龔艷杰 魏明 涂玲 劉佳 梁穎紅 張宜花 楊璐
基礎(chǔ)研究
輸血相關(guān)急性肺損傷對(duì)大鼠血漿和肺組織血管生成素-2表達(dá)的影響
龔艷杰 魏明 涂玲 劉佳 梁穎紅 張宜花 楊璐
目的 探討輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)時(shí)血漿和肺組織中血管生成素-2(Ang-2)的表達(dá)及其意義。方法 選擇60只SD大鼠,按隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水(NS)對(duì)照組、脂多糖(LPS)對(duì)照組、TRALI模型組、急性肺損傷(ALI)對(duì)照組,每組15只。采用“LPS-血漿二次打擊”法復(fù)制TRALI大鼠模型。NS對(duì)照組腹腔注射N(xiāo)S 2 mL,移除大鼠血液1 mL后輸注等體積NS。LPS對(duì)照組大鼠腹腔注射2 mg/kg LPS(1 min內(nèi)注完) 1 mL 2 h后靜脈輸注等體積NS。TRALI模型組腹腔注射2 mg/kg LPS 1 mL,2 h后靜脈輸注血漿1 mL。ALI對(duì)照組靜脈輸注5 mg/kg LPS 1 mL誘導(dǎo)ALI。制模完成后處死大鼠取肺組織觀察病理學(xué)改變并進(jìn)行肺損傷評(píng)分;取支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例(NEUT);用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Bolt)檢測(cè)血漿中Ang-2蛋白表達(dá);免疫組化法觀察肺組織中Ang-2陽(yáng)性表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)大鼠肺組織中Ang-2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 光鏡下可見(jiàn),NS對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,肺泡內(nèi)未見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出及肺泡萎陷,肺泡間隔均一無(wú)增寬;LPS對(duì)照組肺泡間隔輕度增寬、有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);TRALI模型組肺泡間隔增寬、中等量出血并有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn);ALI對(duì)照組肺內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)水腫加重,伴出血、微血栓及灶性肺不張。ALI對(duì)照組、TRALI模型組血漿Ang-2蛋白和肺組織Ang-2 mRNA表達(dá)均顯著高于NS對(duì)照組、LPS對(duì)照組〔Ang-2蛋白(灰度值):0.58±0.09、0.43±0.07比 0.12±0.03、0.20±0.05,Ang-2 mRNA(2-ΔΔCt):0.39±0.10、0.29±0.09比 0.10±0.05、0.16±0.04,P均< 0.01〕;ALI對(duì)照組、TRALI模型組BALF細(xì)胞總數(shù)(×106/L:361±78、310±76比101±63、165±65)、NEUT(0.396±0.125、0.335±0.115比0.098±0.035、0.114±0.041)均明顯高于NS對(duì)照組和LPS對(duì)照組(P均< 0.05);ALI對(duì)照組、TRALI模型組病理學(xué)評(píng)分、肺濕重/體重比值和動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)均顯著高于NS對(duì)照組和LPS對(duì)照組(P均< 0.05)。ALI對(duì)照組與TRALI模型組各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均> 0.05)。結(jié)論 TRALI大鼠肺組織和血漿中Ang-2的表達(dá)升高,提示Ang-2可能參與了TRALI病理生理過(guò)程。
肺損傷,急性,輸血相關(guān);血管生成素-2;脂多糖;血漿
隨著血液采集、血制品制備過(guò)程中消毒滅菌技術(shù)的提高和操作規(guī)程的不斷完善,多數(shù)輸血相關(guān)并發(fā)癥已得到了較滿(mǎn)意的控制。但免疫相關(guān)性輸血并發(fā)癥問(wèn)題卻日益突出[1],輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)就是其中之一,TRALI通常發(fā)生于輸血期間或輸血后6 h內(nèi),以急性缺氧和非心源性肺水腫為特點(diǎn),因其病死率高而越來(lái)越受到重視[2-3],但TRALI的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。
