CydDC蛋白的表達(dá)及對(duì)谷胱甘肽運(yùn)輸?shù)挠绊?/h1>
2016-12-21 02:54:40全聰張靜吳輝李志敏葉勤
生物技術(shù)通報(bào) 2016年11期
全聰 張靜 吳輝 李志敏 葉勤
（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）
CydDC蛋白的表達(dá)及對(duì)谷胱甘肽運(yùn)輸?shù)挠绊?/p>
全聰 張靜 吳輝 李志敏 葉勤
（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）
在重組大腸桿菌中共表達(dá)了谷胱甘肽運(yùn)輸?shù)鞍證ydDC與雙功能合成酶GshF，通過(guò)增強(qiáng)對(duì)谷胱甘肽的運(yùn)輸作用，提高谷胱甘肽產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目的蛋白CydDC及GshF均成功表達(dá)；重組菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）總谷胱甘肽產(chǎn)量為0.22 mmol/L，胞外谷胱甘肽含量顯著增加，達(dá)到81.9%，分別是對(duì)照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）的1.11倍和1.29倍。
谷胱甘肽；運(yùn)輸?shù)鞍?；共表達(dá)；重組大腸桿菌
谷胱甘肽（glutathione，GSH）是胞內(nèi)含量最豐富的硫醇類(lèi)化合物，普遍存在于哺乳動(dòng)物、植物、酵母及原核生物中，是由L-谷氨酸（L-Glu）、L-半胱氨酸（L-Cys）、甘氨酸（Gly）組成的三肽［1］。GSH的生物學(xué)意義主要?dú)w功于其半胱氨酸殘基上的巰基，因而具有獨(dú)特的氧化還原能力和親和屬性［2］。生物體蛋白質(zhì)及DNA的合成以及細(xì)胞周期調(diào)控均離不開(kāi)GSH的參與。同時(shí)，GSH還與細(xì)胞耐熱性、外分泌、生長(zhǎng)維持、調(diào)節(jié)氧化還原平衡、解毒及半胱氨酸的儲(chǔ)存和運(yùn)輸有關(guān)［3-6］。這種三肽還能調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及內(nèi)外源分子的膜運(yùn)輸，對(duì)維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用［7］。
GSH已經(jīng)廣泛應(yīng)用于制藥、食品及化妝品行業(yè)，市場(chǎng)上對(duì)GSH的需求與日俱增。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GSH因其低成本、小污染、高密度、條件溫和等特點(diǎn)而備受青睞，但胞內(nèi)高濃度的GSH積累造成的對(duì)關(guān)鍵合成酶的競(jìng)爭(zhēng)抑制以及胞內(nèi)毒性是GSH高產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化的兩大瓶頸［8，9］。雙功能酶基因gshF的發(fā)現(xiàn)解決了產(chǎn)物的抑制問(wèn)題，GshF同時(shí)具有谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）及谷胱甘肽合成酶（GS）活性，對(duì)GSH不敏感，在生產(chǎn)上具有極大潛力，在生產(chǎn)宿主中過(guò)表達(dá)gshF后，GSH的生產(chǎn)得到促進(jìn)，且檢測(cè)不到發(fā)酵中間物γ-谷氨酰半胱氨酸的存在［10］。當(dāng)GSH合成酶的活力問(wèn)題得到解決，高濃度GSH的胞內(nèi)毒性問(wèn)題就顯得非常突出。
利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)時(shí)，GSH的合成主要發(fā)生在胞內(nèi)，而GSH在胞內(nèi)主要以還原型多肽形式存在，產(chǎn)物積累過(guò)多會(huì)擾亂氧化還原平衡，對(duì)菌體生長(zhǎng)及代謝帶來(lái)嚴(yán)重影響，引起代謝控制阻遏產(chǎn)物積累，甚至導(dǎo)致細(xì)胞自溶［8］。因此將GSH由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外不僅是降低其胞內(nèi)積累的有效手段，而且也是提高產(chǎn)量的重要方法之一。同時(shí)，在GSH的下游提取過(guò)程中，因其為胞內(nèi)產(chǎn)物，要獲得純品就需先將其從細(xì)胞中提取出來(lái)，主要采用提取工藝中破碎法，但因釋放出GSH時(shí)會(huì)附帶出雜質(zhì)成分如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等細(xì)胞組分以及細(xì)胞碎片，使得分離過(guò)程耗時(shí)耗力、成本增加，如果GSH被細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，能節(jié)省不必要的工序、簡(jiǎn)化工藝［11］。此外，GSH在胞內(nèi)的平衡濃度及其生理功能也與其運(yùn)輸有關(guān)［12］，因此對(duì)GSH運(yùn)輸?shù)鞍椎难芯恐陵P(guān)重要。
關(guān)于原核生物的GSH運(yùn)輸?shù)鞍祝瑖?guó)外研究多有報(bào)道。Pittman等［13］確定了原核生物第一個(gè)GSH運(yùn)輸系統(tǒng)即CydDC復(fù)合物，該復(fù)合物為膜運(yùn)輸?shù)鞍祝\(yùn)輸過(guò)程需要ATP參與。CydDC作為大腸桿菌異質(zhì)二 聚 體ABC（ATP-binding cassette-type transporter）型運(yùn)輸系統(tǒng)，最初發(fā)現(xiàn)于E. coli細(xì)胞色素bd型末端氧化酶的裝配過(guò)程中；1993年發(fā)現(xiàn)其為ABC運(yùn)輸?shù)鞍祝?4］；2002年，證明cysteine經(jīng)CydDC進(jìn)入翻轉(zhuǎn)膜泡，最后被運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)達(dá)到壁膜間隙［15］；2005年證明該運(yùn)輸?shù)鞍啄苓\(yùn)輸GSH到周質(zhì)中。CydDC對(duì)還原型GSH有高親和力，但對(duì)氧化型及GSH結(jié)合物親和力低，故運(yùn)輸GSH而不運(yùn)輸GSSG。專(zhuān)利中也實(shí)現(xiàn)了CydDC的表達(dá)［16］。
為降低胞內(nèi)產(chǎn)物積累、減少生產(chǎn)阻遏及胞內(nèi)毒性進(jìn)而提高產(chǎn)量，本文重點(diǎn)研究目的蛋白CydDC的表達(dá)對(duì)產(chǎn)GSH重組大腸桿菌胞外GSH濃度的影響，以期促進(jìn)GSH的生產(chǎn)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及質(zhì)粒 本研究所使用的菌株及質(zhì)粒如表1所示。
