.2%，單位CLEAs的酶活為4.0 U/g；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5時(shí)酶活回收率達(dá)到48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對(duì)照組的28.7%及2.57 U/g提高了21.5%，1.43 U/g及19.5%、2.33 U/g。由于添加PEI 600后單位CLEAs的酶活明顯高于未添加及添加了BSA的，最終選取PEI 600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）為最適的添加劑。

最后也對(duì)制備得到的CLEAs的酶活穩(wěn)定性及使用批次進(jìn)行了考察，在4℃條件下放置33 d后，GSH的產(chǎn)量為10.56 g/L，相對(duì)酶活力為92.12%，同時(shí)在反應(yīng)12批次后，其酶活仍保留78.4%。但是目前應(yīng)用仍受到很大局限，CLEAs的顆粒尺寸是影響其工業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。文獻(xiàn)報(bào)道CLEAs的顆粒尺寸通常是小于10 μm［33，34］，粒徑這個(gè)關(guān)鍵因素可能在一定程度上限制了其在非均相化合物反應(yīng)中的分離。除了離心和過濾外，很難從反應(yīng)體系中將CLEAs分離及回收，而離心或過濾常?？赡軐?dǎo)致CLEAs凝結(jié)成塊，不易再次均勻分散在反應(yīng)體系中，造成利用效率低下。目前有許多關(guān)于避免CLEAs顆粒尺寸小的弊端的新方法報(bào)道，如與載體連用［35］，使用氨基功能磁性納米粒子［36-38］等，后期我們也將重點(diǎn)根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)需求改造CLEAs的顆粒尺寸。

4 結(jié)論

通過優(yōu)化沉淀?xiàng)l件，交聯(lián)條件，蛋白濃度及添加劑的使用，最終得到最優(yōu)的制備方法為：在4℃，30 g/L蛋白濃度條件下，加入PEI-600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）與酶液進(jìn)行充分混合，然后加入60%飽和度硫酸銨沉淀4 h，最后以0.5%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。最終蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對(duì)照組的28.7%及2.57 U/g提高了19.5%、2.33 U/g，GSH最高產(chǎn)量達(dá)到11.26 g/L，轉(zhuǎn)化率為61.2%，在轉(zhuǎn)化第12批次時(shí)GSH產(chǎn)量為9.03 g/L，相對(duì)酶活力為78.4%，4℃條件下儲(chǔ)藏33 d后相對(duì)酶活力為92.12%。

［1］Murata K, Tani K, Kato J, et al. Glycolytic pathway as an ATP generation system and its application to the production of glutathione and NADP［J］. Enzyme Microb Technol, 1981, 3（2）：233-242.

［2］李寅, 陳堅(jiān), 毛英鷹, 等. 重組大腸桿菌生產(chǎn)谷胱甘肽發(fā)酵條件的研究［J］. 微生物學(xué)報(bào), 1999, 9（4）：355-361.

［3］童群義, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 等. PVA-卡拉膠混合載體固定化大腸桿菌-酵母菌混合體系生產(chǎn)谷胱甘肽［J］. 工業(yè)微生物, 2000, 30（4）：1-5.

［4］趙旭東, 魏東芝, 俞俊棠. 固定化酵母細(xì)胞生物合成谷肽甘肽的研究［J］. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 16（1）：29-32.

［5］沈立新, 魏東芝, 張嗣良, 等. 固定化E. coli BL21（ptrc-gsh）細(xì)胞催化合成谷胱甘肽［J］. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 28（1）：24-27.

［6］ 謝雷波, 段學(xué)輝, 王錦, 等. 卡拉膠與魔芋粉混合載體固定酵母細(xì)胞生物合成谷胱甘肽［J］. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 28（1）：19-22.

［7］Kumar S, Mohan U, Kamble AL, et al. Cross-linked enzyme aggregates of recombinant Pseudomonas putid anitrilase for enanfioselective mtnle hydrolysis［J］. Bioresource Technology, 2010, 101（17）：86-98.

［8］Rajendhran J, Gunasekaran P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 97：1-13.

［9］Wilson L, Zamorano F, Aguirre C, et al. A Carrier-bound and earnerfree penicillin acylases as catalysts for cephalexin synthesis in aqueous medium［J］. J Biotechnol, 2007, 131（2）：74.