血管生成素(Ang)在炎癥和血管動(dòng)態(tài)平衡中扮演著重要的角色,被認(rèn)為可能具有前炎性介質(zhì)的作用[4],在急性肺損傷(ALI)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5-6],但其在TRALI發(fā)病中的作用尚不清楚。研究表明,脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠ALI 程度與劑量和時(shí)間呈正相關(guān)[7]。
本研究通過(guò)“LPS-血漿二次打擊法”[8]建立TRALI大鼠模型,觀察Ang-2在TRALI肺組織中表達(dá)水平的變化,探討Ang-2在介導(dǎo)TRALI大鼠肺損傷中的作用。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~7周齡雄性SD大鼠180只,體重(235±25)g,無(wú)特定病原體條件下飼養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、飲水、墊料及一切物品均經(jīng)無(wú)菌處理。
1.1.2 主要材料 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)儀、SybrGreen PCR混合液(美國(guó)ABI公司);低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);-80 ℃冰箱(日本SANYO公司);電熱恒溫水浴箱(上海凈化設(shè)備有限公司);LPS(美國(guó)Sigma公司);氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司);蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Bolt)檢測(cè)試劑(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);第1鏈cDNA合成試劑盒、TRIzol試劑、氯仿、異丙醇(美國(guó)BBI公司);無(wú)水乙醇(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。
1.2 動(dòng)物模型制備及處理 將60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水(NS)對(duì)照組、LPS對(duì)照組、TRALI模型組、ALI對(duì)照組,每組15只。參照文獻(xiàn)[8]方法采用“LPS-血漿二次打擊”法復(fù)制TRALI模型。① NS對(duì)照組經(jīng)腹腔注射N(xiāo)S 2 mL,并移除大鼠血液1 mL后輸注等體積NS。② LPS對(duì)照組經(jīng)大鼠腹腔注射LPS 2 mg/kg(1 min內(nèi)注完)1 mL 2 h后輸注等體積NS。③ TRALI模型組腹腔注射LPS 2 mg/kg(1 min內(nèi)注完)1 mL,回籠后2 h,腹腔注射氯胺酮80 mg/kg麻醉大鼠分離股血管并插管,內(nèi)充50%肝素-NS混合液,5~10 min內(nèi)移除約大鼠10%血容量的血液(1 mL),再輸注1 mL血漿,輸注速度為≤4 mL/h。④ ALI對(duì)照組:移除約為大鼠10%血容量的血液(1 mL)后輸注1 mL 5 mg/kg LPS。各組大鼠取血漿-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 倫理學(xué) 本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
1.4 觀察指標(biāo)及方法
1.4.1 血漿制備 參照文獻(xiàn)[9-10]方法,無(wú)菌條件下采集120只SD大鼠全血1.5 U(1 U含全血150 mL及枸櫞酸鈉、枸櫞酸、葡萄糖、腺嘌呤與磷酸二氫鈉混合制成的滅菌水溶液45 mL),(4±2)℃儲(chǔ)存28 d后,3 000 r/min(離心半徑10 cm)分離血漿100 mL,無(wú)菌條件下分裝100份,每份1 mL,-80 ℃保存?zhèn)溆?,輸注前將血漿56 ℃水浴30 min。
1.4.2 肺組織相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)及病理學(xué)觀察 腹腔注射0.35 mg/kg水合氯醛麻醉大鼠后開(kāi)胸,暴露心肺,右心室采血處死動(dòng)物,左心室取血,檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2);取左肺稱(chēng)重,計(jì)算肺濕重/體重比值;取支氣管肺泡灌洗液(BALF),檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例(NEUT);取右肺石蠟包埋,蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織病理?yè)p傷程度,并按Mikawa等[11]方法進(jìn)行肺損傷評(píng)分:按肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4項(xiàng)指標(biāo),分別依病變程度評(píng)分:0分為無(wú)病變或非常輕微;1分為輕度病變;2分為中度病變; 3分為重度病變;4分為極重度病變。各項(xiàng)評(píng)分相加為ALI總評(píng)分。