表 1 菌株及質(zhì)粒
1.1.2 試劑及培養(yǎng)基
1.1.2.1 試劑 GSH標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；氯霉素、氨芐青霉素購(gòu)自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR MasterMix、Hind III、PrimeSTAR HS（Premix）購(gòu)自天根生化科技有限公司。
1.1.2.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani液體培養(yǎng)基：Tryptone 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃滅菌20 min。Luria-Bertani固體培養(yǎng)基：上述液體培養(yǎng)基中加入1.6 g/L瓊脂粉，121℃滅菌20 min。搖瓶培養(yǎng)基：含5 g/L glucose的50 mL Luria-Bertani液體培養(yǎng)基，葡萄糖與Luria-Bertani分開(kāi)滅菌，葡萄糖115℃滅菌20 min。培養(yǎng)基中添加合適的抗生素：氯霉素34 mg/L，氨芐青霉素50 mg/L。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 重組質(zhì)粒pBAD33-cydDC構(gòu)建過(guò)程，如圖1，根據(jù)載體pBAD33設(shè)計(jì)引物，使PCR擴(kuò)增出的目的片段cydDC兩端帶有載體的同源臂，cydDC上游引物序列含20 bp載體同源臂，序列為：5'-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGAGGAGGACAGCTATGAATAAATCTCGTCAAAA-3'（下劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn)，斜體部分為核糖體結(jié)合位點(diǎn)）；下游引物序列包含載體酶切位點(diǎn)Hind III右側(cè)20 bp同源臂，序列為：5'-CCGCCAAAACAGCCAAGCTT TTACAAACCCTGCTTGAACT-3'。PCR獲得目的片段后，利用ClonEXpressTMII試劑盒將cydDC片段與經(jīng)Hind III酶切后線性化的質(zhì)粒pBAD33進(jìn)行同源重組，37℃反應(yīng)30 min進(jìn)行連接，再將連接后得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MG1655感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氯霉素篩選出抗性重組菌。取質(zhì)粒pBAD33多克隆位點(diǎn)兩側(cè)各20 bp序列作為驗(yàn)證引物，其中上游引物序列為：5'-GCTCTTCTCGCTAACCAAAC-3'，下游引物序列為：5'-GTTCACCGACAAACAACAGAT-3'，對(duì)重組菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并且抽提質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
1.2.1.2 含雙質(zhì)粒的重組菌構(gòu)建 利用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTrc99a-as轉(zhuǎn)入大腸桿菌MG1655（pBAD33-cydDC），過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)含有氨芐青霉素及氯霉素的平板篩選，挑取單菌落，保種并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，待PCR驗(yàn)證后進(jìn)行蛋白電泳。
1.2.1.3 培養(yǎng) 重組菌于裝有3 mL Luria-Bertani液體培養(yǎng)基試管中復(fù)蘇，放于37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)9 h，轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)基，菌濃OD600=0.5時(shí)加入0.5 mmol/L IPTG及50 mmol/L阿拉伯糖誘導(dǎo)，并按時(shí)取樣，時(shí)間點(diǎn)為2.5、5和8.5 h，檢測(cè)發(fā)酵液及上清液中GSH的產(chǎn)量并計(jì)算其胞外含量。
圖1 質(zhì)粒pBAD33-cydDC構(gòu)建圖
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 菌體密度測(cè)定 菌體培養(yǎng)過(guò)程中，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在600 nm檢測(cè)菌液的吸光值。
1.2.2.2 GSH的測(cè)定 樣品經(jīng)三氯乙酸TCA處理20 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清液稀釋10倍后經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾處理方可進(jìn)樣。液相條件：C18柱（4.6×150 mmol/L），流動(dòng)相A為含0.01 mol/L庚烷磺酸鈉和0.05 mol/L磷酸二氫鉀的溶液（磷酸調(diào)pH3.0），流動(dòng)相B為甲醇；液相檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相為95%的A和5%的B的混合液，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30℃。
1.2.2.3 電泳分析 核酸電泳緩沖液及蛋白電泳緩沖液、染色、脫色液的配制參見(jiàn)《分子克隆》。
2 結(jié)果
2.1 重組菌MG1655（pBAD33-cydDC）的構(gòu)建
根據(jù)圖1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBAD33-cydDC的PCR驗(yàn)證結(jié)果，見(jiàn)圖2。以空質(zhì)粒pBAD33為模板，驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只能得到長(zhǎng)度不足100 bp的產(chǎn)物，而以重組質(zhì)粒為模板時(shí)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3 500 bp，測(cè)序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并順利獲得重組菌MG1655（pBAD33-cydDC）。
