水楊酸抑制胃癌細(xì)胞體外增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力研究

葛曙雄 劉雅輝 張立 李科事 胡岳 王涌

水楊酸抑制胃癌細(xì)胞體外增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力研究

葛曙雄 劉雅輝 張立 李科事 胡岳 王涌

目的 探討水楊酸抑制人胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。方法 不同濃度水楊酸體外處理胃癌細(xì)胞株MGC-803后，采用基質(zhì)膠黏附試驗(yàn)、遷移試驗(yàn)和Transwell侵襲試驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞黏附、遷移和侵襲能力的變化；采用熒光定量PCR、Western blot檢測細(xì)胞黏附相關(guān)分子核纖層蛋白（Lamin）、核纖層蛋白C1（LaminC1）、核纖層蛋白B1（LaminB1）、纖連蛋白（FN1）、CD44、整合素A9（ITGA9）、連環(huán)蛋白A1（CTNNA1）和E鈣粘素（CDH1）表達(dá)水平的變化。結(jié)果 與空白對照比較，0.5mmol/L和1mmol/L水楊酸體外處理胃癌細(xì)胞24h后，胃癌細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力均受抑制（均P＜0.05）；Lamin、LaminC1、LaminB1、FN1、CD44、ITGA9和CTNNA1 mRNA表達(dá)水平均下降（均P＜0.05），CDH1 mRNA表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；LaminB1、FN1、CD44和CTNNA1蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）。結(jié)論 一定濃度的水楊酸可體外抑制胃癌細(xì)胞增殖、黏附、侵襲能力，從而抑制胃癌轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附相關(guān)分子的表達(dá)水平和抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

水楊酸 胃癌細(xì)胞株 侵襲轉(zhuǎn)移 細(xì)胞黏附分子

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of salicylic acid on adhesion,migration and invasion abilities of gastric cancer cell line and their mechanisms. Methods Human gastric cancer cells were incubated with different concentrations of salicylic acid.The abilities of adhesion,migration and invasion of gastric cancer cells were evaluated with cell adhesion assay, Transwell migration assay and Transwell invasion assay.The mRNA and protein expression levels of cell adhesion moleculars were tested by Real-time RT-PCR and Western blot,respectively. Results Salicylic acid significantly inhibited the proliferation, adhesion,migration and invasion of gastric cancer cells in vitro.The mRNA expression levels of Lamin,LaminC1,LaminB1,FN1, CD44,ITGA9 and CTNNA1 were decreased;however,expression of CDH1 was increased after salicylic acid treatment.While the protein expression levels of LaminB1,FN1,CD44 and CTNNA1 were also decreased(P＜0.05). Conclusion Salicylic acid inhibits the proliferation,adhesion,migration and invasion of gastric cancer cell,which is associated with the expression of cell adhesion-related molecules and the resistance to epithelial-mesenchymal transition.

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在腫瘤中排第4位，病死率列第2位，全球每年大約新增胃癌患者90萬[1]。胃癌患者的總體療效不理想，術(shù)后5年生存率不足50%[2]，多數(shù)患者死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是臨床研究熱點(diǎn)。阿司匹林具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎和抑制血小板凝集等作用，研究證實(shí)其對直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤具有一定的預(yù)防和治療作用。水楊酸作為阿司匹林的主要代謝產(chǎn)物，亦被證實(shí)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討一定濃度的水楊酸對胃癌細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其可能的分子機(jī)制，以期為水楊酸的抗腫瘤應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株MGC-803購自美國ATCC細(xì)胞庫；水楊酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配制成0.1mol/L的母液）；MTS檢測試劑盒購自北京Promega公司；Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室購自美國Corning公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司；LAMB1、FN1、CD44和CTNNA1抗體均購自英國Abcam公司；β-actin多克隆抗體和IgG二抗購自康為世紀(jì)公司；Hochest染色試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用MTS法檢測細(xì)胞增殖能力。將生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞的密度調(diào)整為3×104個/ml，以100μl/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后加入水楊酸，濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mmol/L，分別設(shè)為空白對照組、0.5mmol/L組、1mmol/L組、1.5mmol/ L組、2mmol/L組、2.5mmol/L組、3mmol/L組，每組設(shè)3個復(fù)孔；繼續(xù)培養(yǎng)24h后，去液、清洗，重新加入100μl培養(yǎng)液和20μl MTS反應(yīng)液，酶標(biāo)儀490nm波長處測吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/空白對照組A值）×100%]。

1.3 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 用無血清的培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠稀釋4倍，按80μl/孔鋪入96孔板，風(fēng)干過夜；次日，每孔加入100μl無血清培養(yǎng)基放置1h，活化Matrigel基質(zhì)膠；收集對照組、0.5 mmol/L組、1 mmol/L組水楊酸處理24h后的胃癌細(xì)胞，每孔接種8 000個細(xì)胞，設(shè)置3個復(fù)孔，共9孔，培養(yǎng)90min；去液清洗后，每孔加入100μl甲醇固定15min，Hochest染色5min，顯微鏡下觀察（×200），選取4個不同視野計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)量。

