維生素K2合成途徑中主要酶對MK-7產(chǎn)量的影響

徐建中 王穎妤 嚴(yán)為留 張偉國

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122）

維生素K2合成途徑中主要酶對MK-7產(chǎn)量的影響

徐建中 王穎妤 嚴(yán)為留 張偉國

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122）

對菌株Y-2維生素K2合成途徑中的6個(gè)主要酶基因分別進(jìn)行克隆和表達(dá)，以探索不同酶基因?qū)K-7產(chǎn)量的影響。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》完成對基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建，并對spizizen轉(zhuǎn)化法進(jìn)行改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒對菌株Y-2的轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，分別過量表達(dá)維生素K2合成途徑中的6個(gè)基因均能提高M(jìn)K-7的產(chǎn)量。需要指出的是，過表達(dá)基因hep S對MK-7產(chǎn)量的影響最大，其中在搖瓶培養(yǎng)組的產(chǎn)量提高了38%，靜置培養(yǎng)組的產(chǎn)量提高了48%。其余幾個(gè)基因過表達(dá)后對MK-7產(chǎn)量的影響則根據(jù)培養(yǎng)方式的不同而各有差異。

解淀粉芽孢桿菌；甲萘醌-7；合成途徑；催化酶

甲萘醌-7是維生素K2（又稱甲萘醌，MK-n）中的一員，因甲基萘醌母環(huán)C-3位置上含有7個(gè)異戊二烯單元的異戊二烯側(cè)鏈組成，因而稱為MK-7（圖1）。MK-7具有較長的半衰期，可在血液中穩(wěn)定存在，因而是哺乳動物中凝血因子II、VII、IX和X的一個(gè)重要的輔因子，參與血液凝固［1，2］。在調(diào)節(jié)骨骼生長方面，因MK-7可以抑制成骨細(xì)胞的生長，從而刺激成骨細(xì)胞的分化，形成骨頭。國外學(xué)者指出，補(bǔ)充一定量的MK-7能夠提高骨頭中的礦物質(zhì)密度（BMD），降低髖骨骨折風(fēng)險(xiǎn)［3］，還有利于提高骨鈣蛋白的羧化作用［4］。此外，MK-7可降低血壓［5］，促進(jìn)以神經(jīng)生長因子為媒介的PC 12D細(xì)胞的軸突生長［6］，通過調(diào)控Ca2+的利用和促進(jìn)Gla蛋白質(zhì)（matrix gla protein，MGP）的活性，防止鈣質(zhì)在血管中沉淀而造成的動脈硬化［7］等。MK-7具有多種生理功能，因此MK-7作為新一代的保健食品，其功能正在受到越來越多的關(guān)注。

