基因側(cè)翼序列擴增技術(shù)的應用進展

蒲遠波郭翠平淑珍

（1. 川北幼兒師范高等?？茖W校，廣元 628017；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

基因側(cè)翼序列擴增技術(shù)的應用進展

蒲遠波1郭翠2平淑珍2

（1. 川北幼兒師范高等?？茖W校，廣元 628017；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

擴增基因的側(cè)翼序列在分子生物學研究中具有重要作用。到目前為止，克隆基因側(cè)翼序列的方法主要可以分為3類：反向PCR、外源接頭介導PCR、半隨機引物PCR。對這些技術(shù)的原理以及近期的應用情況進行了較為系統(tǒng)的綜述，旨在為研究者選擇更可靠、更合理的方法提供依據(jù)。

側(cè)翼序列；反向PCR；外源接頭介導PCR；半隨機引物PCR

側(cè)翼序列是指染色體中特定位點兩側(cè)的DNA序列。整合進入轉(zhuǎn)基因作物染色體的外源目的基因插入位點的側(cè)翼序列，對目的基因的正常轉(zhuǎn)錄、表達及調(diào)控有重要影響，且對研究轉(zhuǎn)基因作物的穩(wěn)定遺傳性以及轉(zhuǎn)基因作物的安全生產(chǎn)具有重要意義，因此，側(cè)翼序列的分析成為植物轉(zhuǎn)基因育種安全評估的重要研究手段，受到廣大科學研究者的重視［1，2］。此外，側(cè)翼序列也包括基因的啟動子和調(diào)控位點，因此對側(cè)翼序列的分析對基因的表達調(diào)控研究也有重要作用。目前已經(jīng)建立了許多關于側(cè)翼序列的分析方法，根據(jù)其技術(shù)原理，可將這些方法歸為3類：反向PCR、外源接頭介導PCR、半隨機引物PCR。

1 反向PCR（inverse or inverted PCR，I-PCR）

反向PCR方法的重要功能是擴增目標序列的側(cè)翼序列。在進行PCR擴增前，先用合適的限制性內(nèi)切酶消化基因組，然后讓酶切后的片段環(huán)化，最后通過擴增引物擴增獲得上、下游片段。現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。該方法的關鍵之處在于選擇一種合適的酶，且這種選擇不能在目的位點切斷靶DNA［4］，其原理見圖1。

I-PCR在分子生物學研究中應用廣泛，可以用于鑒定外源基因或轉(zhuǎn)座子在基因組中的整合位點，或者用于克隆基因的鄰接序列［5］。下面對I-PCR的應用實例進行簡單介紹；首先，I-PCR在基因啟動子克隆的應用，Digeon等［6］用該方法成功克隆了小麥puroindoline基因啟動子約1 000 bp片段；Van和Chen等［7，8］基于I-PCR技術(shù)克隆了小麥花粉特異性基因TaPSG719啟動子序列；2006年，馮麗等［9］在I-PCR的基礎上通過技術(shù)優(yōu)化，建立互補末端連接反向PCR（CELI-PCR）技術(shù)，該技術(shù)能夠用于快速分離目的基因全長cDNA和啟動子序列；Forester等［10］用I-PCR技術(shù)分離出豌豆種子脂肪加氧酶基因的啟動子區(qū)，約800 bp片段；Heel等［7］擴增了人類ITGB7基因啟動子；Tsaftaris等［11］成功克隆出了番紅花CsatAP1/FUL啟動子。

