黑果枸杞果實(shí)成熟發(fā)育過程表達(dá)譜差異分析

彭勇陳尚武馬會(huì)勤

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京100193）

黑果枸杞果實(shí)成熟發(fā)育過程表達(dá)譜差異分析

彭勇1陳尚武1馬會(huì)勤2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京100193）

對(duì)黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析對(duì)比黑果枸杞果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期相關(guān)基因表達(dá)譜的變化。提取果實(shí)RNA進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序，利用GO、KEGG等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋、分類，利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對(duì)比分析。結(jié)果顯示，KEGG pathway 富集分析表明亮氨酸生物合成途徑在變色期對(duì)比青果期有7個(gè)差異表達(dá)基因，黑熟期對(duì)比變色期有35個(gè)差異表達(dá)基因，且全部為上調(diào)表達(dá)。在糖酵解途徑中3個(gè)不可逆的反應(yīng)步驟限速酶基因在黑熟期均為上調(diào)表達(dá)。對(duì)黑果枸杞亮氨酸合成和糖酵解涉及到的基因進(jìn)行了功能和代謝通路的分析，為黑果枸杞種質(zhì)資源探索提供理論基礎(chǔ)。

黑果枸杞；果實(shí)發(fā)育；基因表達(dá)譜；差異表達(dá)

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是在我國(guó)西北干旱鹽堿地生境廣泛分布的多年生灌木，是一種集鹽堿地綠化價(jià)值、防護(hù)林價(jià)值、藥食用價(jià)值等于一體的野生優(yōu)良水土保持植物。黑果枸杞果實(shí)中富含枸杞多糖［1，2］、色素［3，4］、類黃酮［5］、甜菜堿［6］、微量元素、脂肪酸、揮發(fā)油、維生素等多種成分，其果實(shí)提取物在抗氧化［7］、調(diào)節(jié)免疫力［8］、抗疲勞［9］、降血脂［10］、治療心血管系統(tǒng)疾病、抗動(dòng)脈硬化［11］、抗衰老等方面均有明確作用。

除對(duì)黑果枸杞植物生理、產(chǎn)物成分等研究外，近年來研究者開始進(jìn)行黑果枸杞遺傳基因的研究［12］，包括針對(duì)黑果枸杞灌木種群遺傳學(xué)［13］、序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）［14］和微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）［15］等，探究黑果枸杞在紫外線脅迫下轉(zhuǎn)錄組的變化［16］，以及對(duì)寧夏枸杞和黑枸杞花青素合成的轉(zhuǎn)錄組對(duì)比［17］等，以期在分子生物層面揭示其生理發(fā)育等過程的機(jī)制。

果實(shí)成熟發(fā)育過程是果實(shí)功能與品質(zhì)形成的基礎(chǔ)，這個(gè)過程受到遺傳、基因表達(dá)和環(huán)境因素的影響［18-20］。隨著基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)等技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于果實(shí)發(fā)育與品質(zhì)形成研究中，為理解果實(shí)成熟變化和利用基因資源控制品質(zhì)形成提供了重要研究數(shù)據(jù)［21-24］。果實(shí)發(fā)育過程中，伴隨果實(shí)細(xì)胞生理和生化代謝的變化，糖分、氨基酸、色素、脂肪酸和芳香酯含量發(fā)生變化，以及其它次生代謝物、特色營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累，從而產(chǎn)生不同的風(fēng)味和功能特性［25］。由于我國(guó)目前黑果枸杞主要以野生和半野生分布生長(zhǎng)于不同地區(qū)，果實(shí)品質(zhì)存在一定差異。利用果實(shí)轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)手段，展開黑果枸杞果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育基因表達(dá)變化特性研究，對(duì)理解和指導(dǎo)我國(guó)不同生態(tài)條件下黑果枸杞發(fā)育特征和果實(shí)品質(zhì)提高具有重要意義。

