短小芽胞桿菌HLK8-1的分離鑒定及抑菌特性分析

趙彩春， 陳國明， 張家學

(廣東海大集團股份有限公司，廣東 廣州 511400)

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短小芽胞桿菌HLK8-1的分離鑒定及抑菌特性分析

趙彩春， 陳國明， 張家學

(廣東海大集團股份有限公司，廣東 廣州 511400)

從海南翁田鎮(zhèn)凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖場篩選獲得1株能抑制副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)等多種病原菌的芽胞桿菌HLK8-1。經形態(tài)特征分析、16S rDNA序列分析及Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)鑒定為短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)；菌株生長及抑菌性能研究表明該菌株抑菌物質主要產生在生長對數(shù)期及平臺期；相對于鹽度及初始pH等因素，該菌株的抑菌性能受溫度影響較大；菌株在pH值范圍為7.0～8.5，鹽度范圍為0～0.2%，溫度為30 ℃等條件下表現(xiàn)出較高的生長水平及抑菌性能；共培養(yǎng)試驗表明該菌能將水體中的副溶血弧菌數(shù)量控制在較低水平，培養(yǎng)24 h時實驗組105cfu/mL，而對照組108cfu/mL。該菌抑制多種水產病原菌，對水體環(huán)境耐受能力強，具有防治水產養(yǎng)殖病原菌的應用潛力，且易于培養(yǎng)，抑菌物質分泌到胞外便于分離提取，亦具有發(fā)酵工程應用潛力。

短小芽胞桿菌；副溶血弧菌；16S rDNA；抑菌活性

近年來，弧菌病害頻發(fā)，嚴重制約了水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。自 2009 年以來, 凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)急性肝胰腺壞死綜合征 (acute hepato-pancreas necrosis syndrome, AHPNS)或早期死亡綜合征 (early mortality syndrome, EMS)在亞洲地區(qū)暴發(fā)并蔓延, 造成養(yǎng)殖對蝦大量死亡[2]。EMS致病原因于2013年5月被確定為特定類型的副溶血弧菌感染,并將此病改名為急性肝胰腺壞死病(acute hepato-pancreas necrosis disease, AHPND)[3]。副溶血弧菌是一種廣泛分布于自然海區(qū)的條件性致病菌，是對蝦中一種常見重要的病原菌，也可引起人和魚、蟹、貝等水產養(yǎng)殖動物感染發(fā)病[4-5]。添加抗生素是目前治療細菌疾病的主要手段，但長期使用會產生病原菌的耐藥性及藥物殘留，危及人類健康[6]。鑒于此，以微生態(tài)制劑為代表的生防技術已成為水產科研工作者的研究熱點。芽胞桿菌是目前應用最廣泛的水產微生態(tài)制劑菌種之一，其在生長代謝過程中能分泌抑菌物質，這些抑菌物質大多為低分子抗生素以及蛋白或多肽類化合物[7]，可以幫助降低環(huán)境中病原菌數(shù)量，減少養(yǎng)殖動物病害危險。而且這些物質具有無毒、無殘留、無污染、抗菌性強、穩(wěn)定性好等自身優(yōu)勢[8-9]。目前報道的生防類芽胞桿菌主要是陸源的及用在陸生動植物病害防治方面[10]，而用于防治水產動物病害的研究相對較少[11]。本研究報道了1株篩選自凡納濱對蝦養(yǎng)殖場、能抑制副溶血弧菌等多種水產病原菌的芽胞桿菌，對菌株進行菌種鑒定，并對其生長特性及抑菌物質分泌特性進行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 菌株HLK8-1分離自海南翁田對蝦養(yǎng)殖場水體。病原指示菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、 嗜 水 氣 單 胞 菌(Aeromonashydrophila)均購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①菌株保存用營養(yǎng)瓊脂(NA)斜面(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉3.0，氯化鈉5.0，瓊脂15.0，pH (7.3±0.1)；②抑菌活性測定用補充添加5 g/L 氯化鈉的胰蛋白大豆瓊脂(TSA)(g/L)：胰蛋白胨15.0，大豆蛋白胨5.0，氯化鈉10.0，瓊脂15.0，pH (7.3±0.2)；③發(fā)酵培養(yǎng)用胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，購自美國BD；④副溶血弧菌活菌計數(shù)用TCBS培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與分離 取養(yǎng)蝦塘水體，80 ℃水浴處理15 min后稀釋涂布TSA平板，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，通過點種法初步篩選出有顯著抑菌效果的菌落[12]。將初篩得到的菌落反復劃線純化，接種至TSB培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)18～24 h，取菌液1 000 r/min離心10 min收集上清液；通過平板擴散法[13]，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑(本文所有試驗均取2 mL菌液離心取上清，打孔器孔徑為6 mm，加液量為30 μL/孔)，復篩出目標菌株。

