真菌葡聚糖檢測對血液惡性腫瘤患者早期深部真菌感染的診斷效能

李睿 任然 熊大遷

臨床研究

真菌葡聚糖檢測對血液惡性腫瘤患者早期深部真菌感染的診斷效能

李睿 任然 熊大遷

目的 探討血漿（1，3）-β-D-葡聚糖檢測在早期診斷血液惡性腫瘤患者侵襲性真菌?。↖FD）中的價(jià)值。方法 選擇成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2014年10月年至2016年4月收治的非粒細(xì)胞缺乏血液惡性腫瘤患者進(jìn)行篩選分組。確診血液惡性腫瘤患者160例，其中80例確診侵襲性真菌感染者為IFD組，非IFD患者80例。采用MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)測定IFD組和非IFD患者血漿（1，3）-β-D-葡聚糖含量，采用受試者工作特征曲線（ROC）評估G試驗(yàn)對IFD的診斷價(jià)值。結(jié)合真菌培養(yǎng)鑒定，統(tǒng)計(jì)不同類型真菌引起的深部感染（1，3）-β-D-葡聚糖水平的差異。結(jié)果 IFD組（1，3）-β-D-葡聚糖含量顯著高于非IFD組（ng/L： 346.54±204.95比43.21±15.11，P ＜ 0.05）。G試驗(yàn)單獨(dú)診斷IFD的ROC曲線下面積（AUC）、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為0.91、86.71%、90.47%；針對血液惡性腫瘤IFD患者，最佳診斷閾值為≥70 ng/L時(shí)，診斷敏感度為90%，特異度為88.75%。G試驗(yàn)診斷IFD的時(shí)間較傳統(tǒng)臨床診斷明顯縮短（d：4.87±2.55比7.13±4.42，P ＜ 0.01）。80例IFD患者40例分離出真菌，其中念珠菌屬36株（占90%），（1，3）-β-D-葡聚糖均值為333.55 ng/L；曲霉菌4株（占10%），（1，3）-β-D-葡聚糖均值＞ 1 000 ng/L。不同念珠菌之間（1，3）-β-D-葡聚糖水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），念珠菌屬與曲霉菌屬之間（1，3）-β-D-葡聚糖水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。結(jié)論 （1，3）-β-D-葡聚糖檢測是一種快速、準(zhǔn)確、簡便的診斷IFD方法，對于IFD的早期診斷有重要價(jià)值，對于區(qū)分念珠菌還是曲霉菌引發(fā)的深部真菌感染也有一定臨床價(jià)值。

（1，3）-β-D-葡聚糖；血液腫瘤??；侵襲性真菌感染；真菌培養(yǎng)

血液病患者常因大劑量化療、骨髓干細(xì)胞移植和免疫抑制劑的使用導(dǎo)致侵襲性真菌感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高，侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD）是惡性血液病、慢性阻塞性肺疾病［1］、肝移植［2］患者的常見并發(fā)癥。IFD確診主要依賴于無菌標(biāo)本真菌培養(yǎng)陽性，或組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)有真菌菌絲或孢子，組織病理陽性是診斷IFD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但組織標(biāo)本往往取材困難，且具有創(chuàng)傷性，標(biāo)本又需要特殊染色，延誤了患者的診斷和治療。北京協(xié)和醫(yī)院對3 447例患者進(jìn)行尸檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)深部真菌感染85例，其中生前明確真菌感染診斷者僅5例，占5.9%，漏檢率高達(dá)94.1%［3］。

IFD常見的臨床類型為系統(tǒng)性念珠菌病和肺曲霉菌病，病原體分別是念珠菌屬和曲霉菌屬，（1，3）-β-D-葡聚糖是其相似的細(xì)胞壁成分。真菌進(jìn)入血液或深部組織，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬和消化等作用后，（1，3）-β-D-葡聚糖可從真菌細(xì)胞壁釋放，從而使血中的含量升高，因此，檢測人體體液中（1，3）-β-D-葡聚糖水平（G試驗(yàn)）可為臨床診斷侵襲性真菌感染提供有效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本研究聯(lián)合真菌培養(yǎng)鑒定，系統(tǒng)分析了G試驗(yàn)在非粒細(xì)胞缺乏血液惡性腫瘤患者IFD診斷中的價(jià)值，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑 北京金山川公司MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)，GKT-1M Set動態(tài)真菌檢測試劑盒，法國梅里埃生物制品公司沙保葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，VITEK-2 Compact全自動微生物分析儀YST鑒定卡。