本研究利用RNA-seq技術(shù)在RNA水平對(duì)黑果枸杞果實(shí)座果后青果期、變色期、黑熟期3個(gè)不同生長(zhǎng)和成熟時(shí)期進(jìn)行基因表達(dá)組學(xué)分析，探討果實(shí)發(fā)育的相關(guān)基因功能表達(dá)差異，旨在為黑果枸杞品質(zhì)形成和的基因調(diào)控及優(yōu)良株系選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）從花期座果后到成熟期果實(shí)，采自寧夏回族自治區(qū)銀川市永寧縣南郊半干旱地域（年平均氣溫8.7℃，夏季各月平均氣溫在20℃以上，無霜期平均167 d，多年年平均降水量為201 mm），分級(jí)后選取早期結(jié)實(shí)成型的青色果實(shí)（早期，果實(shí)顏色為青綠色，簡(jiǎn)稱青果期，S1），開始變色時(shí)期的果實(shí)（中期，果身大部分為青綠色、局部為淡紫色，簡(jiǎn)稱變色期，S2）和完全成熟的果實(shí)（晚期，果實(shí)迅速膨大、通體呈黑紫色，簡(jiǎn)稱黑熟期，S3）各3份，每份10 g，液氮速凍，于-80℃冰箱保存用于后續(xù)總RNA提取、RNA-seq樣品制備和測(cè)序分析。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞果實(shí)發(fā)育各時(shí)期總RNA的提取和測(cè)序 總RNA的提取采用改良的CTAB法［26］，對(duì)3個(gè)時(shí)期的黑果枸杞果實(shí)及其重復(fù)樣本提取總RNA。選取RNA濃度≥200 ng/mL，OD260/280比值為1.8-2.2的黑果枸杞果實(shí)總RNA樣品，送深圳華大基因研究院進(jìn)行后續(xù)測(cè)序。

去除rRNA后質(zhì)控合格的mRNA樣品按參考樣品（S1+S2+S3）和各果實(shí)時(shí)期S1-3樣品分別進(jìn)行RNA-seq樣品制備、合并和測(cè)序。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)處理 對(duì)測(cè)序得到的原始序列去除接頭（adaptor）序列、低質(zhì)量標(biāo)簽（Tag）及長(zhǎng)度過小和過大的Tag等數(shù)據(jù)，得到高質(zhì)量讀長(zhǎng)（clean reads）；進(jìn)行數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評(píng)估；用短reads組裝軟件Trinity組裝；對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行飽和度和質(zhì)控分析。篩選獲得的clean reads用于Unigene后續(xù)分析和GO、NR、NT Swiss-Prot和KO等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，并分別對(duì)注釋到每個(gè)庫(kù)以及所有注釋上的Unigene數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；去除其中的雜質(zhì)數(shù)據(jù)，用SOAP2［27］（http://soap.genomics. org.cn/soapaligner.html）對(duì)黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析?；虮磉_(dá)量的計(jì)算使用 RPKM 法（Reads per kb per million reads）［28］，基因表達(dá)量符合P＜0.005，錯(cuò)配率（FDR）≤0.001，且|log2（差異表達(dá)倍數(shù)）|＞1（即|log2ratio|＞1）的基因被定義為顯著差異表達(dá)的基因。差異基因檢測(cè)方法參考“The significance of digital gene expression profiles”［29］，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行COG分析和KEGG功能與代謝途徑分析。

2 結(jié)果

總轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)達(dá)到5.14 G，總clean read數(shù)51 393 116，以黑果枸杞果實(shí)發(fā)育總表達(dá)基因數(shù)據(jù)作為果實(shí)參考轉(zhuǎn)錄組，對(duì)黑果枸杞果實(shí)不同發(fā)育期的青果期（S1）、變色期（S2）和黑熟期（S3）的表達(dá)譜及相互間的差異進(jìn)行分析。

2.1 測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)

對(duì)黑果枸杞參考轉(zhuǎn)錄組和各時(shí)期果實(shí)測(cè)序飽和度的數(shù)據(jù)分析，顯示黑果枸杞發(fā)育的3個(gè)不同時(shí)期的樣品都呈現(xiàn)出在標(biāo)簽數(shù)量較少時(shí)，檢測(cè)到的基因數(shù)目較少，基因數(shù)目隨著測(cè)序量的增加也急劇增加的模式。當(dāng)S1的read數(shù)達(dá)到80×100 k時(shí)，read數(shù)接近不再上升，這表明此時(shí)樣本的測(cè)序量已經(jīng)基本覆蓋到細(xì)胞中基因組可表達(dá)的全部基因。圖1為S1樣品的測(cè)序隨機(jī)性統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，表明黑果枸杞mRNA樣本在RNA-Seq實(shí)驗(yàn)過程中，通過超聲方法片段化后的測(cè)序的read分布較均勻，為隨后的各項(xiàng)轉(zhuǎn)錄組差異分析提供了很好的保障。