1.2.2 菌株的鑒定 ①菌株培養(yǎng)特征：將菌株劃線至TSA平板上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)特征。②細菌生理生化鑒定：將培養(yǎng)18 h的HLK8-1菌株，用無菌接種棒接種于空管中，加入GN/GP-IF-A接種液制備成懸液，比濁調節(jié)至濁度(28±3)%，加入到NP微孔板中，加液量為100 μL/孔，30 ℃培養(yǎng)16～24 h,在Biolog GEN III上讀結果[14]。③分子生物學鑒定：將菌株HLK8-1在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集菌體，用細菌DNA提取試劑盒提取細菌總DNA。根據(jù)細菌16S rDNA基因保守序列引物:F1：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC- 3′，反R1：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′進行PCR擴增。擴增條件： 94 ℃預變性3 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，PCR產物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物經純化后，直接在ABI PRISMTM 377全自動DNA測序儀上進行測序。所測序列與GenBank中序列進行Blast比對，并從中選取部分相關的16S rDNA序列，采用ClustalX1.8軟件進行多序列匹配排列，用Mega 5.0采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)進行系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析(Bootstrap)進行置信度檢測，自舉數(shù)集1 000次。

1.2.3 細菌生長及抑菌性能分析 探索細菌生長及抑菌活性相關規(guī)律以及溫度、鹽度、pH等因素對細菌生長和抑菌物質分泌的影響。通過檢測菌液濃度A600及抑菌圈直徑來分析菌株生長情況及抑菌物質分泌情況。

1.2.4 高溫及紫外線處理對細菌分泌到胞外的抑菌物質活性的影響 取18～24 h的菌株培養(yǎng)液，10 000 r/min高速離心15 min，取上清液，分別進行高溫處理、紫外照射處理，以副溶血弧菌為指示菌，初步判斷這些處理對細菌抑菌物質活性的影響。

1.2.5 菌株與副溶血弧菌共培養(yǎng)試驗 將TSB中培養(yǎng)18～24 h的HLK8-1菌液和副溶血弧菌菌液分別至調節(jié)A600一致，用生理鹽水再將HLK8-1菌液稀釋100倍備用。取2組250 mL錐形瓶，每瓶裝有經高壓滅菌過的養(yǎng)殖池塘水(補充NaCl至鹽度為10‰)100 mL，實驗組同時接種備用的副溶血弧菌液及HLK8-1菌液各0.5 mL，對照組只接種副溶血弧菌菌液0.5 mL，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，分別在0、24、36、48 h取樣稀釋涂布于TCBS平板上30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h記錄副溶血弧菌數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 菌株HLK8-1的抑菌特性

經過初篩、復篩分離篩選到HLK8-1，其發(fā)酵上清對副溶血弧菌、哈氏弧菌、嗜水氣單胞菌都具有明顯的抑制作用(表1)。

2.2 細菌鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特征鑒定 TSA平板上培養(yǎng)24 h，菌落圓形，邊緣整齊，無光澤，乳白色或乳黃色，不透

明，有些菌落表面有同心圓輪紋微皺，有些菌落無輪紋；培養(yǎng)48 h，菌落表面褶皺加深，無光澤。革蘭染色鏡檢顯示菌體短桿狀，兩端鈍圓，革蘭陽性。

表1 菌株HLK8-1菌液上清液對不同病原菌的抑菌活性

Table 1 Inhibition activities of HLK8-1supernatant on different pathogens strains

菌株抑菌圈直徑/mm大腸埃希菌9．84±0．01嗜水氣單胞菌26．44±0．11副溶血弧菌15．16±0．21哈氏弧菌15．08±0．03

2.2.2 生理生化鑒定 Biolog 微生物鑒定系統(tǒng)方法根據(jù)菌株對碳源利用情況作出分析[7]，鑒定結果判定菌株HLK8-1為短小芽胞桿菌Bacilluspumilus。PROB 值為1，SIM值為0.764，DIST值為3.999，表明該鑒定結果是一個比較可靠的匹配結果，即菌株HLK8-1為短小芽胞桿菌(圖1)。

圖1 菌株HLK8-1 Biolog 生理生化鑒定結果

HLK8-1生理生化試驗結果顯示，菌株M.R試驗陰性，過氧化氫酶試驗陽性，不產淀粉酶產酪蛋白酶，產纖維素酶等(表2)。

表2 菌株HLK8-1生理生化特性

注:“+”表示陽性；“-”表示陰性

2.2.3 分子生物學鑒定 菌株16S rDNA擴增圖見圖2。在1 500 bp左右處顯示出一條特異性條帶，與目標條帶大小相符。

圖2 菌株HLK8-1 16S rDNA擴增片段瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 16S rDNA fragment of HLK8-1 by agarose gel electrophoresisM：Marker V；1：HLK8-1菌株16S rDNA擴增片段M:Marker V;1:16S rDNA fragment of HLK8-1

