芒柄花黃素對人胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及機(jī)制研究*

董陳誠,鐘 漓,張廣鈺,王振冉,冉福林,陳 霄

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西桂林 541002)

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論著·基礎(chǔ)研究

芒柄花黃素對人胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及機(jī)制研究*

董陳誠,鐘 漓△,張廣鈺,王振冉,冉福林,陳 霄

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西桂林 541002)

目的 研究芒柄花黃素對人胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及作用機(jī)制。方法 建立人胃癌MKN-45細(xì)胞荷瘤裸鼠癌癥模型，經(jīng)環(huán)磷酰胺(20mg/kg)和芒柄花黃素(10、20、40mg/kg)干預(yù)14d，觀察荷瘤重量變化及應(yīng)用TUNEL染色評估荷瘤組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量，并用蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測荷瘤內(nèi)源性p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及細(xì)胞周期蛋白(CyclinD)表達(dá)。結(jié)果 與模型對照組比較，芒柄花黃素明顯抑制胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤的生長(P<0.01)，并且腫瘤組織中細(xì)胞凋亡計數(shù)增加(P<0.01)。同時，芒柄花黃素干預(yù)組腫瘤組織中的p38MAPK蛋白表達(dá)增加,CyclinD蛋白水平減少 (P<0.01)。結(jié)論 芒柄花黃素具有明顯抑制胃癌細(xì)胞MKN-45增殖作用，其機(jī)制與激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

芒柄花黃素；胃腫瘤；細(xì)胞凋亡

胃癌病死率較高，是僅次于食道癌的常見惡性腫瘤之一[1]。當(dāng)前，胃癌治療一般采用手術(shù)、放射或化學(xué)療法，但進(jìn)展期胃癌的單純手術(shù)治療可能會存在肉眼或鏡下殘留灶，使復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率大大增加[2]。目前臨床上使用的烷化劑類抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺，在肝微粒體酶系催化下代謝轉(zhuǎn)化為烷化作用更強(qiáng)的氯乙基磷酰胺，能發(fā)揮細(xì)胞毒作用而殺滅腫瘤細(xì)胞，但其有著毒副作用較大的缺點[3]。近年發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，因此抑制該信號通路是藥物抗癌作用的新導(dǎo)向[4]。芒柄花黃素，又名刺芒柄花素，具有抗癌藥理活性，可防治前列腺癌及乳腺癌等癌癥，同時具有降血脂和抗氧化作用[5]。本實驗首先建立人胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠動物模型，然后探討芒柄花黃素對胃腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性，進(jìn)而闡明其抗癌作用機(jī)制并為今后的臨床開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 MKN-45人胃癌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫。將MKN-45培育在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，150 U/mL青霉素和120 U/mL的鏈霉素)，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。雄性BALB/c裸鼠，18～20 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。動物飼養(yǎng)在良好的實驗控制環(huán)境中，標(biāo)準(zhǔn)化的飼料喂養(yǎng)和科學(xué)化的管理。

1.2 藥物與試劑 芒柄花黃素(純度大于98.0%)：上海佳和生物科技有限公司。環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。DMEM培養(yǎng)基：美國Gibico公司。胎牛血清：美國Gibico公司。胰蛋白酶：上海Sigma-Aldrich公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)研究所。DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺)染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。p38分裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)、細(xì)胞周期蛋白(CyclinD)及磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上海Sigma-Aldrich公司。蛋白裂解液:上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 HWS-150恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)。 Series8000 直熱式CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)。W-CJ-1CU雙人單面水平超凈工作臺(南京萊步儀器有限公司)。SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。 DM IRB(型號)倒置顯微鏡(德國Leica儀器有限公司)。ECL(電子化學(xué)發(fā)光)檢測系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司)。GelDoc 2000 伯樂凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 荷瘤動物與藥物干預(yù) 將0.1 mL無菌MKN-45細(xì)胞(3×107個/mL)皮下注射到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤生長情況。當(dāng)移植腫瘤長到直徑約20 mm時，MKN-45荷瘤裸鼠被分為5組：模型對照組，環(huán)磷酰胺(20 mg/kg)陽性組和芒柄花黃素(10、20、40 mg/kg)給藥組，每天腹腔注射1次，持續(xù)14 d。同時記錄實驗裸鼠體質(zhì)量(W)與腫瘤質(zhì)量，并計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(1-W給藥/W模型)×100%。

1.4.2 指標(biāo)檢測 分離皮下肝癌腫瘤組織，應(yīng)用TUNEL染色評估腫瘤組織中細(xì)胞凋亡數(shù)，并用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測腫瘤內(nèi)源性p38MAPK及CyclinD蛋白的表達(dá)。實驗步驟操作均按照試劑供應(yīng)商說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 芒柄花黃素對荷瘤裸鼠腫瘤增殖的影響 實驗結(jié)果表明，芒柄花黃素能抑制胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤的生長，隨著芒柄花黃素濃度的增加腫瘤質(zhì)量不斷減小，呈劑量依賴性，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 芒柄花黃素抑制MKN-45荷瘤裸鼠 腫瘤增殖