1.2 病例資料的選擇 選擇本院血液科2014年10月至2016年4月收治的160例血液惡性腫瘤患者，參照中國IFD工作組制定的《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（第三次修訂）》［4］，診斷為IFD患者80例，非IFD患者80例。以患者發(fā)熱（體溫＞ 38.5 ℃）作為確診IFD的研究起點(diǎn)。

1.3 研究方法

1.3.1 G試驗(yàn) 血漿（1，3）-β-D-葡聚糖檢測采用MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以試劑盒推薦的診斷值＞ 60 ng/L判定為G試驗(yàn)陽性。

1.3.2 真菌培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn) IFD患者入組時(shí)留取血液、痰液、尿液、糞便、膿液、積液等標(biāo)本進(jìn)行真菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。將所有培養(yǎng)物接種于沙保弱培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。白色念珠菌、熱帶假絲酵母菌、克柔念珠菌轉(zhuǎn)種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定，其余酵母樣真菌鑒定采用VITEK-2 Compact YST鑒定卡進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株為白假絲酵母菌ATCC14053。

1.3.3 檢測指標(biāo) 觀察IFD組和非IFD組G試驗(yàn)測定值的差異及G試驗(yàn)和傳統(tǒng)診斷方法診斷IFD陽性的患者數(shù)；繪制受試者工作特征曲線（ROC），分析G試驗(yàn)診斷IFD的價(jià)值；比較G試驗(yàn)和傳統(tǒng)臨床方法診斷IFD的時(shí)間差異；分析血液惡性腫瘤IFD患者真菌培養(yǎng)情況及不同真菌種類（1，3）-β-D-葡聚糖含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制ROC曲線，分析G試驗(yàn)診斷IFD的價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 G試驗(yàn)和傳統(tǒng)臨床診斷方法結(jié)果比較在160例血液惡性腫瘤患者中，G試驗(yàn)陽性83例，陰性77例。IFD組G試驗(yàn)測定值明顯高于非IFD組（ng/L：346.54±204.95比43.21±15.11，P ＜ 0.05）。傳統(tǒng)臨床診斷為IFD患者中72例G試驗(yàn)陽性，8例陰性；非IFD患者中11例G試驗(yàn)陽性，69例陰性。見表1。

表1 G試驗(yàn)和傳統(tǒng)臨床診斷方法結(jié)果比較

2.2 G試驗(yàn)對血液惡性腫瘤患者IFD的診斷價(jià)值 單獨(dú)G試驗(yàn)對血液惡性腫瘤患者IFD診斷的ROC曲線下面積（AUC）為0.91，陽性預(yù)測值為86.71%，陰性預(yù)測值為90.47%。取≥40 ng/L為診斷閾值時(shí)敏感度為91.25%〔95%可信區(qū)間（95%CI） = 82.80%～96.41%〕、特異度為55%（95%CI = 43.47%～66.15%）；取≥60 ng/L為診斷閾值時(shí)敏感度為90%（95%CI = 81.24%～95.58%）、特異度為85%（95%CI = 75.26%～92%）；取≥70 ng/L為診斷閾值時(shí)敏感度為90%（95%CI = 81.24%～95.58%）、特異度為88.75%（95%CI =79.72%～94.72%）；取≥80 ng/L為診斷閾值時(shí)敏感度為86.25%（95%CI = 76.73%～92.93%）、特異度為90%（95%CI = 81.24%～95.58%）。G試驗(yàn)診斷血液惡性腫瘤患者IFD的ROC曲線見圖1。

圖1 G試驗(yàn)診斷血液惡性腫瘤IFD的ROC曲線

2.3 G試驗(yàn)和傳統(tǒng)臨床診斷的時(shí)間差異 G試驗(yàn)陽性作為診斷指標(biāo)較傳統(tǒng)臨床診斷可有效縮短IFD的診斷時(shí)間（d：4.87±2.55比7.13±4.42，P ＜ 0.01）。見圖2。

圖2 G試驗(yàn)和傳統(tǒng)臨床診斷IFD的時(shí)間差異

2.4 血液惡性腫瘤IFD患者真菌培養(yǎng)結(jié)果 80例IFD患者中40例真菌培養(yǎng)陽性，陽性標(biāo)本來源于痰液33例，尿液5例，血液2例。40例陽性標(biāo)本中，分離出念珠菌屬36例，曲霉菌4例。念珠菌屬（1，3）-β-D-葡聚糖含量均值為333.55 ng/L，曲霉菌屬（1，3）-β-D-葡聚糖含量均值＞ 1 000 ng/L。不同念珠菌、不同曲霉菌之間（1，3）-β-D-葡聚糖含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），念珠菌屬與曲霉菌屬之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表2。