圖2 重組質(zhì)粒pBAD33-cydDC的PCR驗(yàn)證
2.2 重組蛋白CydDC的表達(dá)
重組菌株MG1655（pBAD33-cydDC）經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果如圖3所示。文獻(xiàn)報(bào)道中的CydDC兩亞基理論大小為61、59 kD［4］，圖中實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)兩條清晰區(qū)帶，與對(duì)照組相比，蛋白條帶亮度增加，且大小與理論值相吻合，表明目的蛋白成功表達(dá)。
圖3 重組菌cydDC基因的表達(dá)
2.3 重組菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）的蛋白表達(dá)
含雙質(zhì)粒的重組菌經(jīng)IPTG和阿拉伯糖誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組有3條清晰區(qū)帶，分別位于85、61和59 kD處，與理論位置相符，目的蛋白GshF及CydDC均表達(dá)成功。
圖4 重組菌目的基因的表達(dá)
2.4 谷胱甘肽的合成和運(yùn)輸
分別對(duì)MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）和MG-1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的谷胱甘肽合成。結(jié)果（圖5）顯示，誘導(dǎo)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，GSH產(chǎn)量逐漸增加，5 h達(dá)到最高，8.5 h因產(chǎn)物降解及氧化，產(chǎn)物積累有所降低。運(yùn)輸?shù)鞍證ydDC的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了產(chǎn)物谷胱甘肽的生產(chǎn)，5 h時(shí)重組菌MG1655（pTrc99a-as/ pBAD33-cydDC）的GSH產(chǎn)量是MG1655（pTrc99aas/pBAD33）的1.11倍。
胞外GSH含量對(duì)比結(jié)果（圖6）顯示，搖瓶培養(yǎng)時(shí)，對(duì)照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）胞外GSH含量達(dá)63.4%；過(guò)表達(dá)cydDC基因能促進(jìn)GSH的胞外運(yùn)輸，MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）胞外GSH占總GSH的81.9%，是對(duì)照的1.29倍。
3 討論
底物的有效輸出一直是高密度發(fā)酵法生產(chǎn)GSH所需解決的重要問(wèn)題之一，國(guó)內(nèi)外就如何提高胞外GSH含量做了許多研究。李華鐘等［17］構(gòu)建一株具有高谷胱甘肽合成活性的重組大腸肝菌，在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)菌體進(jìn)行通透性處理使得產(chǎn)物GSH分泌到細(xì)胞外，產(chǎn)量得到提高，但處理過(guò)程使用到甲苯等有毒的有機(jī)溶劑，不利于工業(yè)化。Perrone等［18］構(gòu)建一株重組酵母菌，過(guò)表達(dá)gshⅠ和gshⅡ，并失活hac1及hgt1等相關(guān)基因，使酵母菌發(fā)酵過(guò)程中GSH分泌到胞外，但專(zhuān)利報(bào)道總GSH產(chǎn)量?jī)H為0.06 mmol/L，胞外為0.03 mmol/L。Nie等［19］在利用產(chǎn)阮假絲酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，考察了低pH脅迫對(duì)GSH合成的影響，結(jié)果表明，在發(fā)酵24 h后將pH由5.5降至1.2并維持6 h，細(xì)胞內(nèi)的GSH幾乎全部釋放到胞外，GSH終產(chǎn)量是未處理前的1.25倍。
圖5 GSH生產(chǎn)對(duì)比
圖6 發(fā)酵樣品上清液中GSH含量對(duì)比
無(wú)論是添加表面活性劑對(duì)發(fā)酵菌體進(jìn)行通透性處理，還是改變發(fā)酵條件進(jìn)行脅迫，對(duì)GSH的分泌都起到一定作用，但同時(shí)也增加了發(fā)酵過(guò)程的操作難度及下游分離操作的難度，可見(jiàn)對(duì)菌體本身改造的重要性。
除了原核生物的GSH運(yùn)輸?shù)鞍?，真核生物的運(yùn)輸系統(tǒng)國(guó)外也有報(bào)道。Ballatori等［20］闡述了還原性谷胱甘肽的運(yùn)輸機(jī)制，介紹了膜蛋白家族MRP/CFTR/ABCC和OATP/SLC21A在谷胱甘肽運(yùn)輸中的作用。Kaluzna等［21］研究了大腸桿菌中谷胱甘肽S結(jié)合體的運(yùn)輸，證明了其與真核細(xì)胞運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程一致。Bourbouloux等［22］闡明了酵母高親密性谷胱甘肽輸入蛋白Hgt1p（OPT系統(tǒng)成員），該系統(tǒng)與其他酵母和一些植物中運(yùn)輸GSH的系統(tǒng)相似，但與大腸桿菌及大多高等真核生物中的不同。許善峰［23］專(zhuān)利中報(bào)道了一株重組畢赤酵母，能分泌生產(chǎn)GSH，其特征在于過(guò)表達(dá)基因MRP2突變體，并失活胞外向胞內(nèi)運(yùn)輸谷胱甘肽的基因Hgt1，產(chǎn)物的運(yùn)輸?shù)玫矫黠@改善，GSH產(chǎn)量也得到顯著提高。CydDC作為原核生物的膜結(jié)合型運(yùn)輸?shù)鞍祝壳吧袩o(wú)在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)以改善GSH運(yùn)輸?shù)膱?bào)道。本研究實(shí)現(xiàn)了GSH運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)，驗(yàn)證了其運(yùn)輸作用，對(duì)今后進(jìn)一步提高GSH發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。
4 結(jié)論
本研究在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)ABC型蛋白CydDC，并驗(yàn)證了其對(duì)谷胱甘肽的運(yùn)輸作用。過(guò)表達(dá)cydDC基因的重組菌，谷胱甘肽產(chǎn)量得到提高，達(dá)到0.22 mmol/L，且胞外GSH含量明顯增加，達(dá)到81.9%，分別是對(duì)照的1.11倍和1.29倍。
［1］Anderson ME. Glutathione：an overview of biosynthesis and modulation［J］. Chemico-Biological Interactions, 1998, 111-112：1-14.
