抗菌肽在斷奶仔豬飼糧中的應(yīng)用效果研究

朱宇旌，王博，李方方，鄭麗莉，高原，孟玲，郭福來(lái)，丁蘭，張勇

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.遼寧德寶農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，遼寧沈陽(yáng)110171；3.沈陽(yáng)?？缔r(nóng)牧科技有限公司，遼寧沈陽(yáng)110164）

抗菌肽在斷奶仔豬飼糧中的應(yīng)用效果研究

朱宇旌1，王博1，李方方1，鄭麗莉1，高原2，孟玲2，郭福來(lái)2，丁蘭3，張勇1

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.遼寧德寶農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，遼寧沈陽(yáng)110171；3.沈陽(yáng)福康農(nóng)牧科技有限公司，遼寧沈陽(yáng)110164）

為研究抗菌肽（AMPs）在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，選?。?0.30±1.13）kg大白仔豬180頭，隨機(jī)分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加抗菌肽A（AMPs-A）500 mg/kg和抗菌肽B（AMPs-B）300 mg/kg，試驗(yàn)期28 d。結(jié)果表明：1）AMPs-A組在試驗(yàn)1～14 d、15～28 d、1～28 d這3個(gè)時(shí)間階段日增重比對(duì)照組分別提高5.66%（P＞0.05）、3.92%（P＞0.05）、3.85%（P＞0.05）。2）AMPs-A組血清尿素氮水平比對(duì)照組降低14.55%（P＜0.01）。3）與對(duì)照組相比，AMPs-A、AMPs-B血液中IgG分別提高2.07%（P＜0.05）、1.27%（P＜0.05），血清總蛋白水平分別提高4.48%（P＜0.05）、4.03%（P＜0.05），血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率AMPs-A組提高39.02%（P＜0.05）。4）AMPs-A組干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪消化率分別比對(duì)照組提高2.62%（P＜0.05）、3.95%（P＜0.05）、3.70%（P＜0.05）。5）腸道中大腸桿菌數(shù)，AMPs-A、AMPs-B比對(duì)照組分別降低5.53%（P＜0.05）、3.77%（P＜0.05）；乳酸桿菌數(shù)，AMPs-A、AMPs-B比對(duì)照組分別提高4.94%（P＜0.05）、3.67%（P＜0.05）；雙歧桿菌數(shù)，AMPs-A、AMPs-B比對(duì)照組分別提高5.61%（P＜0.05）、4.75%（P＜0.05）。綜上所述，在仔豬飼糧中添加AMPs可以有效提高仔豬的生長(zhǎng)性能、飼料養(yǎng)分消化利用率，改善血清生理生化指標(biāo)水平、腸道微生物平衡。綜合本試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)，仔豬飼糧中添加AMPs-A效果較好。

抗菌肽；斷奶仔豬；生長(zhǎng)性能；血清生理生化指標(biāo)；養(yǎng)分消化率；糞便微生物菌群

目前尋找可替代抗生素類(lèi)的新型飼料添加劑已成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?？咕模╝ntimicrobial peptides,AMPs）是指昆蟲(chóng)及動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)誘導(dǎo)作用產(chǎn)生的一類(lèi)分子量較小的多肽物質(zhì)，產(chǎn)生于生物體的免疫系統(tǒng)當(dāng)中，可以抵抗病原體的侵害，是具有廣譜殺菌功能的一類(lèi)多肽，屬堿性，同時(shí)它也是生物體中天然免疫系統(tǒng)不可分割的重要組成部分[1]。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫性能、改善腸道微生物環(huán)境、抗病毒活性等優(yōu)點(diǎn)[2-4]。但目前有關(guān)AMPs在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用效果及作用機(jī)制少有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以大白仔豬為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)在飼糧中添加不同的AMPs研究其對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、血液生理生化指標(biāo)、免疫機(jī)能、養(yǎng)分消化率和糞便中微生物菌群的影響，為AMPs在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗菌肽A（AMPs-A）主要成分為豬防御素、蠅蛆殺菌肽、枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌≥1.5×109CFU/g。

抗菌肽B（AMPs-B）主要成分為天蠶素、枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌≥1×109CFU/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)于2014年4—6月在遼寧德寶農(nóng)牧集團(tuán)艾德蒙種豬場(chǎng)進(jìn)行。大白仔豬平均體重在（10.30±1.13）kg?；A(chǔ)飼糧參考NRC（1998）配制，其組成及主要營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選用體重相近、健康的大白仔豬180頭，隨機(jī)分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭仔豬。飼喂期28 d。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg AMPs-A、300 mg/kg AMPs-B。