1.4.3 Western Blot檢測(cè)血漿Ang-2蛋白表達(dá)從血漿中提取總蛋白,取50 μg蛋白質(zhì)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜放入含50 g/L脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBS-T)中封閉,4 ℃過(guò)夜后用PBS-T洗膜3次,每次10 min;然后加入一抗(1∶500 Ang-2)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin,1∶1 000)37 ℃孵育2 h;除去一抗,用PBS-T洗膜3次,每次10 min;然后加入與一抗相應(yīng)的二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h;用PBS-T洗膜3次,每次10 min;最后用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行檢測(cè),壓片、顯影、定影,膠片進(jìn)行圖像分析。以目的蛋白與β-actin的灰度值比值作為目的蛋白的表達(dá)量。
1.4.4 免疫組化鏈霉素-親和素-生物素-過(guò)氧化物酶(SABC)法檢測(cè)肺組織Ang-2陽(yáng)性表達(dá) 濃縮型Ang-2兔抗鼠多克隆抗體、SABC試劑盒及3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司,操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)肺組織Ang-2 mRNA表達(dá) 采用TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA。cDNA合成RT-PCR前使用DNA Eraser去除基因組DNA,純化的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系20 μL。各樣品目的基因和管家基因全部進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,采用SYBRGreen法。引物設(shè)計(jì)參照 Genebank的基因序列和Primerbank的推薦,Ang-2擴(kuò)增產(chǎn)物大小236 bp,上游引物:5'-TTCGGA CTCTGTCACAAGCAA-3',下游引物:5'-ACAAGAC GGAACAACGAACTG-3';β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物大小229 bp,上游引物:5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3';下游引物:5'-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3'。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。每個(gè)樣品按相同條件重復(fù)3次,與管家基因β-actin均一化以消除誤差后取平均值,用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)水平。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多個(gè)樣本均數(shù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行多重比較,方差不齊時(shí)采用Welch分析;P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組肺組織病理學(xué)觀察 光鏡下可見(jiàn),NS對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整,肺泡內(nèi)未見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出及肺泡萎陷,肺泡間隔均一無(wú)增寬;LPS對(duì)照組肺泡間隔輕度增寬,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);TRALI模型組肺泡間隔增寬、中等量出血并有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn);ALI對(duì)照組肺內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)水腫加重,伴出血、微血栓及灶性肺不張。見(jiàn)圖1。表1顯示,ALI對(duì)照組和TRALI模型組肺組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于NS對(duì)照組及LPS對(duì)照組(P均< 0.05);而ALI對(duì)照組與TRALI模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均> 0.05)。
圖1 各組肺組織病理學(xué)改變(HE染色 中倍放大)
