Wnt/β-catenin信號通路在腎缺血再灌注致慢性腎間質(zhì)纖維化大鼠中的表達(dá)

閔亞麗，黃 健，楊 靜，劉 暢，于 黔

(貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科 550002)

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Wnt/β-catenin信號通路在腎缺血再灌注致慢性腎間質(zhì)纖維化大鼠中的表達(dá)

閔亞麗，黃 健，楊 靜，劉 暢，于 黔

(貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科 550002)

目的 觀察Wnt/β-catenin信號通路在腎缺血再灌注(IRI)致慢性腎間質(zhì)纖維化大鼠模型中的表達(dá)。方法 將SD大鼠分為3組，即假手術(shù)組(Sham組)及IRI 7d組、IRI 14d組。分離左側(cè)腎動脈，IRI組用無創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)腎動脈，35min后去除血管夾；假手術(shù)組不夾閉左側(cè)腎動脈。IRI 7d組與IRI 14d組分別于術(shù)后第6、13天切除右側(cè)腎，分別于第7、14天處死大鼠。觀察比較3組大鼠腎功能，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測3組腎組織β-catenin、纖維連接蛋白(Fibronectin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的蛋白表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)觀察β-catenin表達(dá)部位，生化染色檢測膠原含量，Masson染色觀察比較3組病理改變。 結(jié)果 與Sham組相比，IRI 7d組Fibronectin、α-SMA、膠原含量無明顯增高，病理無明顯腎小管間質(zhì)纖維化;而IRI 14d組Fibronectin、α-SMA的蛋白表達(dá)水平則明顯增高，膠原含量增多，腎功能減退，病理顯示腎小管間質(zhì)纖維化。與Sham組相比，IRI 7d組β-catenin表達(dá)增高，IRI 14d組較IRI 7d組增高更顯著。結(jié)論 Wnt/β-catenin信號通路可能在腎IRI致慢性腎間質(zhì)纖維化病程中發(fā)揮一定作用。

Wnt/β-catenin信號通路；腎缺血再灌注；慢性腎間質(zhì)纖維化

嚴(yán)重的腎缺血再灌注(ischemia reperfusion injury，IRI)損傷不僅可引起急性腎功能衰竭,也可以導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。腎IRI損傷是腎移植時不可避免的病理損傷過程，可導(dǎo)致急性腎小管壞死，排斥反應(yīng)增加，最終可引起移植器官功能減退及衰竭。而隨著腎移植、心血管疾病、血管手術(shù)的增多，IRI致腎小管間質(zhì)纖維化的趨勢也逐年增多，探討其發(fā)病機(jī)制及防治措施日益受到重視。Wnt/β-catenin信號通路在多種原因?qū)е碌哪I纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注引起急性腎損傷時Wnt/β-catenin信號通路被激活，并可能參與了腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)，但在IRI所致慢性腎間質(zhì)纖維化中的作用研究甚少[1]。因此，筆者觀察了不同時間Wnt/β-catenin信號通路在IRI致腎小管間質(zhì)纖維化大鼠模型中的表達(dá)，探討其作用機(jī)制及可能的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 選用雄性SD大鼠20只(購自于貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心),體質(zhì)量180～200g,分為假手術(shù)組(Sham組,n=6)、腎IRI 7d組(IRI 7d組，n=7)、腎IRI 14d組(IRI 14d組，n=7)。以5%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉。IRI兩組游離后用無創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)腎動脈，35min后去除血管夾，縫合傷口，常規(guī)喂養(yǎng)，IRI 7d組及IRI 14d組分別在術(shù)后第6、13天切除右腎，分別在術(shù)后第7、14天處死大鼠。處死前腹主動脈取血，分離血清，測定血肌酐。留取左腎組織部分置于4%甲醛溶液固定后用于病理切片染色，部分放入-80℃低溫凍存冰箱以備提蛋白及做冰凍切片。Sham組游離左側(cè)腎動脈但不夾閉，第13天切除右腎，第14天處死留取血清及左腎組織。

1.2 方法

1.2.1 腎功能測定 大鼠處死前下腔靜脈穿刺采血，分離血清，測定血清肌酐(Scr)水平，檢測儀器為全自動生化儀。

1.2.2 腎臟組織學(xué)檢查 腎組織經(jīng)10%中性緩沖甲醛過夜，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度3μm)后，Masson染色分析。

1.2.3 腎臟免疫組織化學(xué) 采用ABC法檢測β-catenin的表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟，3% H2O2室溫孵育10min，浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)20min，牛血清封閉20min，滴加β-catenin Ⅰ抗(Santa Cruz)，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，Ⅱ抗孵育1h，加入ABC復(fù)合物，暗室孵育30min,沖洗后加入顯色液，顯色10～30min，顯微鏡下觀察，蘇木素襯染，封片。同時采用PBS代替一抗作為對照。

