大鼠血漿中非諾貝特活性代謝物含量測定及藥代動力學研究

張媚媚，林 蔚，柳曉蕊，尹一子

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510095)

大鼠血漿中非諾貝特活性代謝物含量測定及藥代動力學研究

張媚媚，林 蔚，柳曉蕊，尹一子

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510095)

目的 建立測定非諾貝特在大鼠血漿中的活性代謝物非諾貝特酸含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 以乙腈沉淀蛋白、酮洛芬為內(nèi)標，采用Acclaim?120 C18柱，流動相為乙腈－0.2%磷酸溶液（50∶50），檢測波長為297 nm。結(jié)果 非諾貝特酸和酮洛芬保留時間為9.1，19.5 min；非諾貝特酸質(zhì)量濃度在0.02～100.00 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r＝0.999 4)；提取回收率在97.74% ～104.13%范圍內(nèi)，日內(nèi)和日間精密度的 RSD均小于7%(n＝5)，穩(wěn)定性試驗結(jié)果良好。結(jié)論 自制非諾貝特制劑在大鼠體內(nèi)的生物利用度遠高于非諾貝特原料藥，為臨床非諾貝特藥物檢測和體內(nèi)藥代動力學研究提供了有效的技術(shù)支持。

非諾貝特酸；高效液相色譜法；血藥濃度

非諾貝特是第2代苯氧芳酸類調(diào)血脂藥物，調(diào)脂作用確切，是降低三酰甘油（TG）的首選[1]。作為前藥，非諾貝特在體內(nèi)經(jīng)酯酶作用下，可迅速代謝成非諾貝特酸而起調(diào)血脂作用，具有明顯的降低血清總膽固醇（TC）、TG和升高高密度脂蛋白(HDL)的作用，適用于治療高三酰甘油血癥和高膽固醇血癥，療效優(yōu)于氯貝特，且不良反應較少[2]。非諾貝特的水溶性非常差，在水中幾乎不溶[3]，屬于生物藥劑分類中的第2類藥，溶解度低，滲透性高[4]。口服生物度低，直接影響了其臨床療效[5]。非諾貝特在體內(nèi)代謝為非諾貝特酸后，在血漿中檢測不到前者的原形[1]。為了解非諾貝特在大鼠體內(nèi)的藥代動力學過程，本研究中以酮洛芬為內(nèi)標[6]，建立了高效液相色譜(HPLC)法用作非諾貝特在大鼠體內(nèi)藥代動力學的研究方法，并對比了自制非諾貝特制劑與原料藥在大鼠體內(nèi)的生物利用度?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

UltiMate?3000 Basic Automated型高效液相色譜儀；Chromeleon 6.8色譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(Dionex Corporation Bannockburn IL USA)，包括四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱(Timberline Instruments，Inc.)；Denver TP－4101型電子天平(Denver Instrument)；Millipore Milli Q UV Plus型純凈水裝置 (American Instrument Exchange Inc.)；Microfuge?高速離心機(Beckman Coulter)；VX－100型渦旋混合器(National LabnetCo.，Inc.)。

1.2 試藥

非諾貝特(美國藥典標準，純度為99.8%，香港先進技術(shù)工業(yè)有限公司）；非諾貝特酸標準品（美國Biofine International＜Vancouver，BC＞公司）；酮洛芬標準品（美國Hawkins Pharmaceutical＜Minneapolis，MN＞公司）；乙腈、甲醇（美國FisherScientific＜FairLawn，NJ＞公司）。空白血漿(Fisher Scientific，F(xiàn)air Lawn，NJ)取自健康Wistar大鼠，由美國LAMPIRE Biological Laboratories(Pipersville，PA)公司提供。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 動物

Wistar大鼠，動物實驗符合動物實驗倫理會《實驗動物福利倫理原則》的要求，進行設(shè)計并開展，動物合格證編號為SYXK（粵）2010－0104，室溫下單獨飼養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 血藥濃度測定

2.1.1 色譜條件

預柱：Phenomenex C18柱(12.5 mm×4 mm，5 μm)；色譜柱：Acclaim?120 column C18柱(150 mm×4.6 mm，2.5 μm)；流動相：乙腈－0.2%磷酸溶液(50∶50)，用前經(jīng)過0.5 μm微孔濾膜過濾脫氣；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；在線脫氣；檢測波長：297 nm。