2.2 各組肺濕重/體重比值和PaO2比較 ALI對(duì)照組和TRALI模型組大鼠肺濕重/體重比值顯著高于NS對(duì)照組和LPS對(duì)照組(P均< 0.05),同時(shí)伴有換氣功能的障礙,表現(xiàn)為PaO2降低(P均< 0.05);而ALI對(duì)照組與TRALI模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均> 0.05)。見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠肺濕重/體重比值、PaO2及肺組織病理學(xué)評(píng)分比較(±s)
表1 各組大鼠肺濕重/體重比值、PaO2及肺組織病理學(xué)評(píng)分比較(±s)
注:與NS對(duì)照組比較,aP < 0.01;與LPS對(duì)照組比較,bP < 0.05;1 mmHg = 0.133 kPa
病理學(xué)評(píng)分(分)NS對(duì)照組 15 0.10±0.07 96.47±5.64 0.00±0.00 LPS對(duì)照組 15 0.13±0.07 75.34±2.78 1.07±0.48 TRALI模型組 15 0.18±0.06ab 60.45±3.68ab 1.98±0.87ab ALI對(duì)照組 15 0.20±0.05ab 47.29±4.28ab 2.32±0.70ab組別 動(dòng)物數(shù)(只)肺濕重/體重比值PaO2(mmHg)
2.3 各組BALF細(xì)胞總數(shù)和NEUT比較 ALI對(duì)照組和TRALI模型組BALF細(xì)胞總數(shù)及NEUT均顯著高于NS對(duì)照組和LPS對(duì)照組(均P < 0.05);而ALI對(duì)照組與TRALI模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P > 0.05)。見(jiàn)表2。
表2 各組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和NEUT比較(±s)
表2 各組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和NEUT比較(±s)
注:與NS對(duì)照組比較,aP < 0.01;與LPS對(duì)照組比較,bP < 0.05
組別 動(dòng)物數(shù)(只)細(xì)胞總數(shù)(×106/L) NEUT NS對(duì)照組 15 101±63 0.098±0.035 LPS對(duì)照組 15 165±65 0.114±0.041 TRALI模型組 15 310±76ab 0.335±0.115ab ALI對(duì)照組 15 361±78ab 0.396±0.125ab F值 13.820 5.410 P值 < 0.001 0.001
2.4 各組血漿Ang-2蛋白表達(dá)比較 ALI對(duì)照組和TRALI模型組大鼠血漿Ang-2蛋白表達(dá)均顯著高于NS對(duì)照組及LPS對(duì)照組(P均< 0.01);而NS對(duì)照組與LPS對(duì)照組血漿Ang-2蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見(jiàn)表3和圖2。
表3 各組大鼠血漿Ang-2蛋白和肺組織Ang-2 mRNA表達(dá)比較(±s)
表3 各組大鼠血漿Ang-2蛋白和肺組織Ang-2 mRNA表達(dá)比較(±s)
注:與NS對(duì)照組比較,aP < 0.01;LPS對(duì)照組比較,bP < 0.01
組別 動(dòng)物數(shù)(只)Ang-2蛋白(灰度值)Ang-2 mRNA(2-ΔΔCt)NS對(duì)照組 15 0.12±0.03 0.10±0.05 LPS對(duì)照組 15 0.20±0.05 0.16±0.04 TRALI組 15 0.43±0.07ab 0.29±0.09ab ALI對(duì)照組 15 0.58±0.09ab 0.39±0.10ab
圖2 Western Blot檢測(cè)血漿Ang-2蛋白表達(dá)
2.5 各組肺組織Ang-2蛋白表達(dá)比較 NS對(duì)照組和LPS對(duì)照組支氣管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞均有Ang-2表達(dá),而肺泡腔內(nèi)無(wú)異常表達(dá);TRALI模型組和ALI對(duì)照組Ang-2除與NS對(duì)照組相同部位的表達(dá)之外,TRALI模型組在支氣管上皮細(xì)胞存在高表達(dá),甚至黏膜下層有表達(dá),肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞高表達(dá)Ang-2;ALI對(duì)照組肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞Ang-2表達(dá)增高,在血管外膜和浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞亦存在Ang-2高表達(dá)。見(jiàn)圖3。
2.6 各組肺組織Ang-2 mRNA表達(dá)比較 ALI對(duì)照組和TRALI模型組大鼠肺組織Ang-2 mRNA表達(dá)均顯著高于NS對(duì)照組及LPS對(duì)照組(P均< 0.01);而NS對(duì)照組與LPS對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見(jiàn)表3。