1.4 細(xì)胞遷移試驗(yàn) 消化收集對照組、0.5 mmol/L組、1 mmol/L組水楊酸處理24h后的胃癌細(xì)胞，按每孔5×104個細(xì)胞接種于Transwell上室；上室加入200μl無血清培養(yǎng)基，下室600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；孵育24h后，濕棉棒擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，甲醇固定上室基底膜下層細(xì)胞20min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，顯微鏡下觀察（×200）；后用33%醋酸脫色，570nm波長處測定吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞遷移抑制率[細(xì)胞遷移抑制率=（對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/空白對照組A值×100%]。

1.5 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 采用Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行1:8稀釋，加入Transwell上室，每孔75μl稀釋膠，風(fēng)干過夜；收集對照組、0.5 mmol/L組、1 mmol/L組水楊酸處理24h后的胃癌細(xì)胞，按每孔5×104個細(xì)胞接種于上室，加入200μl無血清培養(yǎng)基，下室加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；孵育72h，濕棉棒擦去上室細(xì)胞和Matrigel基質(zhì)膠，甲醇固定上室基底膜下層細(xì)胞20min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，顯微鏡下觀察（×200）；33%醋酸脫色，570nm波長處測定A值。

1.6 細(xì)胞黏附相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平檢測 采用熒光定量PCR法。分別提取對照組、0.5 mmol/L組、1 mmol/L組水楊酸處理12 h后的胃癌細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；選取GAPDH作為內(nèi)參，分別檢測核纖層蛋白（Lamin）、核纖層蛋白C1（LaminC1）、核纖層蛋白B1（LaminB1）、纖連蛋白（FN1）、CD44、整合素A9（ITGA9）、連環(huán)蛋白A1（CTNNA1）和E鈣粘素（CDH1）的mRNA表達(dá)。引物序列及產(chǎn)物長度見表1；反應(yīng)條件為：95℃30 s，95℃5s，60℃30s，40個循環(huán)；采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

1.7 細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)水平法檢測 采用Western blot法。分別提取對照組、0.5mmol/L組、1mmol/L組水楊酸處理24h后的胃癌細(xì)胞總蛋白；蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影；應(yīng)用Image J圖像分析軟件對圖像的灰度值進(jìn)行分析，以βactin作為內(nèi)參，檢測LaminB1、FN1、CD44和CTNNA1的蛋白表達(dá)水平（目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度水楊酸對胃癌細(xì)胞增殖的抑制率 見圖1。

由圖1可見，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，0.5mmol/L和1mmol/L水楊酸處理即可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖，1.5 mmol/L水楊酸處理后細(xì)胞增殖抑制率超過50%。因此，本研究選擇0.5mmol/L和1mmol/L濃度的水楊酸處理胃癌細(xì)胞24h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理?xiàng)l件。

圖1 不同濃度水楊酸對胃癌細(xì)胞增殖的抑制率

2.2 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞黏附能力比較 細(xì)胞黏附試驗(yàn)中，與空白對照組細(xì)胞黏附數(shù)量[（121.00±2.65）個/視野]相比，0.5mmol/L組[（88.00± 1.53）個/視野]和1mmol/L組[（44.00±2.00）個/視野]均減少（均P＜0.05）,且1mmol/L組更少于0.5mmol/L組（P＜0.05）。3組顯微鏡下細(xì)胞黏附數(shù)量比較見圖2（見插頁）。

2.3 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞遷移能力比較 細(xì)胞遷移試驗(yàn)中，0.5mmol/L組細(xì)胞遷移抑制率為（10.00±3.85）%，1mmol/L組為（12.00±3.61）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組顯微鏡下細(xì)胞遷移能力比較見圖3（見插頁）。

2.4 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞侵襲能力比較 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)中，與空白對照組A值（0.22± 0.01）相比，0.5mmol/L組（0.18±0.00）和1mmol/L組（0.15±0.00）均降低（均P＜0.05）；且1mmol/L組更低于0.5mmol/L組（P＜0.05）。3組顯微鏡下細(xì)胞侵襲能力比較見圖4（見插頁）。

2.5 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞黏附相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較 見表2。

表2 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞黏附相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較

由表2可見，0.5mmol/L組、1mmol/L組細(xì)胞Lamin、LaminC1、LaminB1、FN1、CD44、ITGA9和CTNNA1 mRNA的表達(dá)水平均低于空白對照組（均P＜0.05），CDH1 mRNA的表達(dá)水平均高于空白對照組（均P＜0.05）；且0.5mmol/L組與1mmol/L組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.6 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見表3。

表3 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

由表3可見，0.5mmol/L組、1mmol/L組細(xì)胞LaminB1、FN1、CD44、CTNNA1蛋白表達(dá)水平均低于空白對照組（均P＜0.05）；0.5mmol/L組與1mmol/L組細(xì)胞FN1蛋白表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），LaminB1、CD44、CTNNA1蛋白表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。3組細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較條帶圖見圖5。

圖5 0.5mmol/L組、1mmol/L組及空白對照組細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較條帶圖