試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)保育豬舍進(jìn)行沖洗及消毒，試驗(yàn)仔豬采用高床飼養(yǎng)，自由采食及飲水。免疫和驅(qū)蟲(chóng)程序按豬場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行，隨時(shí)觀(guān)察、記錄仔豬的采食和腹瀉情況以及每天的飼料消耗量。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定分別在試驗(yàn)第1天、第14天和第28天以個(gè)體為單位對(duì)所有試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱(chēng)重，試驗(yàn)過(guò)程中以重復(fù)為單位記錄采食量，并測(cè)定仔豬的平均日采食量、平均日增重。根據(jù)平均日增重（ADG）和平均日采食量（ADFI）計(jì)算料重比（F/G）。

1.4.2 血清生理生化指標(biāo)的測(cè)定采用日本日立7160全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清中總蛋白（totalprotein,TP）、尿素氮（urea nitrogen,BUN）。采用比色法測(cè)定IgA、IgG、IgM含量，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.3 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定取抗凝血3 mL，500 r/min離心10 min，取中層（血漿與血細(xì)胞之間的白色膜）加Hank'S液2 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液。洗滌2次。用PRMI 1640稀釋細(xì)胞用血球儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞，使其密度為107/mL的白細(xì)胞懸液，分裝成2管。在一管中加10%小牛血清和10%植物血凝素各100 μL，另一管（對(duì)照管）加10%小牛血清和PRMI 100 mL，混勻。取上述100 μL加入96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，設(shè)2個(gè)重復(fù)管，在5%二氧化碳、37℃、飽和濕度下培養(yǎng)48 h，每孔加5 mg/mL MTT 10 μL培養(yǎng)4 h，再加10 mL 10%的SDS-0.04M HCl，培養(yǎng)2 h后取出，室溫放置5 min。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)[5]。

1.4.4 養(yǎng)分消化率的測(cè)定以酸不溶灰分作為內(nèi)源指示劑測(cè)定各養(yǎng)分消化率。在正式試驗(yàn)期的第26、27和28天選取每個(gè)重復(fù)中生長(zhǎng)較好、體況相近的豬各5頭，連續(xù)3 d于6：00至8：00間收集糞樣，每天每頭豬采集糞樣約200 g，并加入體積分?jǐn)?shù)為10%的酒石酸水溶液20 mL，防止氨氣揮發(fā)。收集后將每個(gè)糞樣單獨(dú)冷凍保存，密封后低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，糞樣進(jìn)行概略養(yǎng)分分析。測(cè)定酸不溶灰分（AIA）含量，計(jì)算干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、鈣（Ca）和磷（P）的表觀(guān)消化率[5]。

1.4.5 糞中微生物菌群的測(cè)定在正式試驗(yàn)期的第28天選取每個(gè)重復(fù)中生長(zhǎng)較好、體況相近的豬各5頭，連續(xù)3 d于6：00～8：00間收集糞樣，每頭豬采集糞樣約50 g，分別使用無(wú)菌自封袋采集封裝記錄后置于-4℃冰箱內(nèi)保存用于測(cè)定大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數(shù)量，采用平板涂布法計(jì)數(shù)[5]。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基（HB6238-1）37℃下恒溫需氧培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)；乳酸桿菌用乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基（LBS培養(yǎng)基，HB0385）、雙歧桿菌用雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基（BL培養(yǎng)基，HB0395），置于37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)48 h后觀(guān)察計(jì)數(shù)，結(jié)果均以每克糞便中含有的菌落總數(shù)的常用對(duì)數(shù)值[log（CFU/g）]表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），差異顯著時(shí)采用鄧肯法（duncan）進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，AMPs-A組仔豬中期重、末重分別提高3.61%（P＞0.05）、3.89%（P＞0.05），AMPs-B中期重、末重比對(duì)照組分別顯著降低4.57%（P＜0.05）、5.65%（P＜0.05）。AMPs-A組有提高日增重趨勢(shì)（P＞0.05），試驗(yàn)1～14 d、15～28 d、1～28 d這3個(gè)時(shí)間階段日增重比對(duì)照組分別提高5.66%、3.92%、3.85%。但AMPs-B仔豬日增重顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1～14 d、15～28 d、1～28 d這3個(gè)時(shí)間階段日增重比對(duì)照組分別顯著降低11.32%、7.84%、9.62%。各試驗(yàn)組日采食量與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），但AMPs-A各試驗(yàn)階段有高于對(duì)照組趨勢(shì)。料重比，試驗(yàn)1～14 d，AMPs-B組顯著高于對(duì)照組和AMPs-A組，分別提高8.06%、11.67%；AMPs-A組與對(duì)照組相比降低3.23%，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 抗菌肽對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

2.2 抗菌肽對(duì)仔豬血液生化指標(biāo)的影響

2.2.1 抗菌肽對(duì)仔豬蛋白質(zhì)代謝指標(biāo)的影響由表3可知，AMPs-A組尿素氮極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），AMPs-B組尿素氮顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），與對(duì)照組相比分別降低14.55%和8.18%。