MK-7等維生素K2同系物都是由一個(gè)相同的甲萘醌母環(huán)和含有不同異戊二烯單元個(gè)數(shù)的側(cè)鏈組成。其中甲萘醌母環(huán)是從赤蘚糖-4-磷酸開始合成，經(jīng)過莽草酸、分枝酸、異分枝酸、2-琥珀酰-6-羥基-2，4-環(huán)己二烯-1-羥酸（SHCHC）以及鄰苯甲酸（OSB）等中間化合物，合成萘醌母環(huán)1，4-二羥基-2-萘甲酸DNHA。其中分枝酸又是合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸3種芳香族氨基酸的前體物質(zhì)，因此甲萘醌母環(huán)的合成又會受到這3種氨基酸的反饋抑制。乙酰CoA是異戊二烯側(cè)鏈合成的起始化合物，經(jīng)過甲羥戊酸、異戊烯焦磷酸、牛兒基香葉基焦磷酸等中間物質(zhì)，合成側(cè)鏈聚異戊二烯焦磷酸。萘醌母環(huán)和側(cè)鏈經(jīng)酶催化合成后再經(jīng)過一步甲基化反應(yīng)就合成了最終的維生素K2。圖1是作者根據(jù)KEGG公布的代謝網(wǎng)絡(luò)繪制的MK-7合成途徑［8］，在這個(gè)過程中，共有8個(gè)酶控制從異分枝酸開始的甲萘醌母環(huán)的合成以及從異戊烯焦磷酸開始的側(cè)鏈的合成，共有9個(gè)基因參與這一過程，它們分別是men A、men B、men C、men D、men E、men G、men H、hep T和hep S，其中hep T和hep S控制同一個(gè)酶的兩個(gè)亞基的合成。這些合成基因的公布對進(jìn)一步研究維生素K2的代謝途徑具有重要的意義。以此為研究背景，本研究考察MK-7合成途徑中上述酶基因過表達(dá)后對MK-7合成的影響，旨為探討MK-7合成途徑中代謝調(diào)控機(jī)制和為后期采用代謝工程手段選育高產(chǎn)MK-7菌株提供理論參考和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 MK-7的合成途徑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒 篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌Y-2（Bacillus amyloliquefaciens Y-2），保藏于武漢中國典型微生物保藏中心（CCTCC），保藏號：CCTCC M 2013493。大腸桿菌JM109（Escherichia coli JM109）、枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis 168）、質(zhì)粒pMA5保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15、蛋白胨15、KH2PO41、K2HPO4·3H2O 2.5、MgSO4·7H2O 2.5，pH7.0-7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：1 L 玉米粉液化液（玉米粉在100℃下經(jīng)高溫α-淀粉酶處理30 min）、豆粕粉41.52，大豆蛋白胨16.31、酵母膏15.51、K2HPO4·3H2O 0.13、NaCl3.11，pH7.0-7.2。LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、pH7.0-7.2添加5 g/L葡萄糖即為LBG培養(yǎng)基，添加15 g/L瓊脂即為相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，必要時(shí)補(bǔ)加終濃度為100 mg/L氨芐青霉素用于重組大腸桿菌的篩選或者50 mg/L卡那霉素用于重組芽孢桿菌的篩選。B. subtilis轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：① SPI培養(yǎng)基（20 mL）：9.8 mL SPI-A鹽溶液（2 μL Na3C6H5O7·2H2O、4 g/L（NH4）2SO4、28 g/L K2HPO4·3H2O，12 g/L KH2PO4）、9.8 mL SPI-B溶液（0.4 g/L MgSO4·7H2O）、200 μL 100×CAYE溶液（20 g/L酪蛋白水解物，100 g/L酵母提取物）、200 μL 500 g/L葡萄糖溶液；② SPII培養(yǎng)基（6 mL）：5.88 mL SPI培養(yǎng)基，60 μL 50 mmol/L CaCl2溶液，60 μL 250 mmol/L MgCl2溶液。B. amyloliquefaciens轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方基本同上，只是在SPI-B鹽溶液中加入終濃度為40 mL/L吐溫-80，其他組分不變。除發(fā)酵培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基在0.1 MPa下高壓滅菌20 min，而發(fā)酵培養(yǎng)基在0.07 MPa下高壓滅菌20 min。菌體培養(yǎng)溫度為（37±1）℃，培養(yǎng)時(shí)間為8-12 h。非特殊說明，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)將對數(shù)生長期的種子液按2%（v/v）接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在（37± 1）℃條件下的往復(fù)式搖床上培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化方法 E. coli感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化方法參照Green和Sambrook指出的方法，采用CaCl2溶液處理制備E. coli感受態(tài)細(xì)胞并采用冰浴熱激的方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化［9］。采用李瑞芳等［10］的方法，完成對B. subtilis和B. amyloliquefaciens感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化。

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建 首先通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得不同基因的片段，其中片段大小、所使用的引物及其PCR條件如表1所示。隨后，參照Sambrook和Russel建立的遺傳改造方法，構(gòu)建含有不同基因的重組表達(dá)質(zhì)粒（圖2）。最后，參照經(jīng)典的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化法（即spizizen轉(zhuǎn)化法）［11］，將上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B. subtilis 168或菌株Y-2，獲得不同重組菌株。

1.2.3 MK-7的提取與檢測方法 參照Berenjian等［12］和嚴(yán)為留等［13］建立的方法對樣品中MK-7進(jìn)行提取，整個(gè)提取過程盡量避光，同時(shí)增加萃取次數(shù)以提高提取效率。利用高效液相色譜法（HLPC）檢測MK-7時(shí)參照嚴(yán)為留等［13］建立的方法，MK-7濃縮液經(jīng)上機(jī)液溶解后采用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后進(jìn)行HLPC分析。液相色譜條件及進(jìn)樣量參照嚴(yán)為留等［13］設(shè)定的參數(shù)。