［2］Penninckx MJ. A short review on the role of glutathione in the response of yeasts to nutritional, environmental, and oxidative stresses［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26（9-10）：737-742.
［3］DeLeve LD, Kaplowitz N. Importance and regulation of hepatic glutathione［J］. Seminnars in Liver Disease, 1990, 10（4）：251-266.
［4］Meister A. New developments in glutathione metabolism and their potential application in therapy［J］. Hepatology, 1984, 4（4）：739-742 .
［5］Meister A, Anderson ME. Glutathione［J］. Annual Review of Biochemistry, 1983, 52：711-760.
［6］Wang W, Ballatori N. Endogenous glutathione conjugates：occurrence and biological functions［J］. Pharmacological Reviews, 1998, 50（3）：335-356.
［7］Hammond CL, Lee TK, Ballatori N. Novel roles for glutathione in gene expression, cell death, andmembrane transport of organic solutes［J］. Journal of Hepatology, 2001, 34（6）：946-954.
［8］Paul GR, Alton M. Regulation of γ-glutamyl-cysteine synthetase by nonallosteric feedback inhibition by glutathione［J］. The Journal of Biological Chemistry, 1975, 250（4）：1422-1426.
［9］Srikanth CV, Bachhawat AK, Bourbouloux A. Multiple cis-regulatory elements and the yeast sulphur regulatory network are required for the regulation of the yeast glutathione transporter, Hgt1p［J］. Current Genetics, 2005, 47（6）：345-358.
［10］Ge S, Zhu T, Li Y. Expression of bacterial GshF in Pichia pastoris for glutathione production［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78（15）：5435-5439.
［11］野口真夫. 谷胱甘肽精制法：日本, 52100421［P］. 1997.
［12］Ballatori N, Krance SM. Plasma membrane glutathione transporters and their roles in cell physiology and pathophysiology［J］. Mol Aspects Med, 2009, 30（1-2）：13-28.
［13］ Pittman MS, Robinson HC, Poole RK. A Bacterial glutathione transporter（Escherichia coli CydDC）exports reductant to the periplasm［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280（37）：32254-32261.
［14］RK Poole. Cytochrome bd biosynthesis in Escherichia coli：the sequences of the cydC and cydD genes suggest that they encode the components of an ABC membrane transporter［J］. Molecular Microbiology, 1993, 10（2）：421-430.
［15］Pittman MS, Corker H. Cysteine is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CydDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly［J］. J Biol Chem, 2002, 277（51）：49841-49849.
［16］Poole R. Overexpression of the cyddc transporter. WO 2004/113373 A1［P］. 2004.
［17］李華鐘, 李寅, 林金萍, 等. 具有高谷胱甘肽合成活性重組大腸桿菌的構(gòu)建及合成反應(yīng)過(guò)程［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2001, 41（1）：16-23.
［18］Perrone GG, Dawes IW, Grant CM. Glutathione production. WO 2004/003217 A1［P］. 2004.
［19］Nie W, Wei G, Du G, et al. Enhanced intracellular glutathione synthesis and excretion capability of Candida utilis by using a low pH-stress strategy［J］. Lett Appl Microbiol, 2005, 40（5）：378-384.
［20］Ballatori N, Hammond CL, Cunningham JB, et al. Molecular mechanisms of reduced glutathione transport：role of MRP/CFTR/ ABCC and OATP/SLC21A families of membrane proteins［J］. Toxicology and Applied Pharmacology, 2005, 204（3）：238-255.
［21］Kaluzna A, Bartosz G. Transport of glutathione s-conjugates in Escherichia coli［J］. Biochemistry and Molecular Biology for Life Scientists, 1997, 43（1）：161-171.
［22］Bourbouloux A, Shahi P, Chakladar A, et al. Hgt1p, a high affinity glutathione transporter from the yeast Sacchraomyces cerevisiae［J］. J Biol Chem, 2000, 275（18）：13259-13265.
［23］許善峰. 分泌生產(chǎn)谷胱甘肽的重組菌株及其制備方法：中國(guó), 103087932A［P］. 2013-05-08.
（責(zé)任編輯 狄艷紅）
Expression of CydDC in Escherichia coli and the Effect of It on Glutathione Transportation
QUAN Cong ZHANG Jing WU Hui LI Zhi-min YE Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
This study is to co-express the CydDC and GshF in the recombinant Escherichia coli，and to increases the glutathione production by enhancing glutathione transportation. As the results from the experiments，the target protein CydDC and GshF were successfully expressed，the glutathione production of MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）reached 0.22 mmol/L，and the content of glutathione in supernatant significantly increased and reached 81.9%，which was 1.11-fold and 1.29-fold of control strain MG1655（pTrc99a-as/pBAD33），respectively.