2.1.2 溶液配制

非諾貝特酸標準貯備液：經(jīng)過預試驗，血漿樣品中未出現(xiàn)非諾貝特的色譜峰。精密稱取非諾貝特酸10 mg，置10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量溶度為1 g／L的非諾貝特酸母液；將非諾貝特酸母液逐級用乙腈稀釋，得100，5，0.1 μg／mL的標準貯備液，－4℃冷藏備用。

內(nèi)標溶液：精密稱取酮洛芬標準品 8.0 mg，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為80 μg／mL的溶液，－4℃冷藏備用。

2.1.3 血漿樣品處理

取血漿100 μL，加入內(nèi)標酮洛芬溶液40 μL，混勻，加入乙腈 160 μL，渦旋混合2 min，10 000 r／min離心10 min，取上清液進樣20 μL，記錄色譜圖，見圖1。

2.1.4 方法學考察

專屬性試驗：取空白血漿100 μL，加入乙腈200 μL，按2.1.3項下方法操作，得空白血漿色譜圖(圖1 A)；配置含非諾貝特酸和內(nèi)標的空白血漿溶液，依法處理，得非諾貝特酸和內(nèi)標提取后的血漿標準品色譜圖(圖1 B)。可見，內(nèi)標和非諾貝特酸的保留時間分別為9.1 min和19.5 min，互不干擾出峰時間。結(jié)果表明，乙腈能夠去除血漿中大部分雜質(zhì)，不干擾色譜峰。擬訂色譜條件下內(nèi)標和非諾貝特酸方法專屬性良好，可用于大鼠血漿樣本中非諾貝特酸的測定。色譜圖見圖1。

絕對回收率：取空白血漿適量，制備低、中、高3個質(zhì)量濃度非諾貝特酸血漿樣品（質(zhì)量濃度分別為0.05，2.50，80.00 μg／mL）和僅含內(nèi)標（質(zhì)量濃度為80 μg／mL）的血漿樣品，按2.1.3項下方法操作，每個質(zhì)量濃度進行5樣品分析，獲得相應的峰面積為 A1。同時，以流動相代替血漿制備低、中、高3個質(zhì)量濃度的非諾貝特酸供試品溶液（質(zhì)量濃度分別為0.05，2.50，80.00 μg／mL）和內(nèi)標樣品溶液（質(zhì)量濃度為80.00 μg／mL），每個質(zhì)量濃度進行5樣品分析，獲得標準溶液色譜峰面積為 A0，以相應濃度的 A1／A0×100比值計算非諾貝特酸和內(nèi)標的回收率。結(jié)果見表1。結(jié)果表明，非諾貝特酸低、中、高質(zhì)量濃度及內(nèi)標的絕對回收率范圍為99.82%～105.50%，RSD＜5%(n＝5)，表明方法絕對回收率良好。

相對回收率：取空白血漿適量，制備低、中、高3個質(zhì)量濃度非諾貝特酸血漿樣品（質(zhì)量濃度分別為0.05，2.50，80.00 μg／mL），按2.1.3項下方法操作，每個質(zhì)量濃度進行5樣品分析，計算相對回收率，評價方法的準確度。結(jié)果表明，非諾貝特酸的平均相對回收率均為99.26%～100.15%，表明方法的準確度良好。結(jié)果見表2。

圖1 高效液相色譜圖

表1 非諾貝特酸和內(nèi)標在Wistar大鼠血漿中的絕對回收率(%，n＝5)

表2 非諾貝特酸在Wistar大鼠血漿中的相對回收率(n＝5)

線性關(guān)系考察：取非諾貝特酸標準貯備液適量，氮氣吹干，加入空白血漿100 μL，配制成相當于非諾貝特酸血漿質(zhì)量濃度為0.02，0.05，0.10，1.00，2.50，5.00，20.00，50.00，100.00 μg／mL的系列溶液，按2.1.3項下方法操作，每個質(zhì)量濃度進樣5次，進樣20 μL，記錄色譜圖。以非諾貝特酸與內(nèi)標酮洛芬質(zhì)量濃度比值（X）為橫坐標、非諾貝特酸與內(nèi)標酮洛芬峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權(quán)（W＝1／c2）最小二乘法進行回歸運算，得直線回歸方程，Y＝24.230 34 X＋0.001 8，r＝0.999 4(n＝9)。結(jié)果見表 3，表明非諾貝特酸質(zhì)量濃度在0.02～100.00μg／mL范圍內(nèi)與峰面積比值線性關(guān)系良好。