將擴增得到的基因片段回收測序，得到的序列用Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/balst)在GenBank中搜索比對結果顯示，該16S rDNA序列與短小芽胞桿菌Bacilluspumilusstrain B14的序列同源性為99.8%。以16S rDNA為基礎的HLK8-1系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果顯示，HLK8-1與短小芽胞桿菌Bacilluspumilus在同一分枝上，可靠度為100%(圖3)。

圖3 基于16S rDNA 序列分析的HLK8-1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株生長及抑菌性能分析

2.3.1 菌株生長與抑菌物質分泌之間的關系 細菌HLK8-1菌體生長隨培養(yǎng)時間呈現(xiàn)出基本微生物生長曲線規(guī)律，4 h以前細菌處于適應期，4～36 h處于對數(shù)生長期，菌體分裂快，菌液濃度迅速增長，36～56 h處于平臺期，菌液A600值基本處于穩(wěn)定，56 h后細菌開始進入衰敗期，菌液濃度逐漸減小(圖4)。

HLK8-1上清液抑菌活性顯示，在培養(yǎng)4 h時菌液上清液即顯示出抑菌效果，說明4 h即有抑菌物質分泌到外界環(huán)境中，隨后4～28 h抑菌性能緩慢增強，28～56 h抑菌物質分泌基本不再增加趨于穩(wěn)定，56 h后抑菌活性開始顯著減弱(圖4)。菌株的抑菌物質分泌曲線與細菌生長曲線基本保持一致，菌株的抑菌性能主要產生在生長對數(shù)期及平臺期。

圖4 培養(yǎng)時間對HLK8-1生長及抑菌物質分泌影響Fig.4 Effects of incubation time on growth and antibacterial substances production of HLK8-1

2.3.2 pH條件對菌株生長及抑菌物質分泌的影響 試驗結果顯示，HLK8-1在pH 5.5～9.5范圍內能良好生長，培養(yǎng)24 h菌液稀釋10倍后A600值均在0.6以上，說明HLK8-1菌株對酸堿環(huán)境良好的耐受性。pH偏酸性時，菌液濃度明顯低于中性及堿性條件下菌液濃度，pH 7.5～9.5菌液濃度均處于較高水平，HLK8-1菌株可能更喜好偏堿性環(huán)境，最適生長酸堿環(huán)境在pH 7.0～9.0之間。從菌株抑菌物質產生規(guī)律來看，不同pH條件下HLK8-1菌株分泌的抑菌物質活性并無顯著差異，抑菌圈直徑大小無顯著差異(圖5)。

圖5 pH 條件對菌株生長及抑菌物質分泌的影響

Fig.5 Effects of pH on growth and antibacterial substances production of HLK8-1

2.3.3 溫度條件對菌株生長及抑菌物質分泌影響 菌株HLK8-1在10 ℃不能生長，15 ℃可以生長，并且50 ℃高溫環(huán)境也可生長，但是50 ℃培養(yǎng)時上清液幾乎無抑菌特性，說明高溫條件下菌株雖然能維持生命繁殖，但抑菌物質分泌受到抑制，30 ℃是該菌株生長及抑菌物質產生的最佳溫度(圖6)。

圖6 溫度對菌株HLK8-1生長及抑菌物質分泌的影響Fig.6 Effects of temperature on growth and antibacterial substances production of HLK8-1

2.3.4 鹽度對菌株生長及抑菌物質分泌的影響 菌株HLK8-1能耐受70‰以內鹽度環(huán)境，菌株生長良好，培養(yǎng)24 h后的菌液稀釋10倍后A600值可達0.4以上，但是各鹽度條件下菌液上清液抑菌圈直徑卻基本穩(wěn)定在約10 mm((10.48±0.89) mm)(圖7)。說明在一定范圍內鹽度變化對菌株HLK8-1抑菌物質活性無顯著影響。

圖7 鹽度對菌株HLK8-1生長及抑菌物質分泌的影響

Fig.7 Effects of salinity on growth and antibacterial substances production of HLK8-1

2.4 高溫及紫外線對菌株抑菌物質活性的影響

2.4.1 高溫對抑菌物質活性影響 發(fā)酵液上清通過高溫水浴處理后檢測抑菌效果，結果表明高溫處理對上清液抑菌活性有明顯影響，80 ℃處理5 min后的上清液沒有顯示抑菌圈，100 ℃處理10 min后的上清液也沒有顯示抑菌圈。說明HLK8-1菌株產生的抑菌物質不耐高溫處理(表3)。

