人體血液拉曼光譜在癌癥檢測(cè)中的應(yīng)用*

張 明 綜述，高 飛，羅 果，朱紹玲 審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院物理學(xué)教研室，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義 563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義563003)

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·綜 述·

人體血液拉曼光譜在癌癥檢測(cè)中的應(yīng)用*

張 明1綜述，高 飛1，羅 果2△，朱紹玲3審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院物理學(xué)教研室，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義 563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義563003)

光譜；腫瘤；生物大分子；蛋白質(zhì)；表面增強(qiáng)拉曼散射

癌癥是危害人類健康的最主要“殺手”之一。目前，全球每年約有數(shù)以千萬計(jì)人被確診為癌癥，數(shù)百萬人被癌癥奪去生命。不管是發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，癌癥發(fā)病率都呈現(xiàn)出高發(fā)態(tài)勢(shì)。由于我國(guó)人口基數(shù)大，醫(yī)療衛(wèi)生基礎(chǔ)相對(duì)不發(fā)的，造成了我國(guó)癌癥發(fā)病人數(shù)和病死率都高。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織在《全球癌癥報(bào)告2014》中稱：中國(guó)新增癌癥病例高居第一位，死亡病例世界第一[1-2]。由于癌癥在早期癥狀不是很明顯，當(dāng)發(fā)現(xiàn)確診為癌癥時(shí)，往往已經(jīng)是中晚期了，因此對(duì)癌癥進(jìn)行早期的篩查，做到早診斷、早治療是可以顯著提高癌癥患者的生存率的，這就需要不斷研究和開發(fā)關(guān)于癌癥篩查和早期診斷的方法。

目前，癌癥的診斷方法主要有X射線攝影、超聲檢查、CT檢查、MRI檢查、內(nèi)窺鏡檢查、組織細(xì)胞活檢以及相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的檢出等[3-4]。采用超聲影像診斷的方法通常可以發(fā)現(xiàn)具有一定大小的腫瘤包塊，內(nèi)窺鏡檢查可以發(fā)現(xiàn)消化系統(tǒng)及婦科的一些腫瘤，再結(jié)合進(jìn)一步的組織細(xì)胞活檢來確診是否是癌癥，而通常發(fā)現(xiàn)也已經(jīng)錯(cuò)過了最佳治療時(shí)期。臨床研究表明，腫瘤在其代謝過程中會(huì)出現(xiàn)一些相關(guān)產(chǎn)物可用于作為腫瘤標(biāo)志物，例如血清癌胚抗原(CEA)，正常值小于等于3.45 μg/L，發(fā)現(xiàn)在胃癌、肺癌、尿道癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥患者中出現(xiàn)了CEA升高，其中結(jié)腸癌患者最為明顯；甲胎蛋白(AFP)是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物，也是經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局認(rèn)證使用的肝癌血清診斷標(biāo)志物，常用于原發(fā)性肝癌的篩選；前列腺特異抗原(PSA)，正常值小于4 μg/L，在前列腺癌中，30%～86%的患者都出現(xiàn)了PSA的升高。采用單個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行判別時(shí)，得到的陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值都不高，從而判別的正確率較低。另外，某些腫瘤標(biāo)志物在某些生理情況下或其他疾病也可以異常升高，需注意鑒別。采用以上診斷方法也就存在一定的缺陷，如特異性及靈敏度低，操作復(fù)雜，有創(chuàng)傷，費(fèi)用高等，所以研究一種快速、簡(jiǎn)便、安全的早期癌癥檢測(cè)方法可以為癌癥篩查和診斷開辟一條新的途徑。