圖1 反向PCR原理示意圖

除了克隆啟動子區(qū)外，I-PCR在分析基因旁側(cè)序列上也得到廣泛應用。研究表明，甲酰胺、二甲基亞砜（DMSO）等能夠在不影響Taq酶活力的情況下降低非特異性擴增。1998年，李竹紅等［12］依據(jù)以上原理改進反向PCR方法，通過優(yōu)化的I-PCR技術(shù)克隆獲得Tc1轉(zhuǎn)座子左側(cè)反轉(zhuǎn)重復序列的旁側(cè)序列。2001年，Yu［13］在皰疹病毒中通過IPCR技術(shù)獲得GTFP基因旁側(cè)序列。同年，韓志勇［14］通過反向PCR建立了分離水稻外源基因旁側(cè)序列技術(shù)體系，該技術(shù)在套式PCR中結(jié)合了熱啟動PCR和降落PCR技術(shù)，成功克隆了35個轉(zhuǎn)基因水稻品系的外源基因側(cè)翼序列，得到的側(cè)翼序列長度在300-750 bp，并且通過用Southern雜交對實驗結(jié)果進行了后期驗證。洪宇植［5］在0.5 μg DNA/mL的反應體系中，用DNA酶消化基因組并使酶解片段充分環(huán)化連接，最后用特異性引物進行長距離PCR使得酶解片段充分自身環(huán)化連接，其產(chǎn)物用25-30 nt的序列特異引物進行長距離PCR，從而獲得漆酶LacA基因上下游9 kb的序列信息。2010年，俄廣鑫等［15］利用優(yōu)化的I-PCR技術(shù)，參考限制性內(nèi)切酶EaeI Kit的具體實驗方法，對cDNA進行酶切消化，通過T4連接酶連接環(huán)化，獲得環(huán)狀DNA分子，最后通過PCR擴增得到豬部分豬精氨酸-絲氨酸蛋白激酶1（SRPK1）的5' UTR序列。2012年，張曉等［16］為獲取atpA基因的側(cè)翼序列，對I-PCR技術(shù)在2個方面進行了優(yōu)化，分別是將DNA片段自連時間延長到24 h、將PCR的起始模板量增加到500 ng，以保證目標產(chǎn)物高的擴增效率。Zimmermann［17］獲得了Bt11玉米的左右旁側(cè)序列。但是，該方法仍然存在許多不足之處：（1）需要從多種限制性內(nèi)切酶中選擇合適的限制酶，只有這樣才能獲得大小合適的DNA片段，因此，由于酶切位點的限制，導致部分靶標DNA的擴增不能使用該方法。（2）大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，因而通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

2 外源接頭介導PCR

該技術(shù)是將已知的序列通過連接酶的作用與待分離側(cè)翼區(qū)域連接起來，且已知序列位于限制性片段外側(cè)，然后根據(jù)未知序列兩旁的序列設計引物，從而進行PCR擴增獲得未知序列。根據(jù)連接到未知序列的接頭不同，將外源接頭介導PCR分為單鏈接頭、雙鏈接頭、載體接頭3類［4］。

2.1 單鏈接頭PCR

單鏈接頭PCR，又稱panhandle PCR（P-PCR）。1997年，Jones［18］發(fā)明了該方法，其基本原理：首先根據(jù)物種選擇合適的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，使酶切下的片段產(chǎn)生5'端黏性末端；在5'端黏性末端上接上一條單鏈接頭，單鏈接頭有以下兩個特點：一是接頭的5'端和黏性末端互補，二是單鏈接頭上，除了酶切序列以外，其余序列必須和已知序列中的一部分序列反向互補；由于單鏈接頭的末端是一個反向重復序列，故用該方法分離未知序列只需要一條引物。由于該方法的復雜性以及較低的特異性，導致該方法的應用較少。

Chen［19］通過對P-PCR改良，成功從線蟲中分離得到FOG-3基因啟動子序列；1997年，Jones對該方法進行了優(yōu)化，在PCR復性前，在3'末端加上ddCTP，利用改進的 P-PCR方法從人類基因組DNA擴增得到4-9 kb的片段。P-PCR在分離基因旁側(cè)序列研究中具有廣泛的應用價值。1999年，黃君健等［20］應用該技術(shù)擴增出端粒催化亞基hTERT基因5'端上游2 090 bp的旁側(cè)序列，F(xiàn)an等［21］利用該技術(shù)克隆出漆酶基因lac48424-1啟動子序列；Shang等［22］成功克隆出靈芝羊毛固醇合酶（LS）基因啟動子序列。

2014年，采用單接頭連接PCR 法順利地分離到了甘蔗SPSⅢ基因5'側(cè)翼序列。序列提交GenBank，查詢登錄號KC422670，為公共數(shù)據(jù)庫中首次提交的甘蔗SPSⅢ基因5'側(cè)翼序列［23］。