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是大多數(shù)腫瘤患者病死的主要原因，它由一系列連續(xù)和相關(guān)的步驟組成，包括腫瘤細(xì)胞從原始位置的分離，侵入細(xì)胞外基質(zhì)，血管和淋巴管的內(nèi)滲，分散再循環(huán)，依附于轉(zhuǎn)移組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞，外溢和定植于轉(zhuǎn)移灶[9]。腫瘤轉(zhuǎn)移與細(xì)胞黏附、遷移和侵襲密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始點(diǎn)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移能力或可有效降低腫瘤轉(zhuǎn)移率，提高腫瘤患者的生存率。本研究結(jié)果表明，水楊酸以濃度梯度的方式抑制胃癌細(xì)胞的體外增殖，并明顯抑制胃癌細(xì)胞的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。

水楊酸作為一種抗炎藥物在結(jié)腸癌、乳腺癌、直腸癌和胃癌等腫瘤中已展現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用。它可以激活p38MAP激酶壓力通路和抑制ERK生存通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，另外還可以激活NF-κB促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。此外，水楊酸通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和影響腫瘤的代謝進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。Torimura等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抑制整合素整合素（ITGA）及其下游的信號通路能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，水楊酸抑制胃癌細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移可能與下調(diào)細(xì)胞黏附分子Lamin、LaminC1、LaminB1、FN1、CD44、ITGA9的表達(dá)水平有關(guān)。再者，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）在腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演不可或缺的作用。EMT發(fā)生的主要標(biāo)志是CDH的表達(dá)水平下調(diào)，基質(zhì)降解蛋白酶和間質(zhì)相關(guān)蛋白（波形蛋白和N鈣粘素）的表達(dá)水平上調(diào)[12]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)連環(huán)蛋白（CTNN）是促進(jìn)EMT的重要信號分子[13]。本研究結(jié)果表明，水楊酸可通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞CDH1以及下調(diào)CTNNA1的表達(dá)水平來抑制EMT過程，從而發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。因此，抑制EMT的發(fā)生可能是水楊酸抗腫瘤轉(zhuǎn)移的又一作用機(jī)制。

綜上所述，一定濃度的水楊酸可體外抑制胃癌細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲能力，從而抑制胃癌轉(zhuǎn)移。水楊酸發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)水平和抑制胃癌細(xì)胞EMT有關(guān)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

[1]DeSantis C E,Lin C C,Mariotto A B.Cancer treatment and survivorship statistics,2014[J].CACancerJ Clin,2014,64(4):252-271.

[2]Wen L,Chen X Z,Yang K.Prognostic value of cancer stem cell marker CD133 expression in gastric cancer:a systematic review [J].PLoS One,2013,8(3):e59154.

[3]Langley RE.Clinicalevidence for the use ofaspirin in the treatment ofcancer[J].Ecancermedicalscience,2013,7(1):297.

[5]Reader J,Holt D,Fulton A.Prostaglandin E 2 E P receptors as therapeutic targets in breast cancer[J].Cancer Metastasis Rev, 2011,30(3-4):449-463.

[6]Pan MR,Chang H C,Hung WC.Non-steroidalanti-inflammatory drugs suppress the ERKsignaling pathway via block ofRas/c-Raf interaction and activation of MAP kinase phosphatases[J].Cell Signal,2008,20(6):1134-1141.

[7]Borthwick G M,Johnson AS,Partington M,et al.Therapeutic levels of aspirin and salicylate directly inhibit a model of angiogenesis through a Cox-independent mechanism[J].FASEB J,2006,20(12): 2009-2016.

[8]Dovizio M,Bruno A,TacconelliS,et al.Mode ofaction ofaspirin as a chemopreventive agent[J].Recent Results Cancer Res,2013,191 (1):39-65.

[9]Leber M F,Efferth T.Molecular principles of cancer invasion and metastasis[J].Int J Oncol,2009,34(1):881-895.

[10]Dovizio M,Bruno A,Tacconelli S,et al.Mode of action of aspirin as a chemopreventive agent[J].Recent Results Cancer Res, 2013,191(1):39-65.

[11]Torimura T,Ueno T,Kin M,et al.Integrin alpha6beta1 plays a significant role in the attachment of hepatoma cells to laminin[J].J Hepatol,1999,31(4):734-740.

[12]Guarino M.Epithelial-mesenchymal transition and tumour invasion[J].Int J Biochem CellBiol,2007,39(12):2153-2160.

[13]Thiery J P,Sleeman J P.Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymaltransitions[J].Nat Rev MolCell Biol,2006,7(2): 131-142.

（本文編輯：李媚）

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本刊編輯部

Effect of salicylic acid on adhesion,migration and invasion of human gastric cancer cells

GE Shuxiong,LIU Yahui,ZHANG Li,et al.Medical School of Ningbo University,Ningbo 315211,China

Salicylic acid Gastric cancer cell line Migration and invasion Cell adhesion molecules

2016-06-09）

315211 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（葛曙雄、張立、李科事）；寧波市第一醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（劉雅輝），普外科（胡岳、王涌）

王涌，E-mail：robinwang9401@sina.com