glutathione；transporter；co-expression；recombinant Escherichia coli
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.033
2016-03-23
上海市產(chǎn)學(xué)研醫(yī)合作項(xiàng)目
全聰，男，碩士，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：masterjackiequan@163.com
李志敏，女，博士，教授，研究方向：生物化工、發(fā)酵工程、代謝工程及微生物生理和代謝調(diào)控；E-mail：lizm@ecust.edu.cn
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全聰 張靜 吳輝 李志敏 葉勤
（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）
CydDC蛋白的表達(dá)及對(duì)谷胱甘肽運(yùn)輸?shù)挠绊?/p>
全聰 張靜 吳輝 李志敏 葉勤
（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）
在重組大腸桿菌中共表達(dá)了谷胱甘肽運(yùn)輸?shù)鞍證ydDC與雙功能合成酶GshF，通過(guò)增強(qiáng)對(duì)谷胱甘肽的運(yùn)輸作用，提高谷胱甘肽產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目的蛋白CydDC及GshF均成功表達(dá)；重組菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）總谷胱甘肽產(chǎn)量為0.22 mmol/L，胞外谷胱甘肽含量顯著增加，達(dá)到81.9%，分別是對(duì)照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）的1.11倍和1.29倍。
谷胱甘肽；運(yùn)輸?shù)鞍?；共表達(dá)；重組大腸桿菌
谷胱甘肽（glutathione，GSH）是胞內(nèi)含量最豐富的硫醇類(lèi)化合物，普遍存在于哺乳動(dòng)物、植物、酵母及原核生物中，是由L-谷氨酸（L-Glu）、L-半胱氨酸（L-Cys）、甘氨酸（Gly）組成的三肽［1］。GSH的生物學(xué)意義主要?dú)w功于其半胱氨酸殘基上的巰基，因而具有獨(dú)特的氧化還原能力和親和屬性［2］。生物體蛋白質(zhì)及DNA的合成以及細(xì)胞周期調(diào)控均離不開(kāi)GSH的參與。同時(shí)，GSH還與細(xì)胞耐熱性、外分泌、生長(zhǎng)維持、調(diào)節(jié)氧化還原平衡、解毒及半胱氨酸的儲(chǔ)存和運(yùn)輸有關(guān)［3-6］。這種三肽還能調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及內(nèi)外源分子的膜運(yùn)輸，對(duì)維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用［7］。
GSH已經(jīng)廣泛應(yīng)用于制藥、食品及化妝品行業(yè)，市場(chǎng)上對(duì)GSH的需求與日俱增。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GSH因其低成本、小污染、高密度、條件溫和等特點(diǎn)而備受青睞，但胞內(nèi)高濃度的GSH積累造成的對(duì)關(guān)鍵合成酶的競(jìng)爭(zhēng)抑制以及胞內(nèi)毒性是GSH高產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化的兩大瓶頸［8，9］。雙功能酶基因gshF的發(fā)現(xiàn)解決了產(chǎn)物的抑制問(wèn)題，GshF同時(shí)具有谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）及谷胱甘肽合成酶（GS）活性，對(duì)GSH不敏感，在生產(chǎn)上具有極大潛力，在生產(chǎn)宿主中過(guò)表達(dá)gshF后，GSH的生產(chǎn)得到促進(jìn)，且檢測(cè)不到發(fā)酵中間物γ-谷氨酰半胱氨酸的存在［10］。當(dāng)GSH合成酶的活力問(wèn)題得到解決，高濃度GSH的胞內(nèi)毒性問(wèn)題就顯得非常突出。
利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)時(shí)，GSH的合成主要發(fā)生在胞內(nèi)，而GSH在胞內(nèi)主要以還原型多肽形式存在，產(chǎn)物積累過(guò)多會(huì)擾亂氧化還原平衡，對(duì)菌體生長(zhǎng)及代謝帶來(lái)嚴(yán)重影響，引起代謝控制阻遏產(chǎn)物積累，甚至導(dǎo)致細(xì)胞自溶［8］。因此將GSH由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外不僅是降低其胞內(nèi)積累的有效手段，而且也是提高產(chǎn)量的重要方法之一。同時(shí)，在GSH的下游提取過(guò)程中，因其為胞內(nèi)產(chǎn)物，要獲得純品就需先將其從細(xì)胞中提取出來(lái)，主要采用提取工藝中破碎法，但因釋放出GSH時(shí)會(huì)附帶出雜質(zhì)成分如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等細(xì)胞組分以及細(xì)胞碎片，使得分離過(guò)程耗時(shí)耗力、成本增加，如果GSH被細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，能節(jié)省不必要的工序、簡(jiǎn)化工藝［11］。此外，GSH在胞內(nèi)的平衡濃度及其生理功能也與其運(yùn)輸有關(guān)［12］，因此對(duì)GSH運(yùn)輸?shù)鞍椎难芯恐陵P(guān)重要。
關(guān)于原核生物的GSH運(yùn)輸?shù)鞍祝瑖?guó)外研究多有報(bào)道。Pittman等［13］確定了原核生物第一個(gè)GSH運(yùn)輸系統(tǒng)即CydDC復(fù)合物，該復(fù)合物為膜運(yùn)輸?shù)鞍祝\(yùn)輸過(guò)程需要ATP參與。CydDC作為大腸桿菌異質(zhì)二 聚 體ABC（ATP-binding cassette-type transporter）型運(yùn)輸系統(tǒng)，最初發(fā)現(xiàn)于E. coli細(xì)胞色素bd型末端氧化酶的裝配過(guò)程中；1993年發(fā)現(xiàn)其為ABC運(yùn)輸?shù)鞍祝?4］；2002年，證明cysteine經(jīng)CydDC進(jìn)入翻轉(zhuǎn)膜泡，最后被運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)達(dá)到壁膜間隙［15］；2005年證明該運(yùn)輸?shù)鞍啄苓\(yùn)輸GSH到周質(zhì)中。CydDC對(duì)還原型GSH有高親和力，但對(duì)氧化型及GSH結(jié)合物親和力低，故運(yùn)輸GSH而不運(yùn)輸GSSG。專(zhuān)利中也實(shí)現(xiàn)了CydDC的表達(dá)［16］。