2 結(jié)果

表1 本研究擴(kuò)增基因片段大小、使用的引物及PCR條件

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

前期對實(shí)驗(yàn)室保藏的一株高產(chǎn)MK-7的B. amyloliquefaciens Y-2和只有微弱MK-7合成能力的B. amyloliquefaciens W-21的同一基因進(jìn)行測序?qū)Ρ?，發(fā)現(xiàn)其中有6個(gè)基因序列差別較大，分別為men A、men C、men D、men E、men H和hep S，因此對這6個(gè)基因進(jìn)行研究。根據(jù)測序和比對結(jié)果，設(shè)計(jì)這6個(gè)基因的開放閱讀框（ORF）全長的擴(kuò)增引物，并根據(jù)設(shè)計(jì)的引物分別擴(kuò)增這6個(gè)基因，將得到的6個(gè)基因片段分別構(gòu)建到大腸桿菌B. subtilis穿梭型質(zhì)粒pMA5（簡稱P5）上，重組質(zhì)粒構(gòu)建過程見圖2。為判斷獲得的重組質(zhì)粒的正確性，對構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行了單雙酶切驗(yàn)證。從圖3中可以看出，酶切得到的基因片段大小和目的基因片段一致（表1），因此可以推斷所獲質(zhì)粒確實(shí)為目的重組質(zhì)粒。與基因名稱相對應(yīng)，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為P5-A、P5-C、P5-D、P5-E、P5-H和P5-S。

2.2 重組質(zhì)粒在B. subtilis 168中的表達(dá)

圖4 出發(fā)菌株168和重組菌株的MK-7產(chǎn)量

B. subtilis 168自首次被發(fā)現(xiàn)能夠攝取外源DNA以來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對其轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行了透徹的研究，最經(jīng)典的spizizen轉(zhuǎn)化法對常見質(zhì)粒轉(zhuǎn)化都能獲得較高的轉(zhuǎn)化效率［11，14］。此外，B. subtilis 168的表達(dá)系統(tǒng)比較完善，容易驗(yàn)證目的基因是否能夠成功表達(dá)。因此，本研究考察了不同重組質(zhì)粒在B. subtilis 168中過表達(dá)對MK-7合成的影響。利用spizizen轉(zhuǎn)化法篩選B. subtilis 168的陽性轉(zhuǎn)化子，分別命名為168/P5-A、168/P5-C、168/P5-D、168/P5-E、168/P5-H和168/P5-S。將上述重組B. subtilis分別接種到添加了50 mg/L卡那霉素的表達(dá)培養(yǎng)基中，在37℃，100 r/min的條件下培養(yǎng)24 h后，離心收集菌體，并利用有機(jī)溶劑萃取后檢測MK-7含量。結(jié)果（圖4）顯示，重組菌株的MK-7產(chǎn)量均高于對照菌株168（54.3±7.2 μg/g DCW），特別是菌株168/P5-A（155.1±5.5 μg/g DCW），MK-7產(chǎn)量提高了185.6%；其次是菌株168/P5-D（89.0±2.3 μg/g DCW）和菌株168/P5-C（85.6±3.2 μg/g DCW），產(chǎn)量分別提高了64.1%和57.5%；其他菌株168/P5-S（60.6±7.1 μg/g DCW）、168/P5-E（58.3±1.8 μg/g DCW）和168/P5-H（55.9±5.3 μg/g DCW），MK-7產(chǎn)量分別提高了11.6%、7.4%和2.9%。然而，需要注意的是，將空載質(zhì)粒pMA5轉(zhuǎn)化到菌株168后（即重組菌株168/P5），MK-7產(chǎn)量反而下降（38.7±4.6 μg/g DCW）。以上結(jié)果表明，目的基因在B. subtilis 168中均成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，且過表達(dá)的基因?qū)K-7的合成起到促進(jìn)作用。

2.3 B. amyloliquefaciens Y-2的感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化

雖然B. amyloliquefaciens和B. subtilis的親緣關(guān)系較近，但將來源于B. subtilis 168的重組質(zhì)粒用spizizen轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化B. amyloliquefaciens Y-2時(shí)，仍不能獲得有效的轉(zhuǎn)化子。這就說明菌株Y-2的細(xì)胞膜通透性較一般的野生型芽孢桿菌要低，要想成功轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，則必須要增強(qiáng)Y-2的細(xì)胞膜通透性。因此，本研究首先考察了吐溫-80的添加量對菌株Y-2轉(zhuǎn)化率的影響。以spizizen轉(zhuǎn)化法為基礎(chǔ)，在SPII培養(yǎng)基中添加不同體積比的吐溫-80發(fā)現(xiàn)，添加40 mL/L的吐溫-80能獲得15-25個(gè)轉(zhuǎn)化子，因此在接下來的實(shí)驗(yàn)中就以改進(jìn)后的spizizen轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化菌株Y-2，重組質(zhì)粒還是來源于B. subtilis 168。通過采用改進(jìn)的spizizen轉(zhuǎn)化法，成功將6個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化野生型B. amyloliquefaciens Y-2，獲得重組菌株Y-2/P5、Y-2/P5-A、Y-2/P5-C、Y-2/P5-D、Y-2/P5-E、Y-2/P5-H和Y-2/P5-S。隨后考察了出發(fā)菌株和重組菌株在表達(dá)培養(yǎng)基中菌體生長情況。結(jié)果（圖5）表明，重組菌的生長速率均要慢于野生菌，但是最大菌體量都比野生菌高。