關(guān)于TRALI的機(jī)制有多種學(xué)說(shuō),“二次打擊學(xué)說(shuō)”對(duì)TRALI發(fā)病機(jī)制的解釋較為合理:第一次打擊是患者輸血當(dāng)時(shí)的臨床病理狀態(tài)(如膿毒癥、近期外科手術(shù)、大量輸血),這種狀態(tài)導(dǎo)致循環(huán)中的中性粒細(xì)胞(PMN)被激活并隱蔽在肺內(nèi)[12];呼吸系統(tǒng)細(xì)菌感染患者PMN體積參數(shù)的變化可為臨床診斷呼吸系統(tǒng)疾病起到很好的提示作用[13]。第二次打擊是輸入含白細(xì)胞抗體血液和(或)含生物活性脂質(zhì)的庫(kù)存血,與受者白細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)并激活補(bǔ)體,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Fcγ受體引起PMN在肺微血管內(nèi)黏附、聚集和滯留[14-15]。PMN的脫粒產(chǎn)物導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮損傷和通透性增加,肺微血管滲漏使液體和蛋白質(zhì)滲入肺泡及間質(zhì)中,發(fā)生滲透性肺水腫,從而影響氣體交換,出現(xiàn)低氧血癥,引起TRALI的臨床表現(xiàn)。有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)TRALI依賴(lài)于機(jī)體基本情況的嚴(yán)重程度以及所輸注的血液制品[16]。危重患者往往有著可能激活PMN的基礎(chǔ)條件,“二次打擊學(xué)說(shuō)”或許能夠解釋TRALI在這類(lèi)人群中的高發(fā)病率[17]。
圖3 免疫組化法檢測(cè)肺組織Ang-2陽(yáng)性表達(dá) NS對(duì)照組支氣管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)Ang-2陽(yáng)性表達(dá)(A~B),肺泡腔無(wú)Ang-2陽(yáng)性表達(dá)(C);LPS對(duì)照組支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、支氣管黏膜下層可見(jiàn)Ang-2蛋白表達(dá)(D~E),肺泡腔無(wú)Ang-2陽(yáng)性表達(dá)(F);TRALI模型組支氣管上皮細(xì)胞、肺泡腔、支氣管黏膜下層可見(jiàn)Ang-2陽(yáng)性表達(dá)(G~I(xiàn));ALI對(duì)照組支氣管上皮細(xì)胞、肺泡腔、血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞均可見(jiàn)Ang-2陽(yáng)性表達(dá)(J~L) 箭頭所示為Ang-2蛋白表達(dá)(SABC 高倍放大)
PMN于肺內(nèi)大量積聚可能是導(dǎo)致TRALI的關(guān)鍵,但PMN聚集扣留于肺內(nèi)的機(jī)制尚不清楚[18]。張如愿等[19]對(duì)Ang-2在膿毒癥和ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)中作用的相關(guān)研究進(jìn)行綜述,認(rèn)為Ang-2動(dòng)態(tài)變化的研究將為針對(duì)Ang-2進(jìn)行特異性干預(yù)的時(shí)機(jī)提供基礎(chǔ),此外,由于可溶性Tie-2具有與Ang-1、Ang-2結(jié)合的能力,因此需要進(jìn)一步在臨床研究中檢測(cè)可溶性Tie-2水平,以加深對(duì)Ang/Tie-2系統(tǒng)在危重癥中作用的理解。鐘明媚等[20]采用前瞻性觀察性研究方法,通過(guò)檢測(cè)53例ARDS患者血漿Ang-2 濃度,探討Ang-2在ARDS診斷及預(yù)后判斷中的意義。結(jié)果顯示,ARDS 患者血漿Ang-2 水平顯著升高,當(dāng)Ang-2 的最佳臨界值為1.79 μg/L時(shí),診斷ARDS的特異度為90.0%,敏感度為92.5%,可以作為肺損傷病情嚴(yán)重程度判斷和預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)。齊志江等[21]前瞻性序貫收集腸道病毒71型(EV71)感染性肺水腫患兒和EV71感染無(wú)肺水腫患兒各20例,觀察EV71感染患兒肺水腫的臨床特點(diǎn)及血清Ang-2的變化,探討Ang-2與肺水腫發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果顯示,EV71感染性肺水腫患兒肺水中富含蛋白,且血清及肺水中均高表達(dá)Ang-2,Ang-2可能參與肺部血管滲漏、肺水腫的發(fā)病過(guò)程。還有研究表明,Ang/Tie-2系統(tǒng)在炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞活化及炎性細(xì)胞滲出中起重要作用[22]。Fiedler等[23]向小鼠腹腔注入金黃色葡萄球菌,收集腹腔灌洗液顯示Ang-2基因缺陷鼠未能有效地招募PMN,炎癥反應(yīng)減輕。Lemieux等[24]發(fā)現(xiàn),Ang-2可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞P選擇素的定位,而Ang-2可以激活PMN的Tie-2,增強(qiáng)其黏附能力,說(shuō)明Ang-2在介導(dǎo)PMN滲出方面其有重要作用。