拉曼光譜技術(shù)是印度科學(xué)家拉曼(C.A.Raman)在研究單色光通過純苯溶液的散射時(shí)，發(fā)現(xiàn)了有極少的散射光子出現(xiàn)了頻移(拉曼散射)并在此基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的一種分子光譜技術(shù)。水的拉曼散射十分微弱，將實(shí)驗(yàn)樣品溶于水后基本不受其干擾，從而拉曼光譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于水溶性分子的研究中，獲得分子結(jié)構(gòu)和信息。從生物醫(yī)學(xué)角度，構(gòu)成細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸、脂類和糖類等大分子都是水溶性的，因此拉曼光譜適合于生物大分子的光譜研究，包括生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如分子基團(tuán)如氨基、羧基、芳環(huán)和二硫鍵等，其中值得注意的是，對(duì)于維持蛋白質(zhì)等生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)和化學(xué)功能具有重要意義的二硫鍵，在紅外吸收光譜中顯示很弱，而在拉曼散射光譜中卻有較強(qiáng)的信號(hào)。但是生物大分子的拉曼光譜也存在一個(gè)問題，散射截面很小，造成拉曼散射的強(qiáng)度就比較微弱，如果要獲得較強(qiáng)的拉曼光譜強(qiáng)度就需要通過提高激發(fā)光源的功率或者延長(zhǎng)取譜時(shí)間，而用大功率的激光光源照射樣品，往往會(huì)對(duì)樣品造成一定的損傷且易受到樣品本身自體熒光的干擾，從而影響到對(duì)光譜的檢測(cè)和分析，一定程度上限制了該項(xiàng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用和發(fā)展[5]。直到1974年，F(xiàn)leischmann等[6]觀測(cè)到在粗糙的銀電極表面吡啶分子上，獲得了高強(qiáng)度的拉曼散射信號(hào)，經(jīng)過檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)拉曼散射強(qiáng)度增大了106倍。而現(xiàn)在通過利用納米銀制備基底上觀測(cè)標(biāo)本的拉曼散射強(qiáng)度可獲得較常規(guī)拉曼光譜大幾萬甚至幾十萬倍的增益[7]，這就使得這種表面增強(qiáng)拉曼散射光譜技術(shù)可以成為研究生物大分子的重要手段[8]。

人體是由大量水分構(gòu)成，水分占到了體質(zhì)量的50%～80%，主要以體液形式存在，包括血液、尿液、唾液和淋巴液等以及存在于細(xì)胞質(zhì)中。體液檢測(cè)又以血液檢測(cè)應(yīng)用得最多，如對(duì)血液中低密度膽固醇含量的檢測(cè)可以判斷心血管方面的健康狀況，對(duì)血液中葡萄糖水平的檢測(cè)可以用于監(jiān)測(cè)糖尿病患者的狀況等。血液是由血漿和血細(xì)胞組成，血細(xì)胞包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板，血漿中的水占到了90%～92%，其余為血漿蛋白，血漿蛋白以白蛋白、球蛋白和纖維蛋白為主，并且這3類蛋白都為親水膠體。除此以外，血漿中還含有游離態(tài)DNA、無機(jī)鹽、脂肪、糖類和激素等化學(xué)成分，這些成分的變化都可以反映機(jī)體的健康狀況。但在利用血漿進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，往往需要加入抗凝劑，造成一些干擾。血細(xì)胞中以紅細(xì)胞為主，紅細(xì)胞中富含血紅蛋白，占到了細(xì)胞質(zhì)量的32%，脂類、糖類和各種電介質(zhì)占4%，其余為水。血紅蛋白有珠蛋白和亞鐵蛋白組成，血紅蛋白在氧濃度高的地方與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白，在氧濃度低的地方與氧脫離，變?yōu)檫€原血紅蛋白。另外，在對(duì)血液檢測(cè)中，經(jīng)常會(huì)提取血清進(jìn)行分析，血清是新鮮血液在不加入任何抗凝劑的情況下，自然凝固后分離出的淡黃色透明液體，也可通過血漿去除纖維蛋白原而獲得。運(yùn)用血清檢測(cè)最大的好處就是可以避免抗凝劑的干擾。血清中包含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、無機(jī)鹽和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分以及抗體(免疫球蛋白)。因此通過對(duì)血液樣品的成分檢測(cè)可以獲得大量關(guān)于生物大分子及其基團(tuán)的振動(dòng)光譜信息，這些信息可以反映人體在癌變過程中生物分子在構(gòu)象和數(shù)量上發(fā)生的某種變化，從而在生物醫(yī)學(xué)上有著重要的意義。