最低定量限確定：用標準貯備液系列配制成相當于非諾貝特酸血漿質(zhì)量濃度為0.02 μg／mL的供試品溶液，氮氣吹干，取空白血漿適量，按2.1.3項下方法操作，進行5樣品平行樣本分析，進樣20 μL。根據(jù)當天標準曲線計算每個樣本測得質(zhì)量濃度和相對偏差。結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法所測非諾貝特酸的最低定量下限可達0.02 μg／mL，RSD為9.8%(n＝5)，小于15%。

表3 非諾貝特酸在Wistar大鼠血漿中的線性關(guān)系(n＝5)

表4 非諾貝特酸在Wistar大鼠血漿中的最低定量限(n＝5)

精密度試驗：取空白血漿，按照標準曲線制備項下方法配制低、中、高3個質(zhì)量濃度（非諾貝特酸質(zhì)量濃度分別為0.05，2.50，80.00 μg／mL）的樣品，按2.1.3項下方法操作，每個質(zhì)量濃度進行5樣品平行分析，連續(xù)3 d。當日制備當日測定，并根據(jù)當日標準曲線，計算樣品測得質(zhì)量濃度。結(jié)果見表5和表6?？梢姡侵Z貝特酸的日內(nèi)精密度在1.06%～5.67%范圍內(nèi)(n＝5)，日間精密度在2.16%～6.87%范圍內(nèi)，相對誤差均在10%范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取空白血漿，按線性關(guān)系考察項下方法配制低、中、高3個質(zhì)量濃度，考察非諾貝特酸樣品提取后室溫放置12 h，－20℃放置1，7，14 d，以及血漿樣品冷凍前、凍融1次、凍融2次的穩(wěn)定性。結(jié)果見表7至表9。可見，非諾貝特酸血漿樣品室溫放置穩(wěn)定性良好，冷凍1，7，14 d樣品的穩(wěn)定性良好。凍融2次試驗結(jié)果良好，不影響測定結(jié)果，符合方法穩(wěn)定性的要求。

2.1.5 質(zhì)控樣品含量測定

大鼠血漿樣品分為6批進行測定，每批1條標準曲線，同時分析低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（非諾貝特酸質(zhì)量濃度為0.05，2.50，80.00 μg／mL）并隨行于未知樣品測試匯總。取空白血漿，按照標準曲線制備項下方法配制低、中、高3個質(zhì)量濃度（非諾貝特酸濃度分別為0.05，2.50，80.00 μg／mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每1個質(zhì)量濃度進行5樣品分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當日標準

曲線，計算QC樣品測得質(zhì)量濃度。根據(jù)QC樣品測定結(jié)果，計算測定方法的準確度和精密度。根據(jù)當批標準曲線求算大鼠血漿樣品質(zhì)量濃度和QC樣品質(zhì)量濃度，要求QC樣品質(zhì)量濃度偏差在±15%范圍內(nèi)，即回收率控制在85%～115%范圍內(nèi)，表示儀器檢測正常，否則當批樣品測定結(jié)果作廢。結(jié)果見表10。QC樣品結(jié)果表明，低、中、高QC樣品相對偏差均在±15%范圍內(nèi)，表明大鼠血漿樣品測定結(jié)果可信。

表5 非諾貝特酸在Wistar大鼠血漿中的日內(nèi)精密度（n＝5）

表6 非諾貝特酸在Wistar大鼠血漿中的日間精密度（n＝5）

表7 Wistar大鼠血漿中的非諾貝特酸提取后室溫放置12 h的穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n＝5)

表8 Wistar大鼠血漿中非諾貝特酸的－20℃冷凍穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n＝5， g／mL)

表9 Wistar大鼠血漿中非諾貝特酸的－80℃凍融穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n＝5， g／mL)

