重組人βNGF在大腸桿菌中的可溶表達(dá)、純化及活性鑒定

白羊 章永壘 鄒有土 黃奮飛 陳勝亮 阮卡 葛平輝 馬燕玲王明灶 陳星

（未名生物醫(yī)藥有限公司，廈門(mén) 361009）

重組人βNGF在大腸桿菌中的可溶表達(dá)、純化及活性鑒定

白羊 章永壘 鄒有土 黃奮飛 陳勝亮 阮卡 葛平輝 馬燕玲王明灶 陳星

（未名生物醫(yī)藥有限公司，廈門(mén) 361009）

旨在大腸桿菌中可溶表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Recombinant human β nerve growth factor，rhβNGF），并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和生物學(xué)活性鑒定。成功擴(kuò)增hNGF β亞基基因，將其克隆入pMAL-c2X表達(dá)載體，構(gòu)建了hβNGF-MBP的大腸桿菌表達(dá)體系并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后以Factor Xa酶切去除麥牙糖結(jié)合蛋白（MBP），Western blot鑒定后以TF-1細(xì)胞法檢測(cè)生物學(xué)活性。結(jié)果顯示，pMAL-c2X-hβNGF經(jīng)酶切和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建正確，25℃、180 r/min、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下可溶表達(dá)hβNGF-MBP融合蛋白。hβNGF-MBP經(jīng)Factor Xa酶切后可去除MBP標(biāo)簽，SDS-PAGE分析純化的hβNGF位于13 kD左右，純度可達(dá)95%。Western blot鑒定為hβNGF，結(jié)果表明，比活約為1×106U/mg。在大腸桿菌中成功可溶表達(dá)hβNGF，并具有較高的生物學(xué)活性。

人神經(jīng)生長(zhǎng)因子；大腸桿菌；可溶表達(dá)；生物學(xué)活性

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor，NGF）是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，是具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，其對(duì)多種細(xì)胞特別是中樞及周?chē)窠?jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用［1］。NGF具有重要的臨床價(jià)值，目前已被廣泛用于中樞以及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)疾病的治療中，還具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)人免疫系統(tǒng)、促進(jìn)傷口修復(fù)等非神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用［2，3］。NGF包含α、β、γ三個(gè)亞基，其中β亞基具有完整的NGF生物學(xué)活性，目前臨床使用的NGF主要來(lái)源于小鼠頜下腺提取的鼠βNGF（mβNGF）［4］。與mβNGF相比，重組人βNGF（rhβNGF）具有易獲得、高產(chǎn)率、高活性、成本低廉與無(wú)免疫原性等特點(diǎn)，建立高效、穩(wěn)定的hβNGF重組表達(dá)系統(tǒng)具有重要的臨床意義和商業(yè)價(jià)值［5］。

大腸桿菌是最廣泛應(yīng)用于表達(dá)各種外源基因的表達(dá)系統(tǒng)，其重組表達(dá)NGF多以包涵體形式獲得，獲得具有活性的NGF需要進(jìn)行復(fù)雜的變性、復(fù)性操作，且活性較低，不利于大規(guī)模工業(yè)化過(guò)程［6-9］。麥芽糖結(jié)合蛋白（Maletose-binding protein，MBP）是大腸桿菌中麥芽糖積累途徑中的一種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，MBP具有強(qiáng)助溶作用，將其與外源蛋白融合表達(dá)可顯著提高外源蛋白的可溶表達(dá)，從而簡(jiǎn)化技術(shù)步驟，提高外源蛋白活性［10，11］。但目前，尚未有成功利用MBP重組表達(dá)可溶NGF的報(bào)道。因此，本研究擬利用基因工程手段將hβNGF通過(guò)自帶MBP的pMAL-c2X質(zhì)粒載體重組在大腸桿菌中，構(gòu)建一種成熟、穩(wěn)定、高效的表達(dá)系統(tǒng)，從而獲得大量具有天然活性的rhβNGF。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌E. coli TOP10、BL21（DE3），北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pMAL-c2x，Novagen公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶，F(xiàn)ermentas公司；PCR反應(yīng)試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；凝血酶因子X(jué)a試劑盒，Novagen公司；兔抗NGF IgG、羊抗兔IgG， Chemicon公司；NGF國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC 93/556，10 000 U/支）；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