2.2 雙鏈接頭PCR

雙鏈接頭PCR，基本原理是先用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，讓基因組片段能產(chǎn)生黏性末端，將末端配對的接頭和限制性片段連接，以其作模板，用接頭引物和已知序列特異引物進行PCR擴增，即可獲得包含側(cè)翼序列的目標片段［24］。雙鏈接頭PCR在克隆基因轉(zhuǎn)錄起始位點或啟動子方面得到廣泛應用。

1994年，張國裕［25］用Sma I和EcoR V酶切的總DNA及雙鏈接頭介導PCR的染色體步行擴增出大小分別約為4.5 kb和900 bp的條帶，選擇較長的片段克隆測序，測序結(jié)果表明該技術(shù)成功克隆了青花菜脫氫抗壞血酸還原酶DHAR（dehydroascorbate reductase）上游的啟動子序列。2002年，北京大學蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國家重點實驗室選用Bcl I消化油菜基因組，用雙鏈接頭PCR成功克隆出一條專一條帶條，長約1.6 kb，經(jīng)測序表明該條帶與油菜質(zhì)膜水孔蛋白BnPIPI基因啟動子區(qū)完全相同（54 bp）［26］。2006年，張國裕等通過該技術(shù)克隆了青花菜雄性不育相關基因BoDHAR上游序列并獲得了DHAR基因cDNA及基因全長序列，且研究者表明，該技術(shù)的關鍵在于接頭的防自身擴增的設計以及通過兩步高退火溫度的PCR擴增來減少非特異性擴增［25］。2009年，鐘秋月［27］利用改良的雙鏈介導接頭PCR技術(shù)，通過兩輪極高退火溫度的PCR擴增，獲得番茄GGPS基因上游側(cè)翼序列。

2.3 載體接頭PCR

載體接頭PCR，是以基因組DNA的特異序列為引物和載體的通用引物擴增目的片段［28］。王新國等［29］通過載體接頭的技術(shù)克隆了胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動子。小鼠生長釋放激素基因5'端側(cè)翼序列和矮牽P450基因的5'端側(cè)翼序列也通過該方法獲得［30，31］。

3種外源接頭介導PCR雖然在分離基因啟動子與側(cè)翼序列等研究上得到廣泛應用，但該方法仍然存在一些明顯的缺點：（1）由于DNA缺口是被直接檢測，故需要合適酶或化學方法對基因組進行消化處理；（2）因為必須對PCR擴增后的產(chǎn)物進行連接，因此需要酸化DNA分子的5'端，使其具有可連接性；（3）參與平端連接只能在引物延伸進行到模板鏈的末端之后，因此控制好PCR的延伸時間十分重要。

3 半隨機引物PCR

3.1 熱不對稱交錯PCR法（TAIL-PCR）

熱不對稱交錯PCR法是一種依據(jù)已知基因序列來得到未知序列的PCR擴增技術(shù)，其原理為：通過高簡并性引物結(jié)合目標DNA；利用巢式PCR增強特異性、高、低溫超級PCR提高特異性產(chǎn)物的擴增效率，減少非特異性擴增；PCR產(chǎn)物作為下一輪模板，需進行一定程度的稀釋，以降低非特異性模板的比例；將第2輪和第3輪PCR產(chǎn)物通過電泳分析來判斷獲得的條帶是否為目標帶。該技術(shù)由Liu和Whitter［32］于1995年首先研究并報道，TAIL-PCR利用已知序列設計嵌套式特異性，且特異性引物的退火溫度均大于65℃，而兼并引物含有15-16個堿基，退火溫度在45℃左右，其兼并性在65-256倍之間，因此特異與非特異擴增產(chǎn)物的相對效率能通過溫度很好的控制。該技術(shù)的具體原理見圖2，具體的擴增方法見Liu等［32］的方法。