表10 Wistar大鼠血漿中的非諾貝特酸QC樣品含量測定結(jié)果

2.2 大鼠單次口服藥代動力學參數(shù)研究

2.2.1 大鼠單次口服試驗

預先頸部插管雄性 Wistar大鼠 12只（體質(zhì)量300～350 g），試驗前3 d可自由飲食。在禁食12 h后，給藥前稱重標號，分為兩組。分別向胃內(nèi)灌注非諾貝特原料藥、非諾貝特自制制劑混懸劑各 2 mL(溶劑為0.3%的CMC－Na溶液)，給藥量為27 mg／kg。分別于灌胃0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，12，24，36，48 h后，從大鼠的頸部預插管取血0.3 mL，置肝素化離心管中，立即注射37℃保溫的0.3 mL生理鹽水和0.1 mL肝素。所取血樣離心5 min(4 000 r／min)，吸取上層血漿，置－20℃冰箱中保存，待測。按2.1.3項下方法制備血漿樣品，采用HPLC法測定。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理

藥代動力學參數(shù)計算：根據(jù)所測非諾貝特酸血藥濃度－時間數(shù)據(jù)，利用Winolin非房室模型計算主要藥代動力學參數(shù)，包括半衰期（t1／2）、48 h血藥濃度曲線下面積（AUC0－48）、平均滯留時間（MTR）、最大血藥濃度（Cmax）和達峰時間（Tmax）。Cmax和 Tmax采用實測值，AUC為統(tǒng)計矩計算值。

相對生物利用度計算：非諾貝特酸相對生物利用度＝AUC0－48(試驗制劑)／AUC0－48(參比制劑)×100%。采取五樣本平行測定，方法學標準偏差（SD）和相對標準偏差（RSD%）采用Excel軟件計算結(jié)果。

2.2.3 測定結(jié)果與分析

大鼠體內(nèi)藥代動力學參數(shù)表明，非諾貝特的原料藥吸收非常緩慢，口服生物利用度非常低，但自制制劑生物利用度得到明顯提高。相同給藥情況下，非諾貝特自制制劑 Tmax為1.42 h，達峰質(zhì)量濃度為（58.17± 14.43）μg／mL，吸收速率大于原料藥，血藥濃度曲線下面積比為原料藥的38倍（自制制劑 AUC0－48／原料藥AUC0－48）。詳見圖2和表11。證明自制制劑對其口服吸收具有非常重要的改善作用，提高了難溶性藥物非諾貝特的溶解度和吸收。

圖2 Wistar大鼠單次口服非諾貝特原料藥及自制制劑的混懸液后的平均血漿濃度－時間曲線(給藥量27 mg／kg，n＝6)

表11 Wistar大鼠單次口服非諾貝特原料藥及自制制劑混懸液的動力學參數(shù)(給藥量27 mg／kg，n＝6)

3 討論

調(diào)脂藥非諾貝特口服后在胃腸道迅速吸收分布，分解代謝為活性代謝產(chǎn)物非諾貝特酸，轉(zhuǎn)化為非活性代謝物后通過腎臟和糞便排除[7]。因此根據(jù)《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則》，并在文獻[8]報道的基礎(chǔ)上進行了改進，建立了非諾貝特酸在大鼠血漿中測定的HPLC法。文獻[9－10]報道了氣相色譜－質(zhì)譜法、HPLC法[11－12]等用于非諾貝特口服后體內(nèi)非諾貝特酸藥代動力學的研究，但分離測定都較煩瑣。本研究中采用HPLC法操作快速、簡便，干擾少，影響因素少，分離度良好，靈敏度高，適合藥代動力學或者毒代動力學研究中大量的樣本分析。