2.4.2 紫外照射對抑菌物質活性的影響 經過紫外燈(PHILIPS G8T5 TUV8W)距離30 cm照射1 h的發(fā)酵液上清抑菌圈直徑顯著減小(對照組15.44 mm, 紫外照射后9.71 mm)，表明抑菌物質對紫外線敏感(表3)。

表3 外界因子對菌株HLK8-1上清液抑菌活性影響結果表

Table 3 Effects of factors on inhibition activities of HLK8-1Bacterial supernatant

對照組紫外線照射1h80℃，10min100℃，5min抑菌圈直徑/mm15．44±0．159．71±0．2400

2.5 菌株HLK8-1與副溶血弧菌共培養(yǎng)實驗結果

從共培養(yǎng)實驗結果來看，對照組中病原菌迅速增長，24 h活菌量積累到108cfu/mL水平，但實驗組病原菌數(shù)量一直處于相對較低水平(最高僅達到105cfu/mL)，連續(xù)培養(yǎng)48 h，實驗組副溶血弧菌水平均顯著低于對照組(圖8)。表明菌株HLK8-1在養(yǎng)殖水體中能顯著抑制副溶血弧菌數(shù)量，使之處于相對較低水平。

圖8 菌株HLK8-1與副溶血弧菌共培養(yǎng)時副溶血弧菌數(shù)量的變化情況Fig.8 HLK8-1 inhibit the number of Vibrio parahaemolyticus in pond water

3 討 論

定期檢測弧菌，控制養(yǎng)殖過程中副溶血弧菌數(shù)量無疑是預防和控制AHPND的有效途徑之一。水產養(yǎng)殖中抗菌藥物的長期使用或濫用所引起的致病菌耐藥性、高殘留和環(huán)境污染問題日益嚴重[15]，而綠色、安全的益生菌微生態(tài)預防治療解決方式更受養(yǎng)殖戶青睞。從養(yǎng)殖環(huán)境中健康動物體內獲取拮抗菌是公認的提倡方法[16]。本試驗從凡納濱對蝦養(yǎng)殖場分離篩選到1株對副溶血弧菌有良好抗性的芽胞桿菌HLK8-1，經16S rDNA序列分析與Biolog全自動微生物鑒定儀及其他生理生化分析最終鑒定為短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)。

一般來說，細菌產生抗菌物質的含量與其生長條件密切相關[23]。菌株HLK8-1對環(huán)境適應性強，對鹽度、溫度、pH均具有廣泛適應性，表現(xiàn)出較高的生長性能及抑菌性能，表明該菌株對環(huán)境要求簡單。在滅菌池塘水中共培養(yǎng)結果顯示菌株能顯著抑制副溶血弧菌數(shù)量使其處于相對較低的水平。研究還發(fā)現(xiàn)HLK8-1具有產蛋白酶、產纖維素酶能力，這些特性功能使其具有水產養(yǎng)殖益生菌的應用潛力。另外，由于菌株的抑菌物質能分泌到胞外，分離簡單，適合擴大培養(yǎng)，因此可開展發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究，為發(fā)酵工程奠定基礎，為更合理高效利用菌株優(yōu)勢提供更多數(shù)據(jù)支持。

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Isolation, Identification & Antagonistic Characteristics ofBacilluspumilusHLK8-1

ZHAO Cai-chun, CHEN Guo-ming, ZHANG Jia-xue

(GuangdongHaidGroupCo.,Ltd,Guangzhou511400)

A bacterial strain HLK8-1 with inhibition ability against a wide variety of pathogens includingVibrioparahaemolyticuswas isolated from a prawn (Litopenaeusvannamei) farm pond in the town of Wengtian, Hainan Province. It was identified asBacilluspumilusby its morphological features, 16S rDNA sequence analysis, and through Biolog Microbes Identification system; Growth and antimicrobial performance study indicated that the strain secreted antimicrobial substances mainly in the logarithmic growth phase and plateau phase; The antimicrobial activity was relatively more affected by temperature rather than salinity and pH; The optimum culture conditions for high levels of growth and inhibition were at 30 ℃, pH 7.0～8.5, salinity 0～0.2%; Co-culture tests in pond water showed that the strain inhibited againstV.parahaemolyticusat fairly low level, when experimental group of the strain at 105cfu/mL along with control group 108cfu/mL cultured for 24 h. The strain can inhibit many aquatic pathogens and had tolerance to the aquacultural water environment, indicating its potential applications in aquaculture pathogen prevention; easy to culture and easy to obtain antimicrobial substance, indicating its potential applications in fermentation engineering.

Bacilluspumilus;Vibrioparahaemolyticus; 16S rDNA; inhibiton activity

趙彩春 女，碩士，工程師。研究方向為水產養(yǎng)殖病害控制。E-mail:zhaocaichun@163.com

2015-04-21；

2015-05-26

Q939.124

A

1005-7021(2016)02-0033-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.006