美譜達(dá)UV-1200可見(jiàn)分光光度計(jì)；GS2 PCR儀；Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)；SANYO MPR-1410層析冷柜；?KTA Purifier 100蛋白純化系統(tǒng)；BECKMAN COULTER Avanti J-26XP離心機(jī)；BECKMAN MICROFUGE 22R微量臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中hβNGF基因序列（118 aa），以本實(shí)驗(yàn)室保存的人神經(jīng)生長(zhǎng)因子cDNA序列為模板，利用上下游引物擴(kuò)增NGF成熟肽編碼基因。引物為mbp-hβNGF-F：AGGGAAGGAGTTCATCCCATCCCATCTTCCAC（下劃線為Xmn I酶切位點(diǎn)），mbp-hβNGF-R：CCAAGCTTTCATCTCACAGCCTTCCTGCTGAG（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)），引物由TaKaRa公司合成。

1.2.2 目的基因的克隆和表達(dá)工程菌的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增目的基因，膠回收目的基因片段。利用限制性內(nèi)切酶Xmn I和Hind III對(duì)預(yù)插入目的片段的原核表達(dá)載體pMAL-c2X分別進(jìn)行雙酶切，膠回收酶切后目的片段用T4 DNA Ligase將純化后的酶切產(chǎn)物與原核表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)，將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體（pMAL-c2X-hβNGF）首先轉(zhuǎn)化到E.coli TOP10中，挑選的單菌落培養(yǎng)液進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切的鑒定，挑取酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將鑒定正確的pMAL-c2X-hβNGF的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21（DE3）表達(dá)菌株中。

1.2.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 用滅菌接菌環(huán)刮取-80℃凍存的甘油菌，劃線于瓊脂板上，在37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜，活化菌株。挑取單菌落接種于20 mL液體LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL Amp）中，37℃，300 r/min條件下振蕩培養(yǎng)約10-12 h。按1∶50的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，300 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.8（約2.0-2.5 h）。分別在25℃和37℃兩個(gè)溫度下，轉(zhuǎn)速均為180 r/min，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)11 h。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化 離心收集菌體，以10 mL蛋白提取緩沖液重懸200 mL LB培養(yǎng)菌體，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎。4℃，12 000 r/min離心20min，收集上清，并用0.45 μm濾膜過(guò)濾。用MBP Trap HP（1 mL，5 mL）親和柱于?KTA Purifier 100蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，純化過(guò)程在4℃低溫層析柜中進(jìn)行，分管收集洗脫液，檢測(cè)蛋白純度，SDSPAGE分析各組分。Factor Xa（4℃，16 h）切割親和層析獲得的hβNGF-MBP，然后用Superdex-7510/300GL凝膠過(guò)濾分離純化酶切后的hβNGF，SDS-PAGE分析純化后蛋白純度。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定 SDS-PAGE 電泳后，將膠在Transfer buffer中平衡30 min，15 V恒壓轉(zhuǎn)35 min（電流約75 mA）；用TBST洗膜3次，再在室溫下用封閉液封閉1 h；TBST洗膜后用一抗（兔抗NGF IgG）4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜后，加入酶標(biāo)二抗（羊抗兔IgG-HRP）孵育2 h；TBST洗膜后加入底物（魯米諾）發(fā)光拍照。

1.2.6 生物學(xué)活性檢測(cè) 參照《2015版中國(guó)藥典》采用TF-1法測(cè)定神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性［12］。TF-1細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，傳代后24-36 h用于生物學(xué)活性測(cè)定。在加有標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液100 μL的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液100 μL（細(xì)胞濃度6×104個(gè)/mL），于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。每孔加入MTS溶液20 μL，于37℃、5% CO2條件下孵育3 h。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀，以550 nm為參比波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，以四參數(shù)回歸計(jì)算法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 hβNGF基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

hβNGF編碼基因序列的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。hβNGF成熟肽共118 aa，編碼序列共354 bp，加上15 bp的酶切識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿基共369 bp。擴(kuò)增條帶大小符合預(yù)期。

2.2 pMAL-c2X-hβNGF表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

4個(gè)單菌落的培養(yǎng)物經(jīng)PCR驗(yàn)證均為陽(yáng)性克隆，表明NGF成熟肽編碼序列已經(jīng)插入到載體中（圖2）。進(jìn)一步培養(yǎng)重組菌提取pMAL-c2X-hβNGF重組質(zhì)粒，也進(jìn)行Xmn I和Hind III雙酶切鑒定，結(jié)果（圖3泳道4）顯示，在500 bp與250 bp之間可見(jiàn)酶切下來(lái)的NGF片段。對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與天然序列進(jìn)行比對(duì)，確定序列插入正確且不存在突變或移碼。

