25羥維生素D3與抗菌肽在反復(fù)上呼吸道感染中的作用研究及相關(guān)性分析*

羅光燕,楊小瓊,張 蕓,王孝蕓,袁謝芳,王 星,李國平，△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實驗室，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,四川瀘州 646000)

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論著·臨床研究

25羥維生素D3與抗菌肽在反復(fù)上呼吸道感染中的作用研究及相關(guān)性分析*

羅光燕1，2,楊小瓊3,張 蕓3,王孝蕓2,袁謝芳2,王 星2,李國平2，3△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實驗室，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,四川瀘州 646000)

目的 探討25羥維生素D3與抗菌肽在反復(fù)上呼吸道感染的作用。方法 選擇連續(xù)3年就診的上呼吸道感染患者，其中，1年上呼吸道感染次數(shù)大于或等于2次患者46例，男20例，女26例，平均(32.35±9.10)歲；選擇15例人作為對照組，平均(31.35±10.20)歲，對照組在年齡上與上呼吸道感染患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測外周血血清中25羥維生素D3水平和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平并做相關(guān)性分析。用人氣道上皮細(xì)胞株分析25羥維生素D3對抗菌肽LL-37水平影響。結(jié)果 反復(fù)上呼吸道感染患者外周血血清25羥維生素D3水平低于對照組(P<0.05)，并且反復(fù)上呼吸道感染患者誘導(dǎo)痰上清液人抗菌肽LL-37水平低于對照組(P<0.05)。上呼吸道感染平均次數(shù)與上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.54，P<0.05)，上呼吸道感染平均次數(shù)與誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.65，P<0.05)，上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)談上清液抗菌肽LL-37水平呈正相關(guān)(r=0.59，P<0.05)。體外細(xì)胞實驗顯示1,25羥維生素D3能上調(diào)上皮細(xì)胞抗菌肽LL-37表達(dá)。結(jié)論 25羥維生素D3的缺乏可能是上呼吸道反復(fù)感染患抗菌肽LL-37的表達(dá)下調(diào)的重要原因。

反復(fù)上呼吸道感染；25羥維生素D3；抗菌肽LL-37

上呼吸道感染是常見疾病呼吸系統(tǒng)疾病，其常見病原微生物多為鼻病毒、腺病毒、流感病毒、副流感病毒，腸病毒和呼吸道合胞病毒等，細(xì)菌感染多繼發(fā)于病毒感染。研究表明血清25羥維生素D3缺乏與反復(fù)呼吸道感染有關(guān)，25羥維生素D3水平與肺部感染和肺功能下降存在明顯相關(guān)性[1]。維生素D3補充能有效減少上呼吸道感染反復(fù)發(fā)生。新生兒25羥維生素D3缺乏明顯增加上呼吸道感染次數(shù)和風(fēng)險，孕婦補充25羥維生素D3有助于減低反復(fù)上呼吸道感染風(fēng)險[2]。呼吸道感染發(fā)生同樣與肺部固有免疫有關(guān)，已有研究表明抗菌肽LL-37是固有免疫的重要效應(yīng)分子[3]。25羥維生素D3通過維生素D受體調(diào)節(jié)固有免疫，促進(jìn)抗菌肽LL-37的表達(dá)，從而增強機(jī)體的抗感染能力。25羥維生素D3能誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)，然而在上呼吸道反復(fù)感染中，維生素D與LL-37的相關(guān)性仍不明確[4-7]。故筆者通過分析上呼吸道反復(fù)感染患者外周血血清中25羥維生素D3水平和誘導(dǎo)痰上清液人抗菌肽LL-37水平，分析其相關(guān)性，以探討25羥維生素D3、LL-37之間相關(guān)性和上呼吸道反復(fù)感染之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共收集2011年6月至2014年1月在西南醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生科就診上呼吸道感染患者1988例，男896例，女1092例，平均(35.24±10.88)歲，均為選取連續(xù)3年在本科就診的上呼吸道感染患者。其中，1年上呼吸道感染次數(shù)大于或等于2次患者46例(感染組)，男20例，女26例，平均(32.35±9.10)歲。上呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)起病急，并伴有發(fā)熱、咳嗽、流鼻涕、鼻塞，噴嚏等癥狀；(2)體格檢查僅發(fā)現(xiàn)咽部充血和或扁桃體腫大；(3)外周血白細(xì)胞計數(shù)及分類正常或偏低、或偏高。選取15例健康人作為對照組，男7例，女8例，平均(31.35±10.20)歲。對照組在年齡與上呼吸道感染患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。全部上呼吸道感染組患者均不伴有其他免疫功能受影響的疾病。

1.2 方法

1.2.1 反復(fù)呼吸道感染次數(shù) 根據(jù)患者近3年發(fā)生上呼吸道感染次數(shù)，取平均值統(tǒng)計。

1.2.2 標(biāo)本收集與處理 抽取空腹靜脈血，分離血清，-70℃保存；用4%氯化鈉溶液霧化吸入5～10min，痰液收集于無菌容器中，保存于4℃冰箱。在1h內(nèi)處理，加入4倍重量的0.1%二硫蘇糖醇(DTT)，置于37℃水浴箱5min，吹打致黏液完全溶解，2500r/min離心10min，上清液置于-70℃保存。