［10］Cabana H, Jones JP, Agathos SN. Preparation and characterization of cross-linked laccase aggregates and their application to the elimination of endocrine disrupting chemicals［J］. Journal of Biotechnology, 2007, 132：23-31.

［11］Shah S, Sharma A, Gupta MN. Preparation of cross-linked enzyme aggregates by using bovine serum albumin as a protetc feeder［J］. Analytical Biochemistry, 2006, 351（2）：207-213.

［12］Xu DY, Yang Z. Cross-linked tyrosinase aggregates for elimination of phenolic compounds from wastewater［J］. Chemosphere, 2013, 92（4）：391-398.

［13］Zhao L, Zheng L, Gao G, et al. Resolution of N（2-ethyl-6-methylphenyl）alanine via cross-linked aggregates of Pseudomonas sp. Lipase［J］. J Mol Catal B：Enzym, 2008, 54：7-12.

［14］Kartal F, Janssen MH, Hollmann F, et al. Improved esterification activity of Candida rugosa lipase in organic solvent by immobilization as Cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic, 2011, 71：85-94.

［15］Mateo C, Chmura A, Rustler S, et al. Synthesis of enantiomerically pure S-mandelic acid using an oxynitrilase-nitrilase bienzymatic cascade：a nitrilase surprisingly shows nitrile hydratase activity［J］. Tetrahedron：Asymmetry, 2006, 17：320-323.

［16］Lopez-Serrano P, Cao L, Van Rantwijk F, et al. Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity：application to lipases［J］. Biotechnology Letters, 2002, 24：79-83.

［17］Stressler T, Ewert J, Eisele T, et al. Cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）of PepX and PepN-production, partial characterization and application of combi-CLEAs for milk protein hydrolysis［J］. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2015, 4：752-760.

［18］Taboada-Puig R, Junghanns C, Demarche P, et al. Combined crosslinked enzyme aggregates from versatile peroxidase and glucose oxidase：production, partial characterization and application for the elimination of endocrine disruptors［J］. Bioresource Technology, 2011, 102：93-102.

［19］Jung DH, Jung JH, Seo DH, et al. One-pot bioconversion of sucrose to trehalose using enzymatic sequential reactions in combined cross-linked enzyme aggregates［J］. Bioresource Technology, 2013, 130：801-804.

［20］Schoevaart R, Wolbers M, Golubovic M, et al. Preparation, optimization, and structures of cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）［J］. Biotechnol Bioeng, 2004, 87：54-62.

［21］Dong T, Zhao L, Huang Y, Tan X. Preparation of cross-linked aggregates of aminoacylase from Aspergillus melleus by using bovine serum albumin as an inert additive［J］. Bioresource Technology, 2010, 101：69-71.

［22］Cabirol FL, Tan PL, Tay B, et al. Linum usitatissimum hydroxynitrile lyase cross-linked enzyme aggregates：A recyclable enantioselective catalyst［J］. Advanced Synthesis & Catalysis, 2008, 350：29-38.

［23］Shamraja S, Abhijeet B, Mayur R, et al. LadoleMacromolecular cross-linked enzyme aggregates（M-CLEAs）of a-amylase［J］. Int J Biol Macromol, 2016, 84：69-78.

［24］楊緒娥. 固定化脂肪酶合成蔗糖-6-乙酸酯的研究［D］. 無錫：江南大學(xué), 2012.

［25］張晶晶. 交聯(lián)脂肪酶聚集體（CLEAs）的制備及其粒徑影響因素研究［D］. 北京：北京化工大學(xué), 2012.

［26］ Hormigo D, García-Hidalgo J, Acebal C, et al. Preparation and characterization of cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）of recombinant poly-3-hydroxybutyrate depolymerase from Streptomyces exfoliatus［J］. Bioresour Technol, 2012, 115：177-182.

［27］ Tükel SS, Hürrem F, Yildirim D, et al. Preparation of crosslinked enzyme aggregates（CLEA）of catalase and its characterization［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic, 2013, 97：252- 257.

［28］Vaidya BK, Kuwar SS, Golegaonkar SB, et al. Preparation of crosslinked enzyme aggregates of l-aminoacylase via co-aggregation with polyethyleneimine［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic, 2012, 74：184-191.