為降低胞內(nèi)產(chǎn)物積累、減少生產(chǎn)阻遏及胞內(nèi)毒性進(jìn)而提高產(chǎn)量，本文重點(diǎn)研究目的蛋白CydDC的表達(dá)對(duì)產(chǎn)GSH重組大腸桿菌胞外GSH濃度的影響，以期促進(jìn)GSH的生產(chǎn)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及質(zhì)粒 本研究所使用的菌株及質(zhì)粒如表1所示。
表 1 菌株及質(zhì)粒
1.1.2 試劑及培養(yǎng)基
1.1.2.1 試劑 GSH標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；氯霉素、氨芐青霉素購(gòu)自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR MasterMix、Hind III、PrimeSTAR HS（Premix）購(gòu)自天根生化科技有限公司。
1.1.2.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani液體培養(yǎng)基：Tryptone 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃滅菌20 min。Luria-Bertani固體培養(yǎng)基：上述液體培養(yǎng)基中加入1.6 g/L瓊脂粉，121℃滅菌20 min。搖瓶培養(yǎng)基：含5 g/L glucose的50 mL Luria-Bertani液體培養(yǎng)基，葡萄糖與Luria-Bertani分開(kāi)滅菌，葡萄糖115℃滅菌20 min。培養(yǎng)基中添加合適的抗生素：氯霉素34 mg/L，氨芐青霉素50 mg/L。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 重組質(zhì)粒pBAD33-cydDC構(gòu)建過(guò)程，如圖1，根據(jù)載體pBAD33設(shè)計(jì)引物，使PCR擴(kuò)增出的目的片段cydDC兩端帶有載體的同源臂，cydDC上游引物序列含20 bp載體同源臂，序列為：5'-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGAGGAGGACAGCTATGAATAAATCTCGTCAAAA-3'（下劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn)，斜體部分為核糖體結(jié)合位點(diǎn)）；下游引物序列包含載體酶切位點(diǎn)Hind III右側(cè)20 bp同源臂，序列為：5'-CCGCCAAAACAGCCAAGCTT TTACAAACCCTGCTTGAACT-3'。PCR獲得目的片段后，利用ClonEXpressTMII試劑盒將cydDC片段與經(jīng)Hind III酶切后線性化的質(zhì)粒pBAD33進(jìn)行同源重組，37℃反應(yīng)30 min進(jìn)行連接，再將連接后得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MG1655感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氯霉素篩選出抗性重組菌。取質(zhì)粒pBAD33多克隆位點(diǎn)兩側(cè)各20 bp序列作為驗(yàn)證引物，其中上游引物序列為：5'-GCTCTTCTCGCTAACCAAAC-3'，下游引物序列為：5'-GTTCACCGACAAACAACAGAT-3'，對(duì)重組菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并且抽提質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
1.2.1.2 含雙質(zhì)粒的重組菌構(gòu)建 利用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTrc99a-as轉(zhuǎn)入大腸桿菌MG1655（pBAD33-cydDC），過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)含有氨芐青霉素及氯霉素的平板篩選，挑取單菌落，保種并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，待PCR驗(yàn)證后進(jìn)行蛋白電泳。
1.2.1.3 培養(yǎng) 重組菌于裝有3 mL Luria-Bertani液體培養(yǎng)基試管中復(fù)蘇，放于37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)9 h，轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)基，菌濃OD600=0.5時(shí)加入0.5 mmol/L IPTG及50 mmol/L阿拉伯糖誘導(dǎo)，并按時(shí)取樣，時(shí)間點(diǎn)為2.5、5和8.5 h，檢測(cè)發(fā)酵液及上清液中GSH的產(chǎn)量并計(jì)算其胞外含量。
圖1 質(zhì)粒pBAD33-cydDC構(gòu)建圖
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 菌體密度測(cè)定 菌體培養(yǎng)過(guò)程中，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在600 nm檢測(cè)菌液的吸光值。
1.2.2.2 GSH的測(cè)定 樣品經(jīng)三氯乙酸TCA處理20 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清液稀釋10倍后經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾處理方可進(jìn)樣。液相條件：C18柱（4.6×150 mmol/L），流動(dòng)相A為含0.01 mol/L庚烷磺酸鈉和0.05 mol/L磷酸二氫鉀的溶液（磷酸調(diào)pH3.0），流動(dòng)相B為甲醇；液相檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相為95%的A和5%的B的混合液，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30℃。
1.2.2.3 電泳分析 核酸電泳緩沖液及蛋白電泳緩沖液、染色、脫色液的配制參見(jiàn)《分子克隆》。
2 結(jié)果
2.1 重組菌MG1655（pBAD33-cydDC）的構(gòu)建
根據(jù)圖1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBAD33-cydDC的PCR驗(yàn)證結(jié)果，見(jiàn)圖2。以空質(zhì)粒pBAD33為模板，驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只能得到長(zhǎng)度不足100 bp的產(chǎn)物，而以重組質(zhì)粒為模板時(shí)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3 500 bp，測(cè)序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并順利獲得重組菌MG1655（pBAD33-cydDC）。