1.2.3 細(xì)胞實驗 選取人氣道上皮細(xì)胞株(16HBE，本實驗室保存)，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)，25羥維生素D3(10nmol/L)刺激細(xì)胞24h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。實驗均重復(fù)3次。對照組用25羥維生素D3抑制劑-伊曲康唑預(yù)處理2h后，用25羥維生素D3(10nmol/L)刺激細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞蛋白和總RNA的提取及濃度測定 刺激細(xì)胞24h后，棄去培養(yǎng)基，無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞于無菌EP管中，用細(xì)胞裂解液或RNA提取試劑盒(RNAfast200試劑盒)，按照說明書提取蛋白和RNA。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 采用ELISA檢測外周血血清中25羥維生素D3水平，人抗菌肽LL-37水平， 25羥維生素D3ELISA試劑盒購于德國IBL公司，人抗菌肽ELISA試劑盒購于美國RD公司。實驗方法參照說明書。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測細(xì)胞LL-37的mRNA水平 LL-37引物上游為：5′-GTC ACC AGA GGA TTG TGA CTT CAA-3′，下游引物為5′-TTG AGG GTC ACT GTC CCC ATA-3′。內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物為：5′-GGA GTC AAC GGA TTT GGT CGT A-3′；下游為5′-GCA ACA ATA TCC ACT TTA CCA GAG TTA A-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。用鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)使用oligo dT引物擴(kuò)增cDNA,LL-37引物和GAPDH引物完成 PCR 實驗，GAPDH作為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1 兩組25羥維生素D3和抗菌肽LL-37水平比較 外周血血清25羥維生素D3水平位為(39.94±10.20)ng/mL,對照組為(65.60±9.20)ng/mL，反復(fù)上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3水平位低于對照組(P<0.05)。反復(fù)上呼吸道感染患者誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平為(8.90±0.54)μg/mL,對照組為(30.12±0.98)μg/mL,反復(fù)上呼吸道感染患者誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 兩組外周血25羥維生素D3和抗菌肽LL-37水平比較

2.2 感染組外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平與反復(fù)上呼吸道感染的相關(guān)性分析 46例連續(xù)3年在本科就診的上呼吸道感染患者，3年內(nèi)上呼吸道感染總次數(shù)除以3為3年內(nèi)上呼吸道感染平均次數(shù)，上呼吸道感染平均次數(shù)與上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.54,P<0.05);上呼吸道感染平均次數(shù)與誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.65,P<0.05)，見圖1。

圖1 25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平與反復(fù)上呼吸道感染相關(guān)性分析

2.3 感染組外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平相關(guān)性分析 反復(fù)上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平相關(guān)性分析(r=0.59，P<0.05),表明反復(fù)上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清抗菌肽LL-37水平呈正相關(guān)，見圖2。

圖2 外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平相關(guān)性分析

2.4 25羥維生素D3上調(diào)抗菌肽LL-37的表達(dá) 為進(jìn)一步分析25羥維生素D3對抗菌肽LL-37表達(dá)影響，選取氣道上皮細(xì)胞株16HBE，用25羥維生素D3刺激人支氣管上皮細(xì)胞后，收集細(xì)胞提取總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄,通過ELISA測定LL-37蛋白濃度和RT-PCR檢測LL-37的mRNA表達(dá)。與PBS相比，25羥維生素D3能顯著增加IL-37蛋白濃度(P<0.05)，同時能增加LL-37mRNA水平(P<0.05)，而25羥維生素D3抑制劑能降低25羥維生素D3誘導(dǎo)的IL-37蛋白濃度和LL-37mRNA水平。

3 討 論

反復(fù)上呼吸道感染是常見疾病呼吸系統(tǒng)疾病，病因復(fù)雜，其臨床特點為反復(fù)上呼吸道感染，病程較長，缺乏特殊的治療方法。近年研究表明，呼吸道反復(fù)感染與維生素D缺乏有明顯相關(guān)性[1]。抗菌肽LL-37作為維生素D受體信號通路的下游分子，其在機(jī)體抗感染方面的作用得到了格外關(guān)注，然而抗菌肽LL-37在上呼吸道反復(fù)感染中的作用尚不明確[8-9]。本研究比較了呼吸道反復(fù)感染患者和健康人群25羥維生素D3與抗菌肽LL-37的水平，并分析了反復(fù)上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平與反復(fù)上呼吸道感染的相關(guān)性。結(jié)果顯示，反復(fù)上呼吸道感染患者外周血血清25羥維生素D3水平顯著低于對照組，上呼吸道感染平均次數(shù)與上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3呈負(fù)相關(guān)，表明血清25羥維生素D3缺乏可能與反復(fù)呼吸道感染有關(guān)，進(jìn)一步驗證了血清25羥維生素D3在抗感染中的作用。