本研究肺組織病理學(xué)顯示,TRALI模型組肺組織中有大量PMN浸潤(rùn),可見(jiàn)肺泡壁增厚、充血、肺泡萎陷、肺水腫等ALI的病理改變;同時(shí)伴有換氣功能障礙,表現(xiàn)為氧分壓降低;BALF細(xì)胞總數(shù)和NEUT較NS對(duì)照組和LPS對(duì)照組增加;免疫組化結(jié)果證實(shí),肺泡腔內(nèi)、支氣管黏膜下層及大動(dòng)脈、靜脈外膜存在Ang-2表達(dá)的PMN和巨噬細(xì)胞,表明Ang-2/Tie-2可能與TRALI發(fā)病過(guò)程中PMN的浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)有關(guān),由此可以推測(cè),在TRALI病理生理過(guò)程中Ang-2可能發(fā)揮了一定作用,但其是否參與了TRALI肺毛細(xì)血管通透性增加的機(jī)制,尚待進(jìn)一步探討。
Ang-2能與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的Tie-2受體相結(jié)合,導(dǎo)致血管失穩(wěn)、增加血管滲漏、上調(diào)內(nèi)皮對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的反應(yīng),從而引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,連續(xù)性破壞。本研究Western Blot和RT-PCR結(jié)果顯示,ALI對(duì)照組和TRALI模型組Ang-2表達(dá)較NS對(duì)照組和LPS對(duì)照組明顯升高。也有資料顯示TRALI模型組大鼠血漿Ang-2表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組[25];Gallagher等[26]發(fā)現(xiàn)Ang-2是肺損傷時(shí)內(nèi)皮屏障破壞的重要細(xì)胞因子,體外應(yīng)用患者血漿可破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障,且破壞程度與血漿Ang-2水平相關(guān);體外單獨(dú)應(yīng)用重組Ang-2也可破壞內(nèi)皮屏障功能和結(jié)構(gòu),過(guò)度增高的Ang-2水平可增加肺泡通透性。Ang-2基因敲除的大鼠可以避免高氧所致的ALI[6],由此可以推測(cè),肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能參與了TRALI的病理生理過(guò)程。
綜上所述,通過(guò)“LPS-血漿二次打擊”的方法建立TRALI模型,大鼠血漿Ang-2蛋白表達(dá)和肺組織Ang-2基因表達(dá)增高,免疫組化發(fā)現(xiàn)肺泡腔和血管及小氣道周?chē)装Y區(qū)有大量Ang-2在PMN和巨噬細(xì)胞表達(dá),同時(shí)炎癥附著區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Ang-2增強(qiáng),說(shuō)明Ang-2可能參與了TRALI的病理生理過(guò)程,但其在TRALI發(fā)病過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。
1 Eder AF, Dy BA, Perez JM, et al. The residual risk of transfusionrelated acute lung injury at the American Red Cross (2008-2011):limitations of a predominantly male-donor plasma mitigation strategy . Transfusion,2013,53:1442-1449.
2 廖刃,劉進(jìn).圍手術(shù)期血液管理:由限制性輸血走向個(gè)體化輸血.中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94:481-482.
3 El Kenz H, Van der Linden P. Transfusion-related acute lung injury. Eur J Anaesthesiol,2014 ,31:345-350.
4 劉明華,田君,陳翔宇,等.多發(fā)傷患者早期促血管生成素-2的變化及臨床意義.中華創(chuàng)傷雜志,2010,26:328-331.
5 Orfanos SE, Kotanidou A, Glynos C, et al. Angiopoietin-2 is increased in severe sepsis: correlation with inflammatory mediators. Crit Care Med,2007,35:199-206.