目前，應用該方法克隆了許多啟動子片段，通常能克隆約0.2-2 kb的旁側(cè)片段。因此，該方法在克隆基因啟動子的應用中表現(xiàn)出簡單、快速、高效等特點。如陳軍營［34］利用改良的TAIL-PCR通過4輪PCR反應，成功克隆到小麥PMH+-ATPase上游363 bp的旁側(cè)序列，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含該基因的啟動子區(qū)域；財音青格樂［35］通過3輪PCR擴增，分離得到300 bp的大豆β伴球蛋白α-亞基基因5'側(cè)翼序列，其中含有其啟動子片段；韓兆雪等［36］成功克隆了青稞2個B組醇溶蛋白基因Hordein基因的上游分別為395 bp、396 bp的調(diào)控序列、嗜堿芽孢桿菌PB92堿性蛋白酶基因aprE的619 bp的啟動子序列被成功克隆等［37］；邵彥春等［38］采用TAIL-PCR法，以紅曲霉色素突變株基因組為模板，獲得7個顯著片段，測序分析表明有一個片段為T-DNA插入位點側(cè)翼序列，番薯的pal和 pgi基因的5'側(cè)翼序列和銀杏查爾酮合成酶基因全序列也是通過該方法克隆得到的［39，40］。

圖2 TAIL-PCR技術(shù)原理［33］

3.2 高效熱不對稱PCR（hi-TAIL-PCR）

Liu等［41］結(jié)合TAIL-PCR以及抑制PCR的原理，提出的新的側(cè)翼序列分析方法，該方法在兼并引物的結(jié)構(gòu)，長短，兼并性上做了優(yōu)化，且運用了抑制PCR的原理，使得該方法比TAIL-PCR擴增得到的片段更長，更特異。與TAIL-PCR 相比，hi-TAILPCR用的具有更高簡并性（2304）的簡并引物（圖3），hi-TAIL-PCR由3輪PCR組成，第1輪由11次高特異性（Tm=65℃）擴增、一次極低退火溫度（25℃）的低特異性擴增、12次較高特異性（Tm=58℃）擴增；第2輪由2次較高特異性（Tm=65℃）擴增、2次高特異性（Tm=68℃）擴增和1次較低特異性（Tm= 68℃）擴增構(gòu)成的14個超級循環(huán)；第3輪由2次高特異性（Tm=68℃）擴增和1次較低特異性（Tm= 68℃）擴增構(gòu)成的6-7個超級循環(huán)。如Terauchi和 Kahl［42］從甘薯中克隆獲得苯丙氨酸氨裂解酶基因（Pal）啟動子；蕓苔 BcMF21 基因ATG上游約779 bp的啟動子都通過該技術(shù)克隆獲得［43-45］。侯娜等［46］采用hi-TAIL-PCR的方法，獲得了抗蟲棉06N-119的外源DNA插入位點的側(cè)翼序列。2013年，梁麗霞等［47］通過Hi-TAIL-PCR分離了轉(zhuǎn)SCK基因抗蟲水稻科豐2號的插入載體插入位點的旁側(cè)序列，并建立事件特異性檢測方法。

圖3 Hi-TAIL-PCR簡并引物示意圖

3.3 限制位點PCR（Restriction-site PCR，RSPCR）

由于基因組的復雜性，很多側(cè)翼序列擴增技術(shù)的應用受到很大程度的限制。1993年Sarkar［48］發(fā)明了RS-PCR，該方法中運用到的酶切位點分別是Taq I、EcoR I、Sau3A和BamH I。這些酶切位點具有以下特點：在生物基因組中分布具有隨機性；出現(xiàn)的頻率較高；不帶重復序列。Upcroft等［49］利用RS-PCR技術(shù)，通過SacⅠ酶切消化鞭毛蟲基因組，并用PCR方法成功擴增出抗藥性相關基因5'側(cè)翼序列片段。在這一成功案例的啟示下，Ji等［50］設計了一種無需酶切連接反應的染色體步移法，稱為“Restriction Site Extension PCR（RSE-PCR）”。

3.4 單寡核苷酸巢式PCR（single oligonucleotide nested PCR，SON-PCR）

SON-PCR由TAIL-PCR改進而來，用嵌套式特異引物代替其兼并引物，且用特殊的PCR循環(huán)進行擴增。具體實驗設計方法，見圖4。

Antal等［51］利用SON-PCR分離了兩基因（palH和pacC）的旁側(cè)序列。2006年，Guo等［52］研究者利用SON-PCR擴增了2個光合多樣性基因位點。