*：P<0.01，與對照組比較。

2.2 芒柄花黃素對荷瘤裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤組織中模型對照組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量較少。而芒柄花黃素(10、20、40mg/kg)組，TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)隨濃度逐漸增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 芒柄花黃素增加MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量

*：P<0.01，與對照組比較。

2.3 芒柄花黃素對荷瘤裸鼠腫瘤組織CyclinD及p38MAPK蛋白表達(dá)的影響Westernblot結(jié)果表明，MKN-45荷瘤裸鼠內(nèi)源性p38MAPK表達(dá)較低，處于抑制其表達(dá)狀態(tài)，而CyclinD蛋白表達(dá)較高。經(jīng)芒柄花黃素干預(yù)后，腫瘤組織中p38MAPK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而CyclinD蛋白水平明顯減少，與對照組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與對照組比較。

圖1 芒柄花黃素增加荷瘤裸鼠腫瘤組織p38MAPK水平及下調(diào)CyclinD表達(dá)

3 討 論

目前，胃癌的病因至今未被完全闡明，但與直接或長期破壞胃黏膜屏障導(dǎo)致促癌因子被激活有關(guān)[6]。在癌變發(fā)展中，癌細(xì)胞失控生長會逐漸形成惡性癌，并進(jìn)一步侵入附近組織[7]。目前的臨床化療藥物療效有限，并有很大的毒副作用。因此，尋找能抑制腫瘤生長并且高效低毒的藥物一直是近年研究的熱點。

在本研究中，以環(huán)磷酰胺和芒柄花黃素作用于MKN-45荷瘤裸鼠模型，結(jié)果相比MKN-45荷瘤裸鼠模型對照組，環(huán)磷酰胺和芒柄花黃素組的荷瘤裸鼠腫瘤組織減小，且腫瘤增殖抑制率與芒柄花黃素的劑量成正比，說明了芒柄花黃素能有效發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。在接下來的腫瘤組織TUNEL染色實驗中作者發(fā)現(xiàn)，MKN-45荷瘤裸鼠模型對照組TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)顯著減少，而環(huán)磷酰胺和芒柄花黃素組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量增多，并且呈劑量依賴性，這與上述實驗結(jié)果相一致，提示芒柄花黃素可能是通過誘導(dǎo)MKN-45細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。

研究表明，p38MAPK激活時發(fā)生核轉(zhuǎn)移，啟動蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，同時p38通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程通過細(xì)胞周期起作用，因此p38信號通路與細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[8]。而CyclinD是調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白之一，當(dāng)其過度表達(dá)可縮短G1期，并減少細(xì)胞對生長因子的依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)較高，同時其陽性表達(dá)與癌癥的惡性程度呈正相關(guān)性，其中CyclinD通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)MAPK途徑發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移趨勢[9]。因此，調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號通路或減少CyclinD表達(dá)有助于控制胃癌的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。本研究的實驗結(jié)果與以上的研究成果是相一致的。本研究中，經(jīng)10、20、40mg/kg濃度的芒柄花黃素干預(yù)后，裸鼠腫瘤組織中p38MAPK蛋白水平明顯上調(diào)，而CyclinD蛋白水平降低，腫瘤增殖受到明顯抑制，因此筆者推測芒柄花黃素抑制胃癌細(xì)胞MKN-45增殖活性與激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，通過本研究，證明了芒柄花黃素能抑制胃癌細(xì)胞MKN-45生長，其作用機(jī)制與激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，為下一步臨床應(yīng)用于胃癌的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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Inhibitory effect and mechanism of formononetin on nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45*

DongChencheng,ZhongLi△,ZhangGuangyu,WangZhenran,RanFulin,ChenXiao

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity，Guilin，Guangxi541002，China)

Objective To investigate the inhibitory effect of formononetin on the nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45 and its possible mechanism.Methods The nude mouse cancer model bearing human gastric cancer cells MKN-45 was established.Then the weight change of tumor bearing mouse was observed after 14 d intervention by 20 mg/kg of cyclophosphamide and 10,20,40 mg/kg of formononetin.The cellular apoptosis count was evaluated by using the TUNEL staining method.The endogenous p38MAPK and CyclinD protein expressions in tumor tissue were determined through the Western blot assay.Results Compared with model control group,formononetin significantly inhibited the growth of nude mouse bearing gastric cancer cells MKN-45 (P<0.01),moreover the cellular apoptotic count was increased (P<0.01).Meanwhile,expression of P38MAPK protein in the tumor tissue of formononetin intervention group was increased and the CyclinD protein level was decreased (P<0.01).Conclusion Formononetin has obviously inhibitory effect on the proliferation of gastric cancer cells MKN-45,its mechanism may be related with the activation of intracellular MAPK signal transduction pathway and inducing cellular apoptosis.

formononetin;gastric neoplasms;cellular apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.006

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(LX2014270)。 作者簡介：董陳誠(1981-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事胃腸腫瘤外科的研究?！?/p>

E-mail：zhongli0302@163.com。

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A

1671-8348(2016)32-4482-02

2016-05-18

2016-08-06)