［29］Gupta P, Dutt K, Misra S, et al. Characterization of cross-linked immobilized lipase from thermophilic mould Thermomyces lanuginosa using glutaraldehyde［J］. Bioresource Technology, 2009, 100：74-80.

［30］Wang M, Qi W, Yu Q, et al. Cross-linking enzyme aggregates in the macropores of silica gel：A practical and efficient method for enzyme stabilization［J］. Biochemical Engineering Journal, 2010, 52：168-174.

［31］Wang M, Qi W, Jia C, et al. Enhancement of activity of cross-linked enzyme aggregates by a sugar-assisted precipitation strategy：Technical development and molecular mechanism［J］. Journal of Biotechnology, 2011, 56：30-38.

［32］Yang X, Zheng P, Ni Y, et al. Highly efficient biosynthesis of sucrose-6-acetate with cross-linked aggregates of Lipozyme TL 100 L［J］. Journal of Biotechnology, 2012, 161（1）：27-33.

［33］Sheldon RA, Schoevaart R, Lange LMV. Cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）：A novel and versatile method for enzyme immobilization（a review）［J］. Biocatalysis and Biotransformation, 2009, 23（3-4）：141-147.

［34］ Cao L. Immobilised enzymes：science or art?［J］. Current Opinion in Chemical Biology, 2005, 9（2）：217-226.

［35］Kim MI, Kim J, Lee J, et al. One-dimensional crosslinked enzyme aggregates in SBA-15：Superior catalytic behavior to conventional enzyme immobilization［J］. Microporous and Mesoporous Materials, 2008, 111（1）：18-23.

［36］Talekar S, Ghodake V, Ghotage T, et al. Novel magnetic crosslinked enzyme aggregates（magnetic CLEAs）of alpha amylase［J］. Bioresource Technology, 2012, 123（3）：542-547.

［37］Liu LL, Cen Y, Liu F, et al. Analysis of -amylase inhibitor from corni fructus by coupling magnetic cross-linked enzyme aggregates of -amylase with HPLC-MS［J］. Journal of Chromatography B, 2015, 995-996：64-69.

［38］Zhang WW, Yang XL, Jia JQ. Surfactant-activated magnetic crosslinked enzyme aggregates（magnetic CLEAs）of Thermomyces lanuginosus lipase for biodiesel production［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic, 2015, 115：83-89.

（責(zé)任編輯 李楠）

Preparation of Crosslinked Enzyme Aggregates of Glutathione Synthetases and Its Application

TIAN Hui YANG Feng-chen LU Hong-yu XU Qi YANG Yong
（Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co.，Ltd.，Taizhou 318000）

In order to reduce the cost in synthesis of glutathione（GSH），and concurrently to realize the enzyme storage and the commercialization，the glutathione synthetase was precipitated through appropriate precipitant，and immobilized crosslinked enzyme aggregates（CLEAs）were prepared by glutaraldehyde crosslinking. By optimizing the precipitation and crosslinking conditions，as well as the uses of protein concentration and additives，finally the optimal preparation condition was determined as：4℃，30 g/L protein concentration，adding PEI-600（additive W∶enzyme protein w = 1∶5）fully mixed with the enzyme solution，then 60% saturated ammonium sulfate added for precipitation for 4 h，and finally crosslinked by 0.5% glutaraldehyde. The final protein precipitation rate was 94.9% and the recovery of enzyme activity was 48.2%，enzyme activity per CLEAs was 4.9 U/g，respectively，compared to the control group 28.7% and 2.57 U/g，and increased by 19.5% and 2.33 U/g. The highest yield of GSH reached 11.26 g/L，GSH yield was 9.03 g/L in the 12th batches of conversion，and the relative enzyme activity was 78.4%；after 33 d storage at 4℃，the relative enzyme activity remained 92.12%. In conclusion，after optimizing the preparation conditions，the CLEAs of glutathione synthetases presented higher initial enzyme activity，which could be stably converted more than 10 batches，with favorable storage stability and solid industrialization prospects.

glutathione synthetases；immobilization；crosslinked enzyme aggregates；additives

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.034

2016-01-29

田慧，女，碩士研究生，研究方向：酶制劑與酶催化；E-mail：tianhui@hisunpharm.com

楊勇，男，博士研究生，研究方向：分子生物學(xué)與酶催化；E-mail：yyang@hisunpharm.com