表3 抗菌肽對(duì)仔豬蛋白質(zhì)代謝的影響

2.2.2 抗菌肽對(duì)仔豬免疫性能的影響由表4可知，各試驗(yàn)組血液IgA和IgM含量與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。AMPs-A組、AMPs-B組與對(duì)照組相比，血液IgG含量顯著提高（P＜0.05），分別提高2.07%、1.27%。AMPs-A組血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），比對(duì)照組提高39.02%； AMPs-B組血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），比對(duì)照組降低9.76%。AMPs-A、AMPs-B組血清總蛋白水平比對(duì)照組分別顯著提高4.48%、4.03%。

表4 抗菌肽對(duì)仔豬血液免疫指標(biāo)的影響

2.3 抗菌肽對(duì)仔豬養(yǎng)分消化率的影響

由表5可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，AMPs-A組干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪消化率分別顯著提高2.62%、3.95%、3.70%。AMPs-B組干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪消化率與對(duì)照組差異不顯著。AMPs-B組鈣和磷消化率比對(duì)照組顯著低6.73%、4.92%，AMPs-A組鈣和磷消化率與對(duì)照組差異不顯著。

表5 抗菌肽對(duì)仔豬養(yǎng)分消化率的影響

2.4 抗菌肽對(duì)仔豬腸道微生物數(shù)量的影響

由表6可知，AMPs-A、AMPs-B組腸道中大腸桿菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），分別降低5.53%、3.77%；乳酸桿菌菌落數(shù)，AMPs-A、AMPs-B組分別比對(duì)照組顯著提高了4.94%、3.67%；雙歧桿菌菌落數(shù)，AMPs-A、AMPs-B組分別比對(duì)照組顯著提高5.61%、4.75%。

表6 抗菌肽對(duì)仔豬腸道微生物數(shù)量的影響

3 討論

3.1 抗菌肽與仔豬生長(zhǎng)性能的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬抵抗力下降，容易引發(fā)腹瀉、生長(zhǎng)性能下降等，這很可能與抗菌肽的表達(dá)下降有關(guān)，通過(guò)外源性添加抗菌肽可提高畜禽防御功能，增強(qiáng)自身免疫力和抗病能力[5]。在飼糧中添加抗菌肽能夠增加仔豬對(duì)外源性病原菌的抵抗能力[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼糧中添加AMPs-A能顯著地提高仔豬日增重，降低試驗(yàn)仔豬料重比，但對(duì)日采食量無(wú)顯著影響，這與Jin等[6]的研究結(jié)果相似。AMPs-B組中期重和末重低于對(duì)照組，可能是這種抗菌肽反而引起體內(nèi)免疫反應(yīng)導(dǎo)致負(fù)面效果，所以抗菌肽的種類(lèi)對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響很大。AMPs-A是來(lái)自豬源型的抗菌肽，效果明顯好于對(duì)照組和AMPs-B組。

3.2 抗菌肽與仔豬免疫性能及血清生理生化的關(guān)系

血清總蛋白含量和尿素氮濃度能夠比較準(zhǔn)確地反映出動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和飼糧氨基酸平衡的狀況[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加AMPs-A能顯著提高仔豬血清中總蛋白水平，極顯著降低仔豬血液中尿素等水平，這與Coma等[8]研究結(jié)果相似。這是由于A(yíng)MPs能促進(jìn)蛋白質(zhì)在仔豬體內(nèi)的合成，降低體內(nèi)氨基酸的分解作用，從而改善了機(jī)體內(nèi)氨基酸的平衡狀態(tài)，促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)的合成或減少體內(nèi)含氮物質(zhì)的分解，進(jìn)而增加機(jī)體蛋白質(zhì)沉積。

顧憲紅等[9]指出，斷奶會(huì)使仔豬腸絨毛萎縮、隱窩加深，保護(hù)仔豬的胃腸道黏膜可減弱應(yīng)激對(duì)仔豬的損傷作用，而免疫球蛋白在保護(hù)腸道、呼吸道、泌尿生殖道、乳腺和眼睛抵抗微生物入侵方面起關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加AMPs-A能夠提高仔豬IgG和IgM水平，進(jìn)而保護(hù)斷奶仔豬胃腸道黏膜，減少斷奶應(yīng)激，這與Papagianni等[10]的研究結(jié)果基本一致。此外本試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加AMPs-A后仔豬血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對(duì)照組，這也說(shuō)明AMPs-A具有減少機(jī)體應(yīng)激、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效。