6 Bhandari V, Choo-Wing R, Lee CG, et al. Hyperoxia causes angiopoietin 2-mediated acute lung injury and necrotic cell death . Nat Med,2006,12:1286-1293.
7 陶一帆,田方敏,郭向陽(yáng),等.不同劑量脂多糖在不同作用時(shí)間下誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的效果評(píng)價(jià).中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2015,22:142-146.
8 李麗瑋,花紫菱,張惠箴,等.輸血相關(guān)急性肺損傷大鼠模型建立及肺組織病理研究.中國(guó)輸血雜志,2012,25:1121-1124.
9 Kelher MR, Masuno T, Moore EE, et al. Plasma from stored packed red blood cells and MHC class I antibodies causes acute lung injury in a 2-event in vivo rat model. Blood,2009,113:2079-2087.
10 Silliman CC. The two-event model of transfusion-related acute lung injury. Crit Care Med,2006,34:S124-131.
11 Mikawa K, Nishina K, Takao Y, et al. ONO-1714, a nitric oxide synthase inhibitor, attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits. Anesth Analg,2003,97:1751-1755.
12 Looney MR, Roubinian N, Gajic O, et al. Prospective study on the clinical course and outcomes in transfusion-related acute lung injury. Crit Care Med,2014,42:1676-1687.
13 俞蕾,翁文浩,施惠蘭,等.中性粒細(xì)胞VCS參數(shù)在呼吸系統(tǒng)細(xì)菌感染性疾病中的變化及臨床應(yīng)用.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志,2012,4:39-42.
14 Takahashi D, Fujihara M, Azuma H, et al. Stimulation of human neutrophils with sera containing HLA Class I alloantibody causes preferential degranulation of azurophilic granules and secretory vesicles. Vox Sang,2010,98:560-566.
15 West FB, Silliman CC. Transfusion-related acute lung injury:advances in understanding the role of proinflammatory mediators in its genesis. Expert Rev Hematol,2013,6:265-276.
16 Sayah DM, Looney MR, Toy P. Transfusion reactions: newer concepts on the pathophysiology, incidence, treatment, and prevention of transfusion-related acute lung injury. Crit Care Clin,2012,28:363-372.
17 Silliman CC, Bercovitz RS, Khan SY, et al. Antibodies to the HLA-A2 antigen prime neutrophils and serve as the second event in an in vitro model of transfusion-related acute lung injury. Vox Sang,2014,107:76-82.
18 李瑋,謝如鋒,范華驊.中性粒細(xì)胞在輸血相關(guān)的急性肺損傷中的作用.中國(guó)輸血雜志,2012,25:1335-1338.
19 張如愿,湯耀卿.血管生成素2在膿毒癥和急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中的作用.中華危重病急救醫(yī)學(xué),2009,21:638-640.
20 鐘明媚,張琳,王璠,等.急性呼吸窘迫綜合征患者血漿血管生成素2水平及其對(duì)預(yù)后的診斷價(jià)值.中華危重病急救醫(yī)學(xué),2014,26:804-809.
21 齊志江,李志,郝東,等.血管生成素2在EV71感染性肺水腫中的作用研究.中華危重病急救醫(yī)學(xué),2014,26:89-93.
22 齊志江,王曉芝,韓兆東,等.大鼠急性肺損傷時(shí)Ang-2/Tie-2的表達(dá)及意義.中國(guó)病理生理雜志,2010,26:314-317.
23 Fiedler U, Reiss Y, Scharpfenecker M, et al. Angiopoietin-2 sensitizes endothelial cells to TNF-alpha and has a crucial role in the induction of inflammation. Nat Med,2006,12:235-239.
24 Lemieux C, Maliba R, Favier J, et al. Angiopoietins can directly activate endothelial cells and neutrophils to promote proinflammatory responses. Blood,2005,105:1523-1530.
25 李麗瑋,李志強(qiáng).輸血相關(guān)急性肺損傷SD大鼠血管生成素2和白介素10的變化.中國(guó)輸血雜志,2013,26:439-442.