圖1 黑果枸杞S1期果實(shí)轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序頻數(shù)與基因位置分布

圖2 黑果枸杞果實(shí)不同時(shí)期基因的功能分類

2.2 GO分類分析

通過Gene Ontology（GO）基因功能分類體系注釋分析黑果枸杞果實(shí)各發(fā)育期間差異表達(dá)基因在分子功能（molecular function）、細(xì)胞組分（cellular component）、參與的生物過程（biological process）中的分布（圖2），可以反映果實(shí)基因表達(dá)所表征的代謝富集差異和相應(yīng)生物學(xué)功能的變化。本研究中黑果枸杞果實(shí)大部分差異基因的功能集中在分子功能的結(jié)合和催化活性方面，細(xì)胞組件功能的細(xì)胞、細(xì)胞組件和細(xì)胞器上，在生物過程功能中主要參與細(xì)胞過程和代謝過程中。在生物過程中，基因差異數(shù)最多；在細(xì)胞組件和分子功能中，差異基因?yàn)榍罢叩?/3-1/2；而在分子功能組中，差異表達(dá)基因數(shù)量更少。其中，與亮氨酸合成途徑有關(guān)的Unigene有14個(gè)，其中在S3/S1對(duì)比中差異表達(dá)基因?yàn)?個(gè)，S3/S2中為8個(gè)，S2/S1中無差異表達(dá)基因。

2.3 KEGG代謝途徑分析

通過KEGG代謝途徑富集分析（metabolic pathway enrichment analysis），在黑果枸杞果實(shí)中鑒定出次生代謝物合成代謝途徑（biosynthesis of secondary metabolites）基因?yàn)? 380個(gè)，占到注釋參與代謝途徑基因總數(shù)的12.9%（圖3）。在S2/S1、S3/S2和S3/S1中分別注釋到3 917、5 133和7 259個(gè)差異表達(dá)基因，說明黑果枸杞隨果實(shí)發(fā)育進(jìn)程，代謝途徑所需基因數(shù)量與模式不斷變化。亮氨酸生物合成屬于基礎(chǔ)代謝物中重要的中間代謝物或前體，黑果枸杞果實(shí)成熟發(fā)育過程的亮氨酸生物合成代謝途徑基因表達(dá)變化，見圖4。S2/S1中亮氨酸生物合成代謝途徑僅有7個(gè)差異表達(dá)基因，其中3個(gè)上調(diào)基因，4個(gè)下調(diào)基因；S3/S2有35個(gè)差異表達(dá)基因，全部為上調(diào)基因，總體上（S3/S1）有39個(gè)差異表達(dá)基因，其中36個(gè)上調(diào)基因，3個(gè)下調(diào)基因，說明此代謝對(duì)黑果枸杞果實(shí)成熟與功能性物質(zhì)轉(zhuǎn)化特別是花青素苷元類物質(zhì)代謝，具有重要意義。

圖3 黑果枸杞不同代謝通路中基因占總注釋基因的百分比

S2/S1中，二羥基酸脫水酶（ilvD，EC：4.2.1.9）和酮醇酸還原異構(gòu)酶（ilvC，EC：1.1.1.86）基因有顯著的下調(diào)；在S3/S1中，除支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ilvE，EC：26.6.1.42）外，所有基因有顯著的上調(diào)，其中3-異丙基蘋果酸脫氫酶（leuB，EC：1.1.1.85）出現(xiàn)非常顯著的上調(diào)，log2（差異表達(dá)倍數(shù)）達(dá)到15.6，乙酰羥酸合酶（ilvI，EC：2.2.1.6）和2-異丙基蘋果酸合酶（leuA，EC：2.3.3.13）的log2（差異表達(dá)倍數(shù)）分別為9.04和9.19。