文獻[13]報道中建立了3倍量甲醇沉淀蛋白，高速離心后取上清液進樣的方法，結(jié)果提取回收率為97.18% ～107.28%。本研究中采取了乙腈沉淀蛋白法提取，以血漿的2倍體積即可達到蛋白完全沉淀的效果，血樣預處理的方法簡便快捷，選擇性好，提取率高，分析的效率高，方法絕對回收率為99.82%～105.50%，RSD＜5%，且檢出限低，測定過程穩(wěn)定，分析費用低。本研究中，采用乙腈 ∶0.2%磷酸溶液（50∶50）為流動相系統(tǒng)，所得的樣品保留時間合適，峰形對稱，色譜分離度和重復性好，避免了流動相中加入緩沖鹽殘留在進樣閥中對高效液相色譜泵、進樣器和色譜柱的損傷，有利于樣本快速、準確地檢測。檢測波長選擇286 nm，為非諾貝特酸的最大吸收波長，靈敏度高，最低定量限達0.02 μg／mL，進樣體積小[14]。選取了酮洛芬為內(nèi)標，其溶解的特性及色譜行為與非諾貝特酸相似，具有合適的保留時間，提取回收率相近，血漿雜質(zhì)對其無干擾，與非諾貝特酸峰之間無干擾，性質(zhì)穩(wěn)定，價廉易得，滿足作為非諾貝特酸內(nèi)標的要求。在方法學研究中分別對非諾貝特酸從樣品采集、放置和配制等方面進行了穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)非諾貝特酸在樣品提取后室溫放置12 h，－20℃放置1，7，14 d，以及血漿樣品冷凍前、凍融1次、凍融2次的穩(wěn)定性均良好。

非諾貝特自制制劑大鼠灌胃給藥后，其藥代動力學參數(shù) Tmax是原料藥的0.5倍，而 Cmax是原料藥的19倍，生物利用度是38倍，表明非諾貝特自制制劑在體內(nèi)的吸收速度較原料藥明顯加快，吸收程度顯著增加[15]。藥－時曲線符合口服吸收的二室模型[16－17]。本研究中建立的HPLC法，成功地運用于檢測大鼠血漿中非諾貝特的活性代謝產(chǎn)物非諾貝特酸，滿足藥代動力學研究的要求。在給藥劑量范圍內(nèi)，非諾貝特酸在大鼠體內(nèi)的藥代動力學符合線性藥代動力學規(guī)律。

綜上所述，本研究中采用了比較簡單的色譜條件檢測了非諾貝特在大鼠血漿中的活性代謝產(chǎn)物非諾貝特酸的質(zhì)量濃度，可及時、準確地計算非諾貝特的代謝率，為臨床非諾貝特藥物檢測和體內(nèi)藥代動力學研究提供了有效的技術(shù)支持。

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Determination and Pharmacokinetic Study of Fenofibrate Active Metabolite in Rat Plasma by HPLC

Zhang Meimei,Lin Wei,Liu Xiaorui,Yin Yizi
(Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong,China 510095)

Objective To develop an HPLC method for determining the plasma drug concentration of fenofibrate active metabolitefenofibric acid.Methods Acetonitrile precipitated protei and ketoprofen were used as the internal standard.The column was Acclaim? 120 C18.The mobile phase consisted of acetonitrile－0.2% phosphoric acid solution(50∶50).The detection wavelength was 297 nm.Results The retention time of fenofibric acid and ketoprofen were about 9.1 min and 19.5 min,respectively.The standard curve was linear in the concentration range 0.02－100.00 μg／mL(r＝0.999 4).The recoveries were 97.74% －104.13%.The RSD of intraand inter－day assays were both lower than 7%(n＝5).Pretreated solution of fenofibric acid in human plasma was stable.Conclusion The bioavailability of self－made fenofibrate in rats is much higher than that of fenofibrate,which provides effective technical support for the clinical detection of fenofibrate and in vivo pharmacokinetics.

fenofibric acid;HPLC;plasma drug concentration

R965；R969.1；R972＋.6

A

1006－4931(2016)21－0028－06

張媚媚（1984－），女，博士研究生，主管藥師，研究方向為緩控釋制劑與靶向制劑，（電話）020－66673666（電子信箱）zhmm03＠hotmail.com；尹一子（1962－），女，碩士研究生，主任藥師，研究方向為抗腫瘤藥物的臨床合理應用及個體化給藥方案的設(shè)計，本文通訊作者，（電話)020－66673666（電子信箱）yinyizi6262＠aliyun.com。

2016－07－13；

2016－08－22)

廣州醫(yī)科大學博士／出國留學啟動基金，項目編號：2013C66。