表2 血液惡性腫瘤IFD患者分離出的真菌種類、數(shù)量及不同種類真菌（1，3）-β-D-葡聚糖含量比較

3 討論

IFD發(fā)病快、病情重、病死率高，是血液病患者死亡的主要原因之一，由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室病原體的培養(yǎng)陽性率低、所需時(shí)間長、影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，導(dǎo)致IFD早期診斷困難，抗真菌治療不及時(shí)是目前IFD病死率較高的主要原因，作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的組織病理學(xué)和深部組織培養(yǎng)由于具有創(chuàng)性，在血小板減少和凝血功能異常及其他類型的危重患者并不適用。

（1，3）-β-D-葡聚糖是酵母和絲狀真菌細(xì)胞壁的多聚糖成分，真菌進(jìn)入血液或深部組織，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬和消化等作用后，（1，3）-β-D-葡聚糖可從真菌細(xì)胞壁釋放，從而使血液中的含量升高［5-10］。既往研究也表明，檢測血清（1，3）-β-D-葡聚糖含量確實(shí)能夠反映患者深部真菌感染情況，且SLP真菌檢測試劑盒測得（1，3）-β-D-葡聚糖含量較傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)法更加簡便、快速，靈敏度高，可用于深部真菌感染的早期快速診斷［11］，但G試驗(yàn)敏感度和特異度的不同與實(shí)驗(yàn)室設(shè)定的閾值有關(guān)，不同實(shí)驗(yàn)室、不同方法導(dǎo)致對于侵襲性真菌感染診斷的截?cái)嘀?、敏感度、特異度不同。韓世權(quán)等［12］一項(xiàng)前瞻性觀察性研究通過評估不同G試驗(yàn)臨界值對侵襲性真菌感染的診斷價(jià)值，并比較G試驗(yàn)、真菌培養(yǎng)與臨床診斷3種方法診斷侵襲性真菌感染的差異，結(jié)果顯示，G試驗(yàn)可作為早期診斷侵襲性真菌感染有效的檢測手段，以20 ng/L為臨界值時(shí)，其診斷侵襲性真菌感染的敏感度、特異度最高，分別為79.8%、87.9%，約登指數(shù)最大（為67.7%），且治療過程中患者在G試驗(yàn)前后輸注白蛋白并不影響G試驗(yàn)的檢測結(jié)果。然而，針對G試驗(yàn)閾值有＜ 10 ng/L和＞ 20 ng/L，＜ 60 ng/L和＞ 100 ng/L，＜ 100.5 ng/L和＞ 151.5 ng/L，＜ 159 ng/L和＞ 259 ng/L，比較混亂，故其設(shè)定仍有一定爭議［13-15］。

本研究用MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)，分別比較閾值為40、60、70、80 ng/L時(shí)診斷非粒細(xì)胞缺乏血液惡性腫瘤IFD的敏感度和特異度。通過對ROC曲線的分析發(fā)現(xiàn)，以70 ng/L為閾值時(shí)，AUC最大，敏感度為90%，特異度為88.75%；因?yàn)镚試驗(yàn)的陰性預(yù)測值較高，故多次G試驗(yàn)陰性結(jié)果基本可以排除IFD的可能。但因?yàn)槠涓蓴_因素較多，存在假陽性的可能。分析可能的原因有：香菇多糖類抗腫瘤藥物的使用；靜脈輸注血液制品，如白蛋白、免疫球蛋白、凝集因子等；鏈球菌引起的膿毒癥：化療引起的腸道黏膜受損，導(dǎo)致食物中葡聚糖成分進(jìn)入血液等［4，7］。同時(shí)本研究表明，傳統(tǒng)臨床診斷IFD的時(shí)間較G試驗(yàn)明顯延長，故G試驗(yàn)為IFD早期診斷贏得了寶貴的時(shí)間。真菌培養(yǎng)結(jié)果表明：血液惡性腫瘤IFD患者感染酵母樣真菌仍以白色念珠菌為主，但其比例較之前文獻(xiàn)報(bào)道的65%有所下降，其余非白色念珠菌所占比例有所上升，念珠菌感染種類也有所增加。原因可能為熱帶念珠菌有生成假菌絲及菌絲的能力，對細(xì)菌宿主的侵襲力更強(qiáng)大，可形成成熟的生物膜結(jié)構(gòu)，更易發(fā)生在癌癥患者中。