圖4 SON-PCR擴增未知序列示意圖［53］

4 其他方法

4.1 質(zhì)粒拯救法（plasmid rescue）

Plasmid rescue技術(shù)的原理如下：首先選擇合適的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，用連接酶連接環(huán)化消化產(chǎn)物，通過轉(zhuǎn)化方法將環(huán)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過菌落PCR等方法鑒定陽性菌株，經(jīng)測序分析獲得側(cè)翼序列。該方法應用范圍窄，篩選繁瑣，工作量大，只能作為染色體步移的補充工具。質(zhì)粒拯救法是一種經(jīng)典的分子生物學方法，目前該方法主要用于轉(zhuǎn)座子或自殺質(zhì)粒插入位點周圍序列的鑒定。細菌基因組大片段的克隆是細菌功能研究的一個難點，王玉飛［54］通過質(zhì)粒拯救法，將待克隆的基因一側(cè)序列連接到自殺載體上，構(gòu)建出打靶質(zhì)粒并將其整合到原細菌基因組上，通過酶切、自連及轉(zhuǎn)化后將自殺載體與需要克隆的目標大片段一起拯救出來。質(zhì)粒拯救法除了在克隆細菌大片段上用得較為廣泛外，其在克隆已知基因的插入位點及其相關基因上大量應用。鮑曉明［55］將轉(zhuǎn)座標簽導入酵母，建立插入突變株庫，通過質(zhì)粒拯救法，在非生物脅迫的下篩選出抗逆相關基因。袁亮［56］通過TAIL-PCR與質(zhì)粒拯救PCR法再8個水稻突變體中快速分離水稻條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）Tn5致病相關基因，譚曉紅等［57］通過該技術(shù)獲得了來自誘捕載體整合位點附近的新基因。

4.2 PCR-walking法

PCR-walking法是利用DNA探針作為“誘餌”，依次釣出與探針有重疊區(qū)域的DNA片段，從而獲得目的基因的旁側(cè)序列，只將PCR與探針結(jié)合就提高了該方法的特異性，且免去建庫的繁瑣步驟，操作更加簡明［58］。Sibert等［59］利用該技術(shù)克隆了tPA基因上游分別為1.8、4.5和0.9 kb的片段。

4.3 Sequence-base分離法

Sequence-base分離法通常通過PCR擴增獲得T-DNA與被研究基因之間的連接區(qū)域。該方法的關鍵在于引物，一端引物根據(jù)插入T-DNA的末端序列設計，該引物3'端向外，另一條擴增引物根據(jù)目標基因設計。擬藍芥actin基因的研究就用到了此方法。

4.4 連接介導PCR（Ligation-mediated PCR，LMPCR）

連接介導PCR法首先使用小的寡核苷酸接頭連接通過限制性內(nèi)切酶消化的靶DNA片段，然后選擇與接頭結(jié)合的PCR引物來擴增未知的靶片段。該方法在擴增單側(cè)序列上應用較多，此外，該方法在分離啟動子和基因側(cè)翼序列也有應用。

5 小結(jié)

綜上所述，基因側(cè)翼序列的分析方法很多，但均有其優(yōu)勢與不足（表1）。它們在分子生物學的研究中起重要的作用，并且隨著人們對生物體乃至基因的了解不斷深入，對基因的調(diào)控序列、側(cè)翼序列、啟動子序列的研究將會越來越多，這些用于克隆側(cè)翼未知序列的技術(shù)將會有更廣闊的應用空間。目前對克隆側(cè)翼序列方法的研究從未停止過，因此，隨著分子生物物技術(shù)的不斷進步，更多簡單、高效的旁側(cè)序列克隆方法一定會不斷涌現(xiàn)。

表1 側(cè)翼虛列擴增技術(shù)比較

［1］祁洋, 李燕, 王永智, 等. 擴增 T-DNA插入位點側(cè)翼序列的方法及其應用進展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2009, 37（17）：7907-7908, 7927.

［2］顏靜宛, 林琳, 王鋒. 獲得基因側(cè)翼序列位點信息的幾種擴增方法［J］. 福建農(nóng)業(yè)學報, 2005, 20（增刊）：125-129.

［3］洪登峰, 萬麗麗, 楊光圣. 側(cè)翼序列克隆方法評價［J］. 分子植物育種, 2006, 4（2）：280-288.