1 以血液為樣本的相關(guān)研究

1.1 血清樣本研究 葉慧帆等[9]對(duì)20例卵巢癌患者的血清樣本通過激光共聚焦顯微拉曼光譜儀進(jìn)行光譜研究，并與健康志愿者進(jìn)行對(duì)比分析。兩組血清樣本的光譜分別取平均值后，在同一圖層中可以進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的光譜形態(tài)和譜峰基本相似，但在有些譜峰位置，卵巢癌患者的拉曼光譜強(qiáng)度明顯要低于健康人，這些譜峰位于1 010、1 158、1 283、1 520、1 646、2 307和2 661 cm-1拉曼位移處[9]；而在除此之外的其他譜峰實(shí)驗(yàn)組血清的拉曼光譜強(qiáng)度又均高于健康人的。潘建基等[10]在對(duì)血清拉曼光譜研究中發(fā)現(xiàn)在900～1 000 cm-1和1 600～1 700 cm-1的兩個(gè)區(qū)間，實(shí)驗(yàn)組鼻咽癌患者血清的拉曼光譜強(qiáng)度要低于對(duì)照組的；但在1 200～1 400 cm-1處，對(duì)照組血清的拉曼光譜強(qiáng)度又要低于實(shí)驗(yàn)組鼻咽癌患者[10]。利用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組鼻咽癌患者與對(duì)照組進(jìn)行主成分分析，經(jīng)過處理后，在兩組光譜中獲得7個(gè)主成分得分，選取具有顯著差異的主成分進(jìn)行判別分析，可得出兩組血清樣品的靈敏度為89.7%，特異性為91.7%，總判別正確率為90.7%。劉仁明等[11]對(duì)肝癌患者血清的研究表明，實(shí)驗(yàn)組肝癌患者血清的拉曼光譜在有些譜峰位置相對(duì)于對(duì)照組變得很微弱,甚至消失，這些位置位于630 、720 、812 和1 578 cm-1處[11]，另外在實(shí)驗(yàn)組中有幾個(gè)譜峰相對(duì)于對(duì)照組發(fā)生了一定的頻移，比較明顯的在1 130 cm-1和1 204 cm-1處的譜峰，肝癌患者就分別藍(lán)移到1 135 cm-1和1 269 cm-1處，除此之外，實(shí)驗(yàn)組在558 cm-1附近出現(xiàn)了一個(gè)新的譜峰，可作為肝癌患者的特征峰來考慮。

1.2 血漿樣本研究 馮尚源等[12]通過對(duì)采集來的32例胃癌患者的新鮮血液加入抗凝劑后，離心去除血細(xì)胞后獲得血漿樣本進(jìn)行拉曼光譜研究。通過實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的拉曼光譜的比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組胃癌患者血漿的拉曼光譜存在著3個(gè)譜峰強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，這些譜峰分別位于1 330、1 445、1 580 cm-1。通過對(duì)譜峰歸屬的進(jìn)一步研究，1 330 cm-1的譜峰歸屬于血漿中游離態(tài)的核酸，說明胃癌患者血漿中的核酸相對(duì)于健康人要高，從而可以用來檢測(cè)癌癥的發(fā)生與發(fā)展。而1 445 cm-1譜峰則歸屬于膠原或磷脂C-H 鍵的彎曲振動(dòng)，在相關(guān)研究文獻(xiàn)中，該譜峰曾作為胃癌患者的特征峰來考慮[12]。1 580 cm-1的譜峰則歸屬于苯基丙氨酸C=C 的彎曲振動(dòng)，表面實(shí)驗(yàn)組胃癌患者血漿中的苯基丙氨酸相對(duì)于健康人要高。但在其他5個(gè)譜峰位置，胃癌患者血漿的拉曼光譜強(qiáng)度明顯要低于健康人對(duì)照組，這些譜峰位于589、638、813、1 134 cm-1處[12]。這些譜峰主要?dú)w屬于糖類和氨基酸，說明胃癌患者在癌變過程中造成體內(nèi)糖類和氨基酸的消耗比較大，造成血漿中的含量減少。再利用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可獲得診斷特異性與靈敏度可以分別為到91%與79.5%，總判別正確率為85.2%。