光滑念珠菌雖然致病性和毒性均不及白色念珠菌，但其對唑類抗真菌藥物存在天然耐藥或獲得性耐藥，可能導(dǎo)致檢出率逐年升高，這與藥物的選擇機(jī)制有關(guān)。曲霉菌感染也較之前文獻(xiàn)報(bào)道的5.9%上升。本研究結(jié)果還表明，不同種類真菌G試驗(yàn)測定值也有差異，如念珠菌感染者血清（1，3）-β-D-葡聚糖的含量均值為333.55 ng/L，曲霉菌感染者血清（1，3）-β-D-葡聚糖的含量＞ 1 000 ng/L。但也有個(gè)別念珠菌感染患者血清（1，3）-β-D-葡聚糖含量＞ 1 000 ng/L，可能與感染嚴(yán)重程度有關(guān)。故如患者血清（1，3）-β-D-葡聚糖為70～1 000 ng/L，念珠菌致感染的可能性較大；而血清（1，3）-β-D-葡聚糖含量＞ 1 000 ng/L時(shí)，曲霉菌引起感染的可能性較大［13-14］。

總之，G試驗(yàn)對診斷非粒細(xì)胞缺乏性血液惡性腫瘤患者IFD有著較高的敏感度、特異度，也可以縮短診斷時(shí)間，為臨床早期診斷、治療贏得了寶貴時(shí)間，對改善患者預(yù)后和降低病死率起到重要作用，對區(qū)分是念珠菌屬還是曲霉菌屬引起的感染也有一定鑒別作用，對多次檢測陰性結(jié)果的患者也能基本排除IFD的診斷，避免過度使用抗真菌藥物，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

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（本文編輯：邸美仙）

Clinical efficacy of fungal glucan detection for early diagnosis of invasive fungal infections in patients with hematological malignance

LI Rui, REN Ran, XIONG Da-qian. Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China

Objective To discuss the value of plasma (1, 3)-β-D-glucan detection in the early diagnosis in invasive fungal disease (IFD) patients with hematological malignance. Methods The hospitalized patients with hematological malignance without neutropenia admitted to Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine from October 2014 to April 2016 were enrolled. 160 hematological malignance patients were divided into different groups, 80 patients with invasive fungal, 80 patients with non-invasive fungal. Dynamic rapid microbial detection system MB-80 was used to detect plasma (1, 3)-β-D-glucan content, and the value of G test in the diagnosis of IFD was analyzed by receiver operating characteristic curve (ROC). Combined with fungal culture identified, the difference of (1, 3)-β-D-glucan from various types of fungi induced deep infection was analyzed. Results The content of (1, 3)-β-D-glucan of IFD infected group was significantly higher than that of non-IFD infected group (ng/L: 346.54±204.95 vs. 43.21±15.11, P ＜ 0.05). In G test, the area under ROC curve (AUC) for IFD diagnosis was 0.91, positive predictive value was 86.71%, and negative predictive values was 90.47%. For patients with hematologic malignancies IFD, optimal diagnostic threshold was greater or equal to 70 ng/L, the diagnostic sensitivity was 90% and specificity was 88.75%, G test positive time for IFD diagnosis was significantly shorter than that of traditional diagnostic criteria (days: 4.87±2.55 vs. 7.13±4.42, P ＜ 0.01). Fungi was isolated from 40 patients, in which 36 were Candida, accounted for 90%, and (1, 3)-β-D-glucan mean was 333.55 ng/L; and 4 were Aspergillus, accountedfor 10%, and mean (1, 3)-β-D-glucan was greater than 1 000 ng/L. No significant difference was shown in (1, 3)-β-D-glucan among different Candida (P ＞ 0.05), but there was significant difference between Candida and Aspergillus groups (P ＜ 0.05). Conclusions (1, 3)-β-D-glucan detection is a fast, accurate and simple method of diagnosing IFD for early diagnosis of IFD. And it has clinical value for distinguishing Candida or Aspergillus caused deep fungal infection.

(1, 3)-β-D-glucan; Hematological malignance; Invasive fungal disease; Fungal culture

610075 成都市，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

熊大遷，Email：705006714@qq.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2016.03.005

2016-07-14）