圖1 hβNGF基因PCR產(chǎn)物檢測(cè)

圖2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

圖3 pMAL-c2X-hβNGF質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 hβNGF-MBP的重組表達(dá)

在不同的溫度下重組表達(dá)hβNGF，結(jié)果如圖4所示。泳道1和泳道2對(duì)比可以明顯看出，利用該系統(tǒng)可以重組表達(dá)hβNGF-MBP，蛋白大小約56 kD符合預(yù)期；從泳道3和泳道4可知，37℃條件下，hβNGF-MBP基本以包涵體的形式表達(dá)；對(duì)比泳道3和泳道6可知，在25℃條件下，可獲得hβNGF-MBP的可溶性表達(dá)。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)

2.4 hβNGF-MBP的純化

將超聲破碎的上清過(guò)MBP親和層析柱，以10 mmol/L 麥芽糖洗脫。結(jié)果（圖5）顯示，對(duì)比泳道1和泳道2，上清液有大量可溶性表達(dá)的MBP融合蛋白，洗脫獲得了純度較高的融合蛋白。

圖5 hβNGF-MBP純化的SDS-PAGE檢測(cè)

2.5 hβNGF-MBP酶切

純化獲得的hβNGF-MBP融合蛋白的緩沖液中僅含有10 mmol/L麥芽糖，可以直接利用Factor Xa去除MBP標(biāo)簽。分別以0、0.5、2和8 U Factor Xa在25℃水浴條件下酶切約50 μg hβNGF-MBP 16 h，結(jié)果（圖6）顯示，0.5 U的Factor Xa切割效果與2 U和8 U Factor Xa的效果相當(dāng)，切割下來(lái)的MBP標(biāo)簽和hβNGF見(jiàn)圖中箭頭所指處。后續(xù)利用凝膠層析進(jìn)行二次純化，效果較好，SDS-PAGE（圖7）分析顯示，hβNGF位于13 kD左右，灰度掃描指出純度達(dá)95%以上。以mNGF為對(duì)照，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果（圖8）顯示，重組產(chǎn)物與mNGF有一致的條帶，說(shuō)明這重組子能有效表達(dá)hβNGF蛋白。

圖6 hβNGF-MBP標(biāo)簽去除的SDS-PAGE檢測(cè)

圖7 純化得到hβNGF的DS-PAGE檢測(cè)

2.6 hβNGF的生物學(xué)活性檢測(cè)

以NGF國(guó)際活性標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用TF-1細(xì)胞法檢測(cè)hβNGF的活性，四參數(shù)回歸計(jì)算法處理檢測(cè)數(shù)據(jù)。結(jié)果（圖9）顯示，hβNGF的EC50約為2ng/mL，比活約為1×106U/mg，與活性標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)，說(shuō)明hβNGF具有較高的活性。

圖8 hβNGF的Western blot鑒定

圖9 hβNGF活性檢測(cè)的量效曲線

3 討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中應(yīng)用最早和最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，其重組表達(dá)目的蛋白具有很多的優(yōu)點(diǎn)，但其表達(dá)效率受到多種因素制約，特別是會(huì)形成不溶的包涵體，造成純化工藝繁瑣，蛋白活性受到影響［13，14］。包涵體形成的主要機(jī)制在于蛋白的合成速度過(guò)快，沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行正確的折疊，或者胞內(nèi)的還原環(huán)境不利于形成二硫鍵［15］。MBP作為一種分子伴侶，能有效阻止融合蛋白的折疊中間肽之間聚集沉淀，從而實(shí)現(xiàn)蛋白的可溶表達(dá)［16］。pMAL-c2X是一種自帶MBP基因的質(zhì)粒載體，將目的基因重組進(jìn)pMAL-c2X載體可以獲得目的蛋白-MBP融合蛋白的可溶表達(dá)，目前已經(jīng)在多種目的蛋白的重組表達(dá)中應(yīng)用。如劉中祿等［17］將人工合成的Tα1序列插入到pMAL-c2X質(zhì)粒載體中構(gòu)建pMAL-c2X-Tα1融合表達(dá)質(zhì)粒，再插入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，該菌株能有效表達(dá)可溶Tα1-MBP融合蛋白，融合蛋白占菌體蛋白的33.6%。宋琳琳等［18］以帶CTP基因序列的上游引物擴(kuò)增Ub-HBcAg，將PCR產(chǎn)物克隆到pMAL-c2X質(zhì)粒載體并插入大腸桿菌BL21（DE3）中，誘導(dǎo)表達(dá)并以親和層析法純化融合蛋白，結(jié)果表明CTP-Ub-HBcAg原核表達(dá)載體并成功可溶表達(dá)，且能有效純化。