［4］康丹, 等. 染色體步移技術(shù)克隆已知序列側(cè)翼啟動子的研究進展［J］. 農(nóng) 業(yè)生物技術(shù)學報, 2013, 21（3）：355-366.

［5］洪宇植, 肖亞中, 房偉, 等. 長距離反向 PCR技術(shù)高效擴增已知 DNA片斷的側(cè)翼序列［J］. 激光生物學報, 2006, 1：46-49.

［6］Digeon JF, Guiderdoni E, Alary R, et al. Cloning of a wheat puroindoline gene promoter by IPCR and analysis of promoter regions required for tissue-specific expression in transgenic rice seedsR［J］. Plant Molecular Biology, 1999, 39（6）：1101-1112.

［7］van Heel DA, Allen M, Jewell DP, Carey AH. A revised sequence of the human β7 integrin gene（ITGB7）promoter region obtained by inverse PCR［J］. Immunogenetics, 2000, 51（10）：863-865.

［8］Chen L, Tu Z, Hussain J, et al. Isolation and heterologous transformation analysis of a pollen-specific promoter from wheat（Triticum aestivum L. ）［J］. Mol Biol Rep, 2010, 2：737-744.

［9］馮麗, 任茂智, 羅洪發(fā), 等. 分離植物目的基因全長cDNA 和啟動子的新方法-快速定位轉(zhuǎn)錄起始位點（RITIS）［J］. 分子植物育種, 2006, 1（4）：23-28.

［10］Forester C, Arthur E, Crespi S, et al. Isolation of a pea（Pisum sativum）seed lipoxygenase promoter by inverse polymerase chain reaction and characterization of its expression in transgenic tobacco［J］. Plant Mol Biol, 1994, 26（1）：235-248.

［11］Tsaftaris A, Pasentzis K, Argiriou A. Rolling circle amplification of genomic templates for inverse PCR（RCA-GIP）：A method for 5’-and 3’-genome walking without anchoring［J］. Biotechnology Letters, 2010, 32（1）：157-161.

［12］李竹紅, 等. 改進的反向 PCR 技術(shù)克隆轉(zhuǎn)移基因的旁側(cè)序列［J］. 生物化學與生物物理進展, 1996, 26（6）：600-603.

［13］ Yu QG, Hu NJ, Lu YN, et al. Yanagihara. rapid acquisition of entire DNA polymerase gene of a novel herpes virus from green turtle fibropap illoma by a genomic walking technique［J］. J Virol Methods, 2001, 91（2）：183-195.

［14］韓志勇, 王新其, 沈革志, 等. 反向 PCR 克隆轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列［J］. 上海農(nóng)業(yè)學報, 2001, 17（2）：27-32.

［15］俄廣鑫, 劉娣, 張冬杰, 等. 豬精氨酸-絲氨酸蛋白激酶1（SRPK1）克隆表達及功能初步分析［J］. 畜牧獸醫(yī)學報, 2010, 41（11）：1379-1386.

［16］張曉, 張銳, 孫國清, 等. 優(yōu)化的反向PCR結(jié)合TAIL-PCR法克隆棉花線粒體atpA雙拷貝基因及其側(cè)翼序列［J］. 生物工程學報, 2012, 28（1）：104-115.

［17］Zimmermann A, Liithy J, Pauli U. Event specific transgene detection in Btl1 corn byquantitative PCR at the integration site［J］. LWT-Food Science and Technology, 2000, 33（3）：210-216.

［18］Jones DH, Winistorfer SC. Sequence specific generation of a DNA panhandle permits PCR amplification of unknown flanking DNA［J］. Nucl Acid Res, 1997, 20（3）：595-600.

［19］Chen PJ, Cho S, Jin SW, Ellis RE. Specification of germ cell fates by FOG-3 has been conserved during nematode evolution［J］. Genetics, 2001, 158（4）：1513-1525.

［20］黃君健, 李杰之, 林堅, 等. 人端粒酶催化亞基 hTERT 基因啟動子的克?。跩］. 生物技術(shù)通訊, 1999, 10（3）：36-39.

［21］Fan F, Zhuo R, Sun S, et al. Cloning and functional analysis of a new laccase gene from Trametes sp. 48424 which had the high yield of laccase and strong ability for decolorizing different dyes［J］. Bioresource Technology, 2011, 102（3）：3126-3137.