3.3 抗菌肽與仔豬營(yíng)養(yǎng)消化利用率的關(guān)系

仔豬消化酶活性越高，消化吸收能力越好，添加AMPs能提高十二指腸蛋白酶、淀粉酶活性，從而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[11-12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，AMPs-A能提高干物質(zhì)、鈣、磷、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪消化率，與以上報(bào)道基本一致。

3.4 抗菌肽與糞便微生物菌群數(shù)的關(guān)系

本試驗(yàn)表明，AMPs-A和AMPs-B能顯著地降低大腸桿菌的數(shù)量，同時(shí)還能顯著地提高腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，這與Manzanilla等[13]、Namkung等[12]研究結(jié)果基本一致。仔豬早期斷奶后受到各種應(yīng)激導(dǎo)致腸道微生物菌群嚴(yán)重失調(diào)，斷奶后2 d內(nèi)回腸中乳酸桿菌的數(shù)量幾近消失，而大腸桿菌的數(shù)量顯著增加，且pH越高，大腸桿菌的數(shù)量越多，而大腸桿菌是引起仔豬斷奶后腹瀉的主要病原菌[14]。Chen等[14]進(jìn)行了天蠶素的體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸道中大量的致病菌，如大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等被優(yōu)先抑制。由此可見(jiàn)，抗菌肽具有較強(qiáng)的抑菌效果。

4 結(jié)論

（1）在仔豬飼糧中添加AMPs-A有提高仔豬日增重趨勢(shì)，有利于提高仔豬的生長(zhǎng)性能。

（2）添加AMPs顯著提高血液中IgG含量，AMPs-A顯著提高血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，AMPs顯著提高血清總蛋白水平，使仔豬的免疫機(jī)能得到改善。

（3）添加AMPs-A極顯著降低尿素氮水平，顯著提高干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪消化率。

（4）添加AMPs顯著降低腸道大腸桿菌數(shù)量，顯著提高乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，間接反映了其能夠抑制腸道大腸桿菌的生長(zhǎng)和繁殖，增加有益菌數(shù)量，維持腸道微生態(tài)平衡。

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（編輯：富春妮）

The Research and Application of Plant Extract in Piglets

ZHU Yujing1,WANG Bo1,LI Fangfang1,ZHENG Lili1,GAO Yuan2,MENG Ling2,GUO Fulai2,DING Lan3,ZHANG Yong1
(1.College of Animal Sciences and Veterinary Sciences,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866, China;2.Liaoning Debao Argi-animal Husbandry Co.,Ltd.,Shenyang 110171,China;3.Shen Yang Fukang Agriculture and Animal Husbandry Technology Co.,Ltd.,Shenyang 110164,China)

This test was designed to study the effects of antimicrobial peptides(AMPs)in pig production.180 pigs (10.30±1.13)kg had been randomly divided into 3 groups,and each group 4 repeats,each repeat 15 pigs.The control group was fed based diet,the experimental group were fed basic feeding food with 500 mg/kg AMPs-A and 300 mg/kg AMPs-B.Experiment lasted for 28 days.Results showed that:1)compared with control group,ADG respectively increase 5.66%(P＞0.05),3.92%(P＞0.05),3.85%(P＞0.05)the day of 1～14,15～28,1～28 in AMPs-A. 2)AMPs-A dramatically significantly reduce BUN 14.55%(P＜0.01).3)compared with control group,the IgG of AMPs-A and AMPs-B had increased 2.07%(P＜0.05)and 1.27%(P＜0.05);the TP of AMPs-A and AMPs-B had increased 4.48%(P＜0.05)and 4.03%(P＜0.05);and AMPs-A significantly increased T lymphatic conversion rates 39.02%(P＜0.05)in blood.4)AMPs-A respectively significantly increased DM,CP and EE absorption rate 2.62% (P＜0.05),3.95%(P＜0.05),3.70%(P＜0.05).5)E.coli colony count in pig feces had decreased 5.53%(P＜0.05)and 3.77%(P＜0.05)in AMPs-A and AMPs-B.Lactobacillus in AMPs-A and AMPs-B has increased 4.94%(P＜0.05) and 3.67%(P＜0.05),and Bifidobacterium colony count of AMPs-A and AMPs-B had increased 5.61%(P＜0.05) and 4.75%(P＜0.05).Adding AMPs in daily diet can effectively improve pig growth performance,blood physiological and biochemical indicators feed digestion utilization and improve intestinal microbial balance.The test indicate that adding AMPs-A is better than AMPs-B.

AMPs;weaning pig;production performance;blood physiological and biochemical indices;nutrient digestibility;fecal microflora

S816.7

A

1002-1957(2016)02-0017-04

2015-11-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（31440082和31101253）

朱宇旌（1972-），女，遼寧彰武人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究工作.E-mail:syndzhyj@163.com

張勇，教授，碩士生導(dǎo)師.E-mail:syndzhy@126.com