圖2 重組質(zhì)粒pBAD33-cydDC的PCR驗(yàn)證
2.2 重組蛋白CydDC的表達(dá)
重組菌株MG1655（pBAD33-cydDC）經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果如圖3所示。文獻(xiàn)報(bào)道中的CydDC兩亞基理論大小為61、59 kD［4］，圖中實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)兩條清晰區(qū)帶，與對(duì)照組相比，蛋白條帶亮度增加，且大小與理論值相吻合，表明目的蛋白成功表達(dá)。
圖3 重組菌cydDC基因的表達(dá)
2.3 重組菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）的蛋白表達(dá)
含雙質(zhì)粒的重組菌經(jīng)IPTG和阿拉伯糖誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組有3條清晰區(qū)帶，分別位于85、61和59 kD處，與理論位置相符，目的蛋白GshF及CydDC均表達(dá)成功。
圖4 重組菌目的基因的表達(dá)
2.4 谷胱甘肽的合成和運(yùn)輸
分別對(duì)MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）和MG-1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的谷胱甘肽合成。結(jié)果（圖5）顯示，誘導(dǎo)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，GSH產(chǎn)量逐漸增加，5 h達(dá)到最高，8.5 h因產(chǎn)物降解及氧化，產(chǎn)物積累有所降低。運(yùn)輸?shù)鞍證ydDC的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了產(chǎn)物谷胱甘肽的生產(chǎn)，5 h時(shí)重組菌MG1655（pTrc99a-as/ pBAD33-cydDC）的GSH產(chǎn)量是MG1655（pTrc99aas/pBAD33）的1.11倍。
胞外GSH含量對(duì)比結(jié)果（圖6）顯示，搖瓶培養(yǎng)時(shí)，對(duì)照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）胞外GSH含量達(dá)63.4%；過(guò)表達(dá)cydDC基因能促進(jìn)GSH的胞外運(yùn)輸，MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）胞外GSH占總GSH的81.9%，是對(duì)照的1.29倍。
3 討論
底物的有效輸出一直是高密度發(fā)酵法生產(chǎn)GSH所需解決的重要問(wèn)題之一，國(guó)內(nèi)外就如何提高胞外GSH含量做了許多研究。李華鐘等［17］構(gòu)建一株具有高谷胱甘肽合成活性的重組大腸肝菌，在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)菌體進(jìn)行通透性處理使得產(chǎn)物GSH分泌到細(xì)胞外，產(chǎn)量得到提高，但處理過(guò)程使用到甲苯等有毒的有機(jī)溶劑，不利于工業(yè)化。Perrone等［18］構(gòu)建一株重組酵母菌，過(guò)表達(dá)gshⅠ和gshⅡ，并失活hac1及hgt1等相關(guān)基因，使酵母菌發(fā)酵過(guò)程中GSH分泌到胞外，但專(zhuān)利報(bào)道總GSH產(chǎn)量?jī)H為0.06 mmol/L，胞外為0.03 mmol/L。Nie等［19］在利用產(chǎn)阮假絲酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，考察了低pH脅迫對(duì)GSH合成的影響，結(jié)果表明，在發(fā)酵24 h后將pH由5.5降至1.2并維持6 h，細(xì)胞內(nèi)的GSH幾乎全部釋放到胞外，GSH終產(chǎn)量是未處理前的1.25倍。
圖5 GSH生產(chǎn)對(duì)比
圖6 發(fā)酵樣品上清液中GSH含量對(duì)比
無(wú)論是添加表面活性劑對(duì)發(fā)酵菌體進(jìn)行通透性處理，還是改變發(fā)酵條件進(jìn)行脅迫，對(duì)GSH的分泌都起到一定作用，但同時(shí)也增加了發(fā)酵過(guò)程的操作難度及下游分離操作的難度，可見(jiàn)對(duì)菌體本身改造的重要性。
除了原核生物的GSH運(yùn)輸?shù)鞍?，真核生物的運(yùn)輸系統(tǒng)國(guó)外也有報(bào)道。Ballatori等［20］闡述了還原性谷胱甘肽的運(yùn)輸機(jī)制，介紹了膜蛋白家族MRP/CFTR/ABCC和OATP/SLC21A在谷胱甘肽運(yùn)輸中的作用。Kaluzna等［21］研究了大腸桿菌中谷胱甘肽S結(jié)合體的運(yùn)輸，證明了其與真核細(xì)胞運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程一致。Bourbouloux等［22］闡明了酵母高親密性谷胱甘肽輸入蛋白Hgt1p（OPT系統(tǒng)成員），該系統(tǒng)與其他酵母和一些植物中運(yùn)輸GSH的系統(tǒng)相似，但與大腸桿菌及大多高等真核生物中的不同。許善峰［23］專(zhuān)利中報(bào)道了一株重組畢赤酵母，能分泌生產(chǎn)GSH，其特征在于過(guò)表達(dá)基因MRP2突變體，并失活胞外向胞內(nèi)運(yùn)輸谷胱甘肽的基因Hgt1，產(chǎn)物的運(yùn)輸?shù)玫矫黠@改善，GSH產(chǎn)量也得到顯著提高。CydDC作為原核生物的膜結(jié)合型運(yùn)輸?shù)鞍祝壳吧袩o(wú)在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)以改善GSH運(yùn)輸?shù)膱?bào)道。本研究實(shí)現(xiàn)了GSH運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)，驗(yàn)證了其運(yùn)輸作用，對(duì)今后進(jìn)一步提高GSH發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。
4 結(jié)論
本研究在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)ABC型蛋白CydDC，并驗(yàn)證了其對(duì)谷胱甘肽的運(yùn)輸作用。過(guò)表達(dá)cydDC基因的重組菌，谷胱甘肽產(chǎn)量得到提高，達(dá)到0.22 mmol/L，且胞外GSH含量明顯增加，達(dá)到81.9%，分別是對(duì)照的1.11倍和1.29倍。
［1］Anderson ME. Glutathione：an overview of biosynthesis and modulation［J］. Chemico-Biological Interactions, 1998, 111-112：1-14.