圖5 重組Y-2的生長曲線

2.4 不同酶基因?qū)K-7產(chǎn)量的影響

由于野生型Y-2在搖瓶培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)的條件下均能夠合成MK-7，其中搖瓶培養(yǎng)條件下產(chǎn)（138.4±8.5）μg/g DCW MK-7，而靜置培養(yǎng)MK-7產(chǎn)量達(dá)（154.7±13.1）μg/g DCW。雖然菌體在靜置培養(yǎng)的條件下能夠合成更多的MK-7，但是在搖瓶培養(yǎng)下質(zhì)粒能夠得到更多的復(fù)制和表達(dá)，進(jìn)而也能夠促進(jìn)MK-7的合成。因此作者對各重組菌在這兩種培養(yǎng)條件下的MK-7產(chǎn)量均進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖6所示。

圖6 重組Y-2在搖瓶培養(yǎng)（A）和靜置培養(yǎng)（B）條件下的MK-7產(chǎn)量

從圖6中可以看出，分別過量表達(dá)上述6個(gè)基因均能提高M(jìn)K-7的產(chǎn)量，其中過表達(dá)基因hep S對MK-7產(chǎn)量的影響最大，如搖瓶組產(chǎn)量提高了38%（191.0±12.7 μg/g DCW），靜置培養(yǎng)組產(chǎn)量提高了48%（228.9±7.6 μg/g DCW），其余幾個(gè)基因的表達(dá)對MK-7合成的影響則根據(jù)培養(yǎng)方式的不同而各有差異。此外，與將空載質(zhì)粒pMA5轉(zhuǎn)化到菌株168類似，攜帶有空載質(zhì)粒pMA5的重組菌株Y-2/P5的MK-7生產(chǎn)能力要低于菌株Y-2。

3 討論

MK-7生物合成途徑中共有8個(gè)酶控制從異分枝酸開始的甲萘醌母環(huán)的合成以及從異戊烯焦磷酸開始的側(cè)鏈的合成，有9個(gè)基因參與這一過程，它們分別是men A、men B、men C、men D、men E、men G、men H、hep T和hep S［8］。然而，我們前期研究發(fā)現(xiàn)不同MK-7生物合成水平的菌株中，6個(gè)基因（即men A、men C、men D、men E、men H和hep S）的基因序列差別較大（實(shí)驗(yàn)結(jié)果未指出），因此本研究重點(diǎn)考察了這6個(gè)基因過表達(dá)對MK-7合成的影響。

與孫娟娟等［15］在研究過程中相同，從大腸桿菌中提取的重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化B. amyloliquefaciens Y-2的轉(zhuǎn)化率非常低，基本無法轉(zhuǎn)化。其原因可能是在B. amyloliquefaciens中存在著一種由限制性內(nèi)切酶和甲基化酶組成的限制修飾系統(tǒng)，從而使得B. amyloliquefaciens對外源DNA具有較強(qiáng)的降解能力［16，17］。從進(jìn)化距離來看，B. amyloliquefaciens和B. subtilis有著較近的親緣關(guān)系。Akamatsu和Taguchi［11］指出，從大腸桿菌中提取的重組質(zhì)粒能以較高的轉(zhuǎn)化率直接轉(zhuǎn)化到B. subtilis 168。因此，我們前期研究考察了將構(gòu)建好的質(zhì)粒先轉(zhuǎn)化到B. subtilis 168中，再從重組B. subtilis 168中提取可能經(jīng)過修飾的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型B. amyloliquefaciens Y-2，以期實(shí)現(xiàn)提高轉(zhuǎn)化的成功率。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的成功率并未得到提高，可能的原因是菌株Y-2的細(xì)胞膜通透性低。表面活性劑，如吐溫-80等，能夠降低目的蛋白與細(xì)胞膜之間的相互作用，促進(jìn)目的蛋白在芽孢桿菌中的分泌表達(dá)［18］。魏艷等［19］比較了表面活性劑吐溫-80與DMSO等有機(jī)溶劑對野生型B. subtilis NX-2的轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果表明，添加吐溫-80的轉(zhuǎn)化率較為穩(wěn)定，而有機(jī)溶劑的促轉(zhuǎn)化作用則不太穩(wěn)定。因此，本研究以spizizen轉(zhuǎn)化法為基礎(chǔ)，在SPII培養(yǎng)基中添加40 mL/L的吐溫-80，從而實(shí)現(xiàn)了將外源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株Y-2。