［22］Shang CH, Shi L, Ren A, et al. Molecular cloning, characterization, and differential expression of a lanosterol synthase gene from Ganoderma lucidum［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2010, 74（5）：974-978.

［23］周平, 何煒, 金光, 等. 甘蔗SPSⅢ基因組DNA及5'側(cè)翼序列的克隆與分析［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2014, 22（1）：1-9.

［24］Rosenthal A, Jones DSC. Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction［J］. Nucleic Acids Res, 1990, 18（10）：3095-3096.

［25］張國裕, 等. 青花菜雄性不育相關基因BoDHAR的克隆與表達分析［J］. 生物工程學報, 2006, 22（5）：752-756.

［26］于秋菊, 杜麗, 胡鴦雷, 等. 油菜質(zhì)膜水孔蛋白基因BnPIPI啟動子區(qū)的克隆及初步的功能分析［J］. 中國科學（C輯）, 2002, 6（32）：521-525.

［27］鐘秋月, 國艷梅, 梁燕. 兩個不同來源的番茄GGPS基因克隆和序列分析［J］. 華北農(nóng)學報, 2009, 24（3）：15-22.

［28］Shyamala V, Ames GFL. Genome walking by single-specific-primer polymerase chain reaction：SSP-PCR［J］. Gene, 1989, 84（1）：1-8.

［29］ 王新國, 張國華. 用銜接頭 PCR 克隆新的胡蘿卜Ⅱ型轉(zhuǎn)化酶基因啟動子［J］. 中國生物學與分子生物學報, 2001, 1：61-65.

［30］Mizobuchi M, Frohman L. Rapid amplification of genomic DNA ends［J］. Biotechniques, 1993, 15（2）：214-221.

［31］Shimada Y, Ohbayashi M, Nakano-Shimada R, et al. A novel metho clone P450s with modified single-specific-primer PCR［J］. Plant Molecular Biology Reporter, 1999, 17（4）：355-361.

［32］Liu YG, Whittier RF. Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking［J］. Genomics,1995, 25（3）：674-681.

［33］羅麗娟, 施季森. 一種DNA側(cè)翼序列分離技術(shù)—TAILPCR［J］. 南京林業(yè)大學學報, 2003, 27（4）：87-90.

［34］陳軍營, 沈向磊, 辛玉茹, 等. 改良TAIL-PCR技術(shù)在小麥PM H+-ATP-Pase基因啟動子克隆中的應用［J］. 河南農(nóng)業(yè)大學學報, 2008, 42（1）：1-5.

［35］財音青格樂, 李明春, 蔡易, 等. 大豆種子特異性啟動子的克隆及序列分析［J］. 作物學報, 2005, 31（1）：11-17.

［36］韓兆雪, 吳芳, 趙桃, 等. 青稞B組醇溶蛋白基因5'上游調(diào)控區(qū)的TAIL-PCR克隆及序列分析［J］. 麥類作物學報, 2007, 27（4）：613-618.

［37］陳坤, 黎明, 成堃, 等. 嗜堿芽孢桿菌PB92堿性蛋白酶基因啟動子的克隆及應用［J］. 遺傳, 2008, 30（11）：1513-1520.

［38］邵彥春, 丁月娣, 陳福生, 等. TAIL-PCR法快速分離紅曲霉色素突變株T-DNA插入位點側(cè)翼序列［J］. 微生物學通報, 2007, 34（2）：323-326.

［39］Teruchi R, Kahl G. Rapid isolation of promoter sequences by TAIL-PCR：the 5’-flanking regions of pal and pgi genes from yams［J］. Mol Gen Genet, 2000, 263（3）：554-560.

［40］許鋒, 程水源, 王燕, 等. TAIL-PCR方法快速克隆銀杏查爾酮合成酶基因及序列分析［J］. 果樹學報, 2007, 2：237-243.

［41］Liu YG, Chen YL. High-efficiency thermal asym metric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences［J］. Biotechniques, 2007, 43（5）：649-654.