26 Gallagher DC, Bhatt RS, Parikh SM, et al. Angiopoietin 2 is a potential mediator of high-dose interleukin 2-induced vascular leak. Clin Cancer Res,2007,13:2115-2120.
(本文編輯:邸美仙)
Expression of angiopoietin-2 in plasma and lung tissue of rats with transfusion-related acute lung injury
GONG Yan-jie, WEI Ming, TU Ling, LIU Jia, LIANG Ying-hong, ZHANG Yi-hua, YANG Lu. Department of Transfusion, the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China
Objective To study the expression of angiopoietin-2 (Ang-2) in plasma and lung tissue of rats with transfusion-related acute lung injury (TRALI) and its significance. Methods Sixty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into normal saline (NS) control group, lipopolysaccharide (LPS) control group, TRALI model group, and acute lung injury (ALI) control group, with 15 rats in each group. The rat model of TRALI was reproduced by "LPS-plasma two-hit" method. The rats in NS control group were intraperitoneally injected 2 mL NS, the same volume of NS was intravenously injected after 1 mL blood collection. The rats in LPS control group were intraperitoneally injected 2 mg/kg LPS 1 mL within 1 minute, and the same volume of NS was intravenously injected 2 hours later. The rats in TRALI modelgroup were challenged by intraperitoneal injection of 2 mg/kg LPS 1 mL at 2 hours before the transfusion of 1 mL plasma. The rats in ALI control group were challenged by intraperitoneal injection of LPS 5 mg/kg to reproduce the model of ALI. The lung tissues were harvested to observe the pathological changes, and lung injury score was evaluated. The total cells and neutrophils (NEUT) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined. Western Blot was used to detect Ang-2 protein expression in plasma, and immunohistochemical method was used to detect Ang-2 positive expression in lung tissue. The real-time fluorescent reverse transcription-quantitative polymerase chain (RT-PCR) was used to detect Ang-2 mRNA expression in the lung tissue. Results Under the light microscope, rat lung tissue structure in the NS control group was clear, the alveolar wall was intact, no alveolar exudate, alveolar collapse or inflammatory cells in alveolar septum was found, and alveolar septum did not increase. The alveolar septum was widened slightly in LPS control group, a small amount of inflammatory cell infiltration was found. The alveolar septum, moderate bleeding and more infiltration of inflammatory cells were found in TRALI model group. Lung inflammatory infiltration, interstitial edema, hemorrhage, micro-thrombosis and focal atelectasis were found in the ALI control group. Compared with NS control group and LPS control group, Ang-2 protein expression in plasma and Ang-2 mRNA expression in the lung tissue were significantly increased in ALI control group and TRALI model group [Ang-2 protein (gray ralue): 0.58±0.09, 0.43±0.07 vs. 0.12±0.03, 0.20±0.05, Ang-2 mRNA (2-ΔΔCt): 0.39±0.10, 0.29±0.09 vs. 0.10±0.05, 0.16±0.04, P all < 0.01]. The total cells [total cells (×106/L: 361±78, 310±76 vs. 101±63, 165±65) and NEUT (0.396±0.125, 0.335±0.115 vs. 0.098±0.035, 0.114±0.041)] in BALF of ALI control group and TRALI model group were significantly higher than those of NS control group and LPS control group (P all < 0.05). The pathological score, wet lung weight/body weight ratio and arterial partial pressure of oxygen (PaO2) in ALI control group and TRALI model group were significantly higher than those of NS control group and LPS control group (P all < 0.05). There were no significant differences in above parameters between ALI control group and TRALI model group (P all > 0.05). Conclusions Expression of Ang-2 in the lung tissue and plasma were increased in rats with TRALI. Ang-2 may be involved in the TRALI pathophysiological process.
Transfusion-related acute lung injury; Angiopoietin-2; Lipopolysaccharide; Plasma
450052 鄭州市,鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院輸血科
魏明,Email:gushiweiming@126.com
10.3969/j.issn.1674-7151.2016.03.015
2016-04-20)