抗菌肽LL-37在腸道、氣道、皮膚等處表達(dá)形成抵抗細(xì)菌的第1道防線[10]。其表達(dá)調(diào)控具有復(fù)雜的機(jī)制，且在不同的細(xì)胞類型和環(huán)境中其表達(dá)受到不同的調(diào)控，維生素D受體直接調(diào)節(jié)抗菌肽表達(dá)，25羥維生素D3顯著上調(diào)骨髓細(xì)胞抗菌肽表達(dá)[10-12]。已有研究表明，抗菌肽LL-37作為固有免疫的效應(yīng)分子和執(zhí)行分子，特別是在炎癥和受傷的部位其表達(dá)受促炎細(xì)胞因子，細(xì)胞因子，細(xì)菌產(chǎn)物等一系列刺激因素的上調(diào)[13]。研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)上呼吸道感染患者誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平顯著低于對照組，上呼吸道感染平均次數(shù)與誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果提示，上呼吸道反復(fù)感染導(dǎo)致的抗菌肽LL-37水平顯著降低可能是患者反復(fù)呼吸道感染的重要因素。

此外，已有研究表明，維生素D的活性形式25羥維生素D3是抗菌肽的潛在誘導(dǎo)因子，其可通過與維生素D受體結(jié)合，促進(jìn)抗菌肽的表達(dá)[14-15]。而本研究結(jié)果顯示，反復(fù)上呼吸道感染患者外周血25羥維生素D3和誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平呈正相關(guān)，表明25羥維生素D3的缺乏引起抗菌肽LL-37的水平降低。25羥維生素D3缺乏引起的上呼吸道反復(fù)感染患者，25羥維生素D3缺乏降低維生素D-維生素D受體信號通路促進(jìn)抗菌肽LL-37的表達(dá)。同時通過細(xì)胞實驗進(jìn)一步分析表明25羥維生素D3能上調(diào)抗菌肽LL-37表達(dá)。

本研究揭示了血清25羥維生素D3缺乏與反復(fù)呼吸道感染之間的聯(lián)系。同時，本研究發(fā)現(xiàn)在上呼吸道反復(fù)感染中，25羥維生素D3的缺乏是抗菌肽LL-37的表達(dá)下調(diào)的直接原因。然而，上呼吸道反復(fù)感染患者誘導(dǎo)痰上清液抗菌肽LL-37水平顯著升高的機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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The role and correlation analysis between 25-hydroxy vitamin D3and human cathelicidin in recurrent upper respiratory infection*

Luo Guangyan1，2,Yang Xiaoqiong3,Zhang Yun3,Wang Xiaoyun2,Yuan Xiefang2,Wang Xing2,Li Guoping2,3△

(1.Hygiene Section,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Inflammation & AllergicDiseases Research Unit,First Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;3.Department of Respiratory,First Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective 25-hydroxy vitamin D3as a key innate immune signaling,which can promote the expression of antimicrobial peptide LL-37.This study was to explore the role of 25-hydroxy vitamin D3and LL-37in the recurrent upper respiratory tract infection.Methods The patients with upper respiratory tract infection in our department for three consecutive years were selected.The prevalence frequencies of 46patients with upper respiratory tract infection were greater than or equal to two times one year (20male patients and 26female patients).The average age was (32.35±9.10)years old.15cases of healthy people were regards as a control group,and the average age was (31.35±10.20)years old.The age was no significant difference between the patient with upper respiratory tract infection and control group(P>0.05).The level of 25-hydroxy vitamin D3and human antimicrobial peptide LL-37in peripheral blood serum and supernatant of induced sputum were detected with ELISA.The correlation analysis was done with SPSS software.The effect of 25hydroxy vitamin D3on the level of LL-37in the antimicrobial peptide were analyzed by human airway epithelial cell line.Results The levels of 25-hydroxy vitamin D3from peripheral blood serum in patients with upper respiratory tract infection were significantly lower than the healthy control group(P<0.05).The levels of LL-37in patients with upper respiratory tract infection were significantly decreased,compared with healthy control group(P<0.05).The prevalence frequencies of upper respiratory tract infection were negatively correlated with the levels of 25-hydroxy vitamin D3(r=-0.54,P<0.05),and prevalence frequencies of upper respiratory tract infection were also negatively associated with levels of antimicrobial peptide LL-37(r=-0.65,P<0.05).The levels of 25-hydroxy vitamin D3were positively correlated with levels of antimicrobial peptide LL-37(r=0.59，P<0.05).In vitro cell experiments showed that 25-hydroxy vitamin D3upregulated the expression of LL-37in cells.Conclusion 25-hydroxy vitamin D3deficiency may down-regulate antimicrobial peptide LL-37in recurrent upper respiratory tract infection.

recurrent upper respiratory tract infection；25-dihydroxy vitamin D3；LL-37

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.007

國家自然科學(xué)基金資助項目(81170032)。 作者簡介：羅光燕(1968-),主治醫(yī)師，本科，主要從事呼吸疾病基礎(chǔ)與臨床研究。△

R562.2+1

A

1671-8348(2016)29-4053-03

2016-02-25

2016-04-13)