［42］Terauchi R, Kahl G. Rapid isolation of promoter sequences by TAIL-PCR：The 5’-flanking regions of Pal and Pgi genes from yams（Dioscorea）［J］. Mol Gen Genet MGG, 2000, 63（3）：554-560.

［43］Wang P, Sun Y, Li X, et al. Rapid isolation and functional analysis of promoter sequences of the nitrate reductase gene from Chlorella ellipsoidea［J］. J Appl Phycol, 2004, 16（1）：11-16.

［44］Du HW, Zhang ZX, Li JS. Isolation and functional characterization of a waterlogging-induced promoter from maize［J］. Plant Cell Reports, 2010, 29（11）：1269-1275.

［45］Jiang JJ, Yu XL, Miao Y, et al. Sequence characterization and expression pattern of BcMF21, a novel gene related to pollen development in Brassica campestris ssp. chinensis［J］. Molecular Biology Reports, 2012, 39（7）：7319-7326.

［46］侯娜, 賀輝群, 董美, 等. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉外源DNA插入整合結(jié)構(gòu)分析和轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法的建立［J］. 分子植物育種, 2012, 10（3）：317-323.

［47］ 梁利霞. 轉(zhuǎn)基因水稻檢測方法研究［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院, 2013.

［48］Sarkar G, Turner RT, Bolander ME. Restriction-site PCR：A direct method of unknown sequence retrieval adjacent to a known locus by using universal primers［J］. Genome Res, 1993, 4：318-322.

［49］ Upcroft P, Healey A. PCR priming from the restriction endonuclease site 3’extension［J］. Nucleic Acids Research, 1993, 21（20）：4854.

［50］Ji J, Braam J. Restriction sSite extension PCR：A novel method for high-throughput characterization of tagged DNA fragments and genome walking［J］. PLoS ONE, 2010, 5（5）：e10577.

［51］Antal Z, Rascle C, Fevre M, Bruel C. Single oligonucleotide nested PCR：A rapid method for the isolation of genes and their flanking regions from expressed sequence tags［J］. Current Genetics, 2004, 46（4）：240-246.

［52］Guo H, Xiong J. A specific and versatile genome walking technique［J］. Gene, 2006, 381：18-23.

［53］楊琳. T-DNA在農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)基因玉米中的整合模式［M］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學, 2012.

［54］王玉飛, 陳澤良, 喬鳳, 等. 質(zhì)粒拯救法克隆細菌基因組大片段［J］. 微生物學報, 2008, 48（4）：532-538.

［55］鮑曉明, 等. 轉(zhuǎn)座子標簽及其在釀酒酵母基因功能研究中的應用［J］. 中國生物工程雜志, 2003, 11：53-55.

［56］袁亮, 李玉蓉, 張希福, 等. 熱不對稱PCR（TAIL-PCR）和Tn5轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒拯救法快速分離水稻條斑病菌致病相關基因［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2009, 17（6）：1089-1095.

［57］譚曉紅, 程置, 毛春明, 等. 利用基因誘捕技術(shù)進行小鼠基因剔除的初步研究［J］. 生物化學與生物物理進展, 2004, 31（7）：606-610.

［58］Rosenthal A, Jones DS. Gene walking and sequencing by oligocassette mediated polymerase chain reaction［J］. Nucleic Acids Res, 1990, 18（10）：3095-3096.

［59］Siebert PD, Chenchik A, Kellogg DE, et al. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA［J］. Nucleic Acids Research, 1995, 23（6）：1087-1088.

（責任編輯 馬鑫）

Application Progress on Amplified Methods to Clone Flanking Sequence

PU Yuan-bo1GUO Cui2PING Shu-zhen2
（1. North Sichuan College of Preschool Teacher Education，Guangyuan 628017；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Amplifying the flanking sequence of genes plays an important role in molecular biology research. Until so far，the methods used to clone flanking sequence can been categorized into three groups：I-PCR，LA-PCR and TAIL-PCR. This paper briefly introduces the principle and present applications of these methods，which provides basis for researchers to choose more reliable and reasonable method.

flanking sequence；I-PCR；LA-PCR；TAIL-PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.010

2016-07-13

蒲遠波，男，研究方向：生物教育，教育技術(shù)學；E-mail：wjdsz@vip.sina.com

平淑珍，女，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：pingszhen@126.com