在本研究中，我們利用pMAL-c2X表達(dá)載體，構(gòu)建了hβNGF-MBP的大腸桿菌表達(dá)體系并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得了hβNGF-MBP融合蛋白的可溶表達(dá)。研究表明，融合蛋白的可溶表達(dá)需要適當(dāng)降低蛋白的表達(dá)速度，如吳敬君等［19］以大腸桿菌重組表達(dá)肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC-MBP融合蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，MBP融合蛋白在普通發(fā)酵條件下仍主要以包涵體的形式表達(dá)，通過(guò)降溫（15℃）才能實(shí)現(xiàn)融合蛋白的可溶表達(dá)。熊志紅等［20］以大腸桿菌重組表達(dá)另一種分子伴侶SUMO與hβNGF融合蛋白的研究中也發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的融合蛋白依然以包涵體的形式存在。本研究中hβNGF-MBP融合蛋白在普通發(fā)酵條件下也主要以包涵體的形式表達(dá)，只有在低溫（25℃）、低轉(zhuǎn)速（180 r/min）、低IPTG添加量（0.5 mmol/L）的情況下能獲得可溶性表達(dá)，與上述研究的結(jié)論相似?？扇鼙磉_(dá)的hβNGF-MBP經(jīng)酶切、純化后，能獲得純度95%且經(jīng)Western blot鑒定的hβNGF，其比活高達(dá)1×106U/mg，生物學(xué)活性顯著高于目前市售的mβNGF產(chǎn)品［21］，從而為rhβNGF的規(guī)模化生產(chǎn)提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功擴(kuò)增hNGF β亞基基因，將其克隆入pMAL-c2X表達(dá)載體，構(gòu)建了hβNGF-MBP的大腸桿菌表達(dá)體系，在低溫、低轉(zhuǎn)速、低IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)獲得hβNGF-MBP融合蛋白的可溶表達(dá)，通過(guò)MBP親和層析、Xa酶切、凝膠層析，獲得了高純度（＞95%）、高活性（比活約為1×106U/mg）的hβNGF。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Soluble Expression，Purification and Activity Assay of Recombinant Human βNGF Expressed in Escherichia coli

BAI Yang ZHANG Yong-lei ZOU You-tu HUANG Fen-fei CHEN Sheng-liang RUAN Ka GE Ping-hui MA Yan-ling WANG Ming-zao CHEN Xing
（Sinobioway Biomedicine Co.，Ltd.，Xiamen 361009）

The goal of this work is to express the recombinant human nerve growth factor（rhβNGF）in Escherichia coli in soluble form，to separate and purify the expressed products，and to determine the biological activity. First，hβNGF gene was amplified and then inserted into expression vector pMAL-c2X，then E. coli expression system of hβNGF-MBP was constructed and induced for expression. Further，the MBP in purified expressed products was cleaved by Factor Xa enzyme，after identified by Western blot，the biological activity was examined by TF-1 method. The results showed that enzyme digestion and sequencing confirmed that the recombinant plasmid pMAL-c2X-hβNGF was constructed correctly，hβNGF-MBP was secretory expressed under 2℃，180 r/min and 0.5 mmol/L IPTG induction. MBP tag in hβNGF-MBP was removed by Factor Xa digestion，and the purified hβNGF via SDS-PAGE was about 13 kD with the purity over 95%. The protein was identified as hβNGF by Western blot. The biological activity test showed that the specific activity was about 1×106U/mg. Overall，recombinant hβNGF was successfully expressed in E. coli in soluble form with high biological activity.

human nerve growth factor；Escherichia coli；soluble expression；biological activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.023

2016-03-23

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2011ZX09401-017）

白羊，男，碩士，研究方向：生物醫(yī)藥研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化；E-mail：alamo1985@163.com

陳星，女，碩士，研究方向：生物醫(yī)藥研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化；E-mail：amable24@163.com