［2］Penninckx MJ. A short review on the role of glutathione in the response of yeasts to nutritional, environmental, and oxidative stresses［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26（9-10）：737-742.
［3］DeLeve LD, Kaplowitz N. Importance and regulation of hepatic glutathione［J］. Seminnars in Liver Disease, 1990, 10（4）：251-266.
［4］Meister A. New developments in glutathione metabolism and their potential application in therapy［J］. Hepatology, 1984, 4（4）：739-742 .
［5］Meister A, Anderson ME. Glutathione［J］. Annual Review of Biochemistry, 1983, 52：711-760.
［6］Wang W, Ballatori N. Endogenous glutathione conjugates：occurrence and biological functions［J］. Pharmacological Reviews, 1998, 50（3）：335-356.
［7］Hammond CL, Lee TK, Ballatori N. Novel roles for glutathione in gene expression, cell death, andmembrane transport of organic solutes［J］. Journal of Hepatology, 2001, 34（6）：946-954.
［8］Paul GR, Alton M. Regulation of γ-glutamyl-cysteine synthetase by nonallosteric feedback inhibition by glutathione［J］. The Journal of Biological Chemistry, 1975, 250（4）：1422-1426.
［9］Srikanth CV, Bachhawat AK, Bourbouloux A. Multiple cis-regulatory elements and the yeast sulphur regulatory network are required for the regulation of the yeast glutathione transporter, Hgt1p［J］. Current Genetics, 2005, 47（6）：345-358.
［10］Ge S, Zhu T, Li Y. Expression of bacterial GshF in Pichia pastoris for glutathione production［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78（15）：5435-5439.
［11］野口真夫. 谷胱甘肽精制法：日本, 52100421［P］. 1997.
［12］Ballatori N, Krance SM. Plasma membrane glutathione transporters and their roles in cell physiology and pathophysiology［J］. Mol Aspects Med, 2009, 30（1-2）：13-28.
［13］ Pittman MS, Robinson HC, Poole RK. A Bacterial glutathione transporter（Escherichia coli CydDC）exports reductant to the periplasm［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280（37）：32254-32261.
［14］RK Poole. Cytochrome bd biosynthesis in Escherichia coli：the sequences of the cydC and cydD genes suggest that they encode the components of an ABC membrane transporter［J］. Molecular Microbiology, 1993, 10（2）：421-430.
［15］Pittman MS, Corker H. Cysteine is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CydDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly［J］. J Biol Chem, 2002, 277（51）：49841-49849.
［16］Poole R. Overexpression of the cyddc transporter. WO 2004/113373 A1［P］. 2004.
［17］李華鐘, 李寅, 林金萍, 等. 具有高谷胱甘肽合成活性重組大腸桿菌的構(gòu)建及合成反應(yīng)過(guò)程［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2001, 41（1）：16-23.
［18］Perrone GG, Dawes IW, Grant CM. Glutathione production. WO 2004/003217 A1［P］. 2004.
［19］Nie W, Wei G, Du G, et al. Enhanced intracellular glutathione synthesis and excretion capability of Candida utilis by using a low pH-stress strategy［J］. Lett Appl Microbiol, 2005, 40（5）：378-384.
［20］Ballatori N, Hammond CL, Cunningham JB, et al. Molecular mechanisms of reduced glutathione transport：role of MRP/CFTR/ ABCC and OATP/SLC21A families of membrane proteins［J］. Toxicology and Applied Pharmacology, 2005, 204（3）：238-255.
［21］Kaluzna A, Bartosz G. Transport of glutathione s-conjugates in Escherichia coli［J］. Biochemistry and Molecular Biology for Life Scientists, 1997, 43（1）：161-171.
［22］Bourbouloux A, Shahi P, Chakladar A, et al. Hgt1p, a high affinity glutathione transporter from the yeast Sacchraomyces cerevisiae［J］. J Biol Chem, 2000, 275（18）：13259-13265.
［23］許善峰. 分泌生產(chǎn)谷胱甘肽的重組菌株及其制備方法：中國(guó), 103087932A［P］. 2013-05-08.
（責(zé)任編輯 狄艷紅）
Expression of CydDC in Escherichia coli and the Effect of It on Glutathione Transportation
QUAN Cong ZHANG Jing WU Hui LI Zhi-min YE Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
This study is to co-express the CydDC and GshF in the recombinant Escherichia coli，and to increases the glutathione production by enhancing glutathione transportation. As the results from the experiments，the target protein CydDC and GshF were successfully expressed，the glutathione production of MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）reached 0.22 mmol/L，and the content of glutathione in supernatant significantly increased and reached 81.9%，which was 1.11-fold and 1.29-fold of control strain MG1655（pTrc99a-as/pBAD33），respectively.
glutathione；transporter；co-expression；recombinant Escherichia coli
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.033
2016-03-23
上海市產(chǎn)學(xué)研醫(yī)合作項(xiàng)目
全聰，男，碩士，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：masterjackiequan@163.com
李志敏，女，博士，教授，研究方向：生物化工、發(fā)酵工程、代謝工程及微生物生理和代謝調(diào)控；E-mail：lizm@ecust.edu.cn
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