糖酵解是為細(xì)胞生命活動(dòng)提供部分能量及為其它代謝途徑提供中間產(chǎn)物的基礎(chǔ)代謝途徑。表1列出了黑果枸杞果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的糖酵解途徑關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄的差異情況。在糖酵解途徑中，S2/S1有55個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)22個(gè)，下調(diào)表達(dá)33個(gè)；S3/S1中，有207個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)182個(gè)，下調(diào)表達(dá)25個(gè)，表明黑果枸杞果實(shí)成熟時(shí)，糖酵解的代謝重要性在明顯增強(qiáng)，尤其是糖酵解過程中3個(gè)不可逆的反應(yīng)步驟限速酶己糖激酶（hexokinase，EC：2.7.1.1）、6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinas，EC：2.7.1.11）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，EC：2.7.1.40）的表達(dá)。在不同的果實(shí)發(fā)育階段，編碼上述3個(gè)酶的家族基因表達(dá)量都呈現(xiàn)出逐漸增高的規(guī)律，其中6-磷酸果糖激酶的Unigenes在青果期基本不表達(dá)或者表達(dá)量較少，而在果實(shí)完全成熟階段表達(dá)量急劇增加，其中Unigene4315_GQ在青果期和變色期未見表達(dá)，而完全成熟階段RPKM值為33.975；CL8764.Contig2_ GQ在3個(gè)時(shí)期的RPKM值分別為1.742、1.817和425.632，青果期與變色期無明顯差異，而黑熟期其表達(dá)量急劇增加；僅Unigene42339_GQ在變色期未見表達(dá)，相對(duì)青果期表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，在黑熟期重新表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。

3 討論

圖4 黑果枸杞不同時(shí)期亮氨酸代謝途徑基因表達(dá)量變化［30］

由于黑果枸杞基因組測(cè)序尚未完成，本研究中黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組的注釋采用參考轉(zhuǎn)錄組以及對(duì)已有植物基因和蛋白資源的相對(duì)注釋，可注釋已知功能基因達(dá)59 537個(gè)，未知基因?yàn)?5 431個(gè)，能夠總體反映出黑果枸杞果實(shí)發(fā)育成熟過程的基因轉(zhuǎn)錄譜特征。黑果枸杞果實(shí)中含有豐富的氨基酸，黑果枸杞果實(shí)中除色氨酸外，其他 7 種必需氨基酸含量較豐富，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是亮氨酸（Leu），為9.366g/kg（干重）［31］。探索黑果枸杞成熟過程中亮氨酸生物合成變化，有助于了解其氨基酸合成與積累情況，對(duì)選育更富有營(yíng)養(yǎng)的品種具有重要作用。

表1 黑果枸杞果實(shí)不同發(fā)育階段糖酵解關(guān)鍵酶差異表達(dá)基因

L-亮氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，因其疏水脂質(zhì)鏈都具有分支的甲基基團(tuán)，又稱之為分支鏈氨基酸［32］，3種支鏈氨基酸的生物合成途徑是緊密相連的［33］。在丙酮酸合成L-亮氨酸的代謝途徑中，乙酰羥酸合酶（acetohydroxyacid synthase，AHAS）由ilvBN編碼，是合成途徑上的第一個(gè)關(guān)鍵酶［34］。在 L-亮氨酸生物合成中，第二個(gè)關(guān)鍵酶為異丙基蘋果酸合成酶（Isopropylmalatesynthetase，IPMS），IPMS 由leuA基因編碼，催化2-酮異戊酸生成異丙基蘋果酸［35］，IPMS受到 L-亮氨酸的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簟lvC基因與ilvBN基因序列在基因組上相鄰共同形成一個(gè)操縱子，表達(dá)ilvBNC基因有利于L-亮氨酸生物合成前體物α-酮基異戊酸的生成［36］。這2個(gè)關(guān)鍵酶的基因，在S2/S1中僅有2-3倍的增加，而在S3/S1 中急劇增加了527倍和584倍，說明在果實(shí)初步成型期和果實(shí)開始變色期的果實(shí)，其亮氨酸的合成并不豐富，而在果實(shí)完全成熟階段，編碼亮氨酸合成的基因表達(dá)急劇增加，有利于亮氨酸的生物合成和積累。

在黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組分析中，分析出萜類化合物骨架生物合成Unigene 216個(gè)，二萜類化合物的生物合成Unigene 147個(gè)，說明黑果枸杞的萜類合成能力較強(qiáng)。糖酵解產(chǎn)物3-磷酸甘油醛、丙酮酸及乙酰CoA是萜類物質(zhì)合成的前體［37］，己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶基因表達(dá)的上調(diào)將為成熟果實(shí)中的萜類合成提供更多的碳源。6-磷酸果糖激酶的Unigene在果實(shí)發(fā)育前期，表達(dá)量較少或者不表達(dá)，而在果實(shí)成熟過程中表達(dá)量逐漸增加。糖酵解在果實(shí)發(fā)育后期的增加，除了代謝中間產(chǎn)物生成的增加同時(shí)也體現(xiàn)了果實(shí)成熟后期物質(zhì)積累所需要能量的增加，果實(shí)通過加大糖酵解的反應(yīng)獲得部分所需能量，糖分代謝對(duì)果實(shí)干物質(zhì)形成具有重要意義。萜類化合物骨架生物合成后可以為N-聚糖生物合成途徑提供二磷酸多萜醇（dolichol diphosphate），在該途徑中糖基轉(zhuǎn)移酶催化單糖從糖供體轉(zhuǎn)移到糖受體分子，參與天然產(chǎn)物黃酮類生物合成路徑，為花青素花色苷合成提供糖苷配體。

高通量測(cè)序技術(shù)具有海量數(shù)據(jù)、可靠性高、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［38］。此外，如何對(duì)測(cè)序獲得的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分析，也對(duì)研究人員在專業(yè)性和生物信息學(xué)分析能力提出了更高的要求。亮氨酸生物合成代謝途徑，總體上有39個(gè)差異表達(dá)基因，其中36個(gè)上調(diào)基因，3個(gè)下調(diào)基因。編碼糖酵解過程中3個(gè)不可逆的反應(yīng)步驟限速酶：己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的家族基因，其表達(dá)量在黑果枸杞果實(shí)發(fā)育階段呈現(xiàn)出逐漸增高的規(guī)律。

4 結(jié)論

在黑果枸杞果實(shí)中鑒定出次生代謝物合成代謝途徑基因3 380個(gè)。黑果枸杞果實(shí)成熟發(fā)育過程中

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Differential Expression Analysis of Gene Expression Profiles During Fruit Development and Ripening of Lycium ruthenicum

PENG Yong1CHEN Shang-wu1MA Hui-qin2
（1. College of Food Sciences and Nutrition Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083；2. College of Horticulture，China Agricultural University，Beijing 100193）

The purpose of this study was to sequence the transcriptome at 3 different developmental stages of Lycium ruthenicum Murr. fruit，as well as analyze and compare the variations of their gene expression profiles. The RNAs of the fruits were extracted，and sequenced by Illumina high-throughput，then the their functions were annotated and classified using public database such as GO，KEGG，etc.，further their genes were compared and analyzed by digital gene expression profiles. Enrichment analysis results by KEGG pathway showed that in the “l(fā)eucine biosynthesis pathway”，there were 7 genes differentially expressed in color changing vs early light green skin stage，while 35 differentially expressed genes in full ripening stage vs color changing stage，and all were up-regulated. The gene expressions of 3 rate-limiting enzymes in the non-reversible reactions of glycolysis all were up-regulated in the full ripening stage. Moreover，the functions and metabolic pathways of all genes involved in leucine biosynthesis and glycolysis of L. ruthenicum fruit were analyzed，aiming at providing the theoretical basis for exploring the germplasm of L. ruthenicum.

Lycium ruthenicum；fruit ripening；gene expression profile；differential expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.017

2016-02-28

彭勇，男，博士研究生，研究方向：植物產(chǎn)品生理功能；E-mail：yong@cau.edu.cn

馬會(huì)勤，女，博士，研究方向：葡萄栽培與分子生物學(xué)；E-mail：hqma@cau.edu.cn