1.3 血細(xì)胞樣本研究 喬世寶等[13]對(duì)7例白血病患者血液中的紅細(xì)胞的拉曼光譜進(jìn)行研究，通過實(shí)驗(yàn)組白血病患者紅細(xì)胞與健康人的拉曼光譜的對(duì)照發(fā)現(xiàn)，兩組光譜具有八個(gè)明顯的譜峰，其中位于1 385 cm-1的譜峰，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組強(qiáng)度明顯減弱甚至消失，而1 425 cm-1的譜峰卻變寬，變強(qiáng)。周雪等[14]應(yīng)用血紅蛋白的拉曼光譜進(jìn)行食管癌診斷的研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組食管癌患者的光譜強(qiáng)度相對(duì)于健康人要弱，特別是在位于1 562 cm-1譜峰處；另外，對(duì)照組血紅蛋白拉曼光譜在1 639 cm-1處的光譜強(qiáng)度明顯比1 591 cm-1處要大，而對(duì)于實(shí)驗(yàn)組食管癌患者來說，這兩處譜峰的強(qiáng)度非常接近。

熊洋等[15]通過與遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院及其附屬醫(yī)院合作，利用宮頸癌患者的氧合血紅蛋白開展基于表面增強(qiáng)拉曼散射的光譜研究。圖1為兩組氧合血紅蛋白平均拉曼光譜A及經(jīng)過平滑處理后B的對(duì)比圖，可以看出光譜主要存在9個(gè)譜峰，但實(shí)驗(yàn)組宮頸癌患者的譜峰強(qiáng)度明顯要比健康人要弱，并且在662、720和815 cm-1的位置，實(shí)驗(yàn)組的譜峰基本消失；除此之外，實(shí)驗(yàn)組的一些譜峰相對(duì)于對(duì)照組來說也發(fā)生了較明顯的頻移。采用SPSS軟件的PCA分析結(jié)合獨(dú)立變量T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法得到最具差異的3個(gè)PCA得分PC1、PC1和PC3[15]，利用此3個(gè)PCA得分做出的SERS光譜PCA得分三維散點(diǎn)圖可以很好的區(qū)分健康女性和宮頸癌患者，診斷的特異性與靈敏度[16]都分別為81.8%和86.4%，總判別正確率為84.1%。

圖1 對(duì)照組(a)和實(shí)驗(yàn)組(b)的氧合血紅蛋白平均 SERS光譜對(duì)比圖

2 展 望

通過對(duì)人體血液樣本中血清、血漿和紅細(xì)胞拉曼光譜的研究等方面做了綜述，表明拉曼光譜技術(shù)在臨床上檢測(cè)早期癌癥具有一定的發(fā)展前景。由于血液樣品包含有大量有關(guān)人體健康狀況的生物大分子信息且易于采集，決定了通過利用血液的拉曼光譜分析可以篩查癌癥的可行性。但該項(xiàng)技術(shù)整體還處于分散實(shí)驗(yàn)研究階段，沒有形成統(tǒng)一的技術(shù)、篩查和診斷標(biāo)準(zhǔn)。隨著拉曼光譜技術(shù)的不斷成熟和完善，該項(xiàng)技術(shù)將會(huì)有重大突破。目前對(duì)生物大分子的拉曼光譜研究一般都需要采用表面增強(qiáng)技術(shù)，也就是自制表面增強(qiáng)基底，基底的自制主要采用一些納米級(jí)的金屬微粒子，如金、銀等吸附在載玻片上，然后再對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。但對(duì)最適合于水溶生物大分子的表面增強(qiáng)基質(zhì)沒有統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。最重要的是由于該研究處于分散研究狀況，采用的樣品獨(dú)立，癌癥類型獨(dú)立，研究方法也有差異，采集的實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)獨(dú)立且很分散，光譜研究人員不能和臨床醫(yī)院開展大數(shù)據(jù)的采集研究，形成具有真正價(jià)值的數(shù)據(jù)庫及診斷標(biāo)準(zhǔn)。從臨床診斷上，拉曼光譜技術(shù)篩查與其他臨床診斷技術(shù)相結(jié)合，全面完整地解析癌癥信息，充分發(fā)揮其簡(jiǎn)便、快捷、無損的特點(diǎn)，可以作為癌癥早期篩查的重要手段。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.038

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460204)；遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動(dòng)基金(F-638)。 作者簡(jiǎn)介：張明(1980-)，副教授，碩士，主要從事生物醫(yī)學(xué)光譜學(xué)方面的研究。△

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