在考察了不同重組質(zhì)粒在B. subtilis 168中過表達(dá)對MK-7合成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，目的基因在B. subtilis 168中均成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，且MK-7的合成起到促進(jìn)作用（圖4）。其中，過表達(dá)基因men A對B. subtilis 168合成MK-7具有顯著的促進(jìn)作用。該結(jié)果與Kong等［20］研究結(jié)果相似，他們在研究了大腸桿菌中甲萘醌-8（MK-8）的合成途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)基因men A可使大腸桿菌合成MK-8含量提高2倍。此外，將不同重組表達(dá)質(zhì)粒在B. amyloliquefaciens Y-2中過表達(dá)，對菌體生長和MK-7的合成也具有不同的影響。圖5顯示，重組菌的生長速率均要慢于野生菌，但是最大菌體量都比野生菌高。這可能是因?yàn)樵诰w生長前期，質(zhì)粒的復(fù)制加重了菌體的負(fù)擔(dān)，但是當(dāng)質(zhì)粒表達(dá)后，增強(qiáng)了菌體呼吸鏈中的電子傳遞效率，提高了菌體的呼吸強(qiáng)度，從而增加了最大菌體量。與在B. subtilis 168過表達(dá)不同，雖然6個(gè)目的基因的過表達(dá)對B. amyloliquefaciens合成MK-7具有促進(jìn)作用，但是起關(guān)鍵作用的基因是hep S?；騢ep S和基因hep T一起，控制MK-7側(cè)鏈合成酶——七異戊烯焦磷酸合成酶（EC：2.5.1.30）兩個(gè)亞基的合成［20］。此外，需要指出的是在不同培養(yǎng)條件下，除基因hep S外，其他基因?qū)K-7合成的影響存在差別，特別是基因men E（圖6）。因此作者推斷，在MK-7的合成途徑中，不同培養(yǎng)條件下基因的表達(dá)水平存在差異，培養(yǎng)條件的改變可能也會導(dǎo)致酶的調(diào)控方式發(fā)生改變。非常有趣的是，將空載質(zhì)粒pMA5轉(zhuǎn)化到B. subtilis 168或菌株Y-2會導(dǎo)致出發(fā)菌株合成MK-7的能力下降（圖4和圖6）。具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還不明了，因此我們推斷是由于質(zhì)粒pMA5轉(zhuǎn)入可能會影響細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平的改變，從而影響MK-7的產(chǎn)量，具體原因還需做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究對一株產(chǎn)MK-7的菌株B. amyloliquefaciens Y-2維生素K2合成途徑中的6個(gè)主要酶基因分別進(jìn)行克隆和表達(dá)，指出了過量表達(dá)菌株Y-2維生素K2合成途徑中6個(gè)基因的任何一個(gè)均能提高M(jìn)K-7的產(chǎn)量，其中過表達(dá)基因hep S對菌株Y-2合成MK-7影響最大，特別是在靜置培養(yǎng)時(shí)可使MK-7產(chǎn)量提高48%。其余幾個(gè)基因過表達(dá)后對MK-7產(chǎn)量的影響則根據(jù)培養(yǎng)方式的不同而各有差異。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Major Enzymes in the Biosynthetic Pathway of Vitamin K2on MK-7 Production

XU Jian-zhong WANG Ying-yu YAN Wei-liu ZHANG Wei-guo
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

This paper focused on understanding the effects of different enzyme genes on MK-7 production by cloning and expressing the genes of 6 enzymes in the biosynthetic pathway of vitamin K2with strain Y-2. Firstly，the recombinant plasmids with single gene of the 6 genes were constructed according to the description of Guide to Molecular Cloning Experiment. Subsequently，the recombinant plasmids were successfully transformed into the strain Y-2 via the improved “spizizen” transformation method. Results showed that respective overexpression of the 6 genes involved in vitamin K2biosynthetic pathway all was beneficial to raise MK-7 production. It should be noted that overexpression of gene hep S had the greatest effects on MK-7 production among these 6 genes，which resulted in an increase by 38% in shaking group and by 48% in static group. However，the effects of other genes on MK-7 production varied depending on the culture mode.

Bacillus amyloliquefaciens；menaquinone-7；biosynthetic pathway；catalyzing enzyme

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.032

2016-04-19

項(xiàng)目名稱：江蘇省自然科學(xué)基金-青年基金項(xiàng)目（BK20150149）

徐建中，男，博士，研究方向：菌種選育及代謝調(diào)控；E-mail：xujz126@126.com

張偉國，男，博士，研究方向：菌種選育及代謝調(diào)控；E-mail：zwgjnedu@sina.cn