1.2.4 生化染色法檢測 采用天狼猩紅/快速綠色膠原染色試劑盒檢測膠原含量。10μm厚冰凍切片，PBS洗后，按試劑盒說明書操作，檢測光密度(OD)540及OD605值，公式計算組織膠原量及非膠原量，計算膠原量所占百分比。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液提取腎臟總蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，每條泳道30μg蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別加多克隆鼠抗β-catenin(Santa Cruz,1∶2000)、Fibronectin( Santa Cruz,1∶1000)、α-SMA(Santa Cruz,1∶10000)和Tubulin(上?？党桑?∶10000)等，Ⅰ抗4℃孵育過夜。洗膜后，再加辣根過氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，并曝光于X線片上，計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析條帶的相對吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 血清肌酐 Sham組與IRI 7d組Scr比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而IRI 14d組Scr明顯高于Sham組與IRI 7d組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠血清Scr、膠原的比較

2.2 腎臟組織Masson染色觀察 各組腎小球未見明顯異常，IRI 14d組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，間質(zhì)區(qū)增寬、部分膠原纖維沉積，少量炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化。而Sham組與IRI 7d組比較無差異，見圖1。

2.3 β-catenin免疫組織化學(xué) Sham組β-catenin在腎間質(zhì)只有少量表達(dá)。IRI 7d組與Sham組相比β-catenin表達(dá)增多。IRI 14d組與Sham組、IRI 7d組相比可見β-catenin在腎間質(zhì)表達(dá)數(shù)量明顯增多，見圖2。

A:Sham組；B：IRI 7d組；C：IRI 14d組

A:Sham組；B：IRI 7d組；C：IRI 14d組

2.4 膠原含量 與Sham組及IRI 7d組比較，IRI 14d組膠原含量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Sham組與IRI 7d組膠原含量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.5 Western blot檢測β-catenin、Fibronectin、α-SMA的蛋白表達(dá)水平 Sham組β-catenin、Fibronectin、α-SMA僅有微量表達(dá)。IRI 7d組β-catenin較Sham組有所增高(P<0.05)，IRI 14d組β-catenin較IRI 7d組增高更加顯著(P<0.05)。Sham組與IRI 7d組Fibronectin、α-SMA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與Sham組及IRI 7d組相比，IRI 14d組Fibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 3組大鼠β-catenin、Fibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)

表2 3組大鼠β-catenin、Fibronectin、α-SMA的蛋白水平比較

3 討 論

腎IRI損傷的大部分研究集中在急性腎損傷，其致慢性腎小管間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制研究很少。近年來，隨著腎移植手術(shù)、心血管疾病的增多，腎IRI導(dǎo)致的慢性腎損傷也逐漸增多并受到重視，因此，在本實(shí)驗中采用腎IRI致腎間質(zhì)纖維化大鼠模型來探討其可能的發(fā)病機(jī)制及防治措施。

α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，后者是成纖維細(xì)胞的活化形式，也是細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原成分的重要來源。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)的主要蛋白質(zhì)成分，膠原含量多少可以直接反應(yīng)腎纖維化程度的輕重。筆者將α-SMA、膠原、纖維連接蛋白作為提示腎小管間質(zhì)纖維化的指標(biāo)來觀察IRI術(shù)后不同時間腎臟的病理改變。以前的動物實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重IRI所誘發(fā)的小管間質(zhì)病變不能完全逆轉(zhuǎn)，會進(jìn)展為慢性的小管間質(zhì)纖維化，并伴隨腎小管濃縮功能的下降和蛋白尿的發(fā)生[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腎功能衰竭的存活病例遺留有不同程度的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害[3]。蔣素華等[4]觀察到持續(xù)夾閉大鼠兩側(cè)腎蒂40min造成腎臟缺血，5周后出現(xiàn)了較明顯的腎小管間質(zhì)纖維化病變。本研究發(fā)現(xiàn)：IRI術(shù)后7d腎功能與病理改變均與Sham組相似，F(xiàn)ibronectin、α-SMA的蛋白水平表達(dá)與Sham組相比亦無明顯增高，但I(xiàn)RI 14d組血Scr明顯升高，病理改變提示腎小管間質(zhì)纖維化，F(xiàn)ibronectin、α-SMA的蛋白表達(dá)水平明顯升高。提示腎臟IRI不僅可導(dǎo)致急性腎臟損傷也會引起慢性腎間質(zhì)纖維化，對遠(yuǎn)期腎臟結(jié)構(gòu)及功能有影響。Wnt/β-catenin信號通路已被證實(shí)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。Wnt/β-catenin信號通路的核心分子是β-catenin，與α-catenin、E-cadherin等參與細(xì)胞間的黏附和細(xì)胞連接的構(gòu)建；同時游離的β-catenin可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程[7]。在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型發(fā)現(xiàn)腎損傷后Wnt/β-catenin信號活化，伴隨纖維連接蛋白及α-SMA的表達(dá)增高[8]。Hertig等[9]觀察56例腎移植患者，3個月后腎臟波形蛋白表達(dá)增高，同時β-catenin由胞膜向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin增加，促進(jìn)EMT的發(fā)生。近來也有研究發(fā)現(xiàn)選擇性基因敲除β-catenin對腎纖維化程度影響較小，但可下調(diào)MMP-7，減輕間質(zhì)成纖維細(xì)胞的凋亡[10]。不僅如此，腎纖維化中Wnt通路與TGF-1通路、PI3K/Akt通路和整合素連接酶(ILK)之間存在著重要的“crosstalk對話”[11-14]。TGF-1能誘導(dǎo)Wnt蛋白的分泌，在激活PI3K/Akt途徑和ILK的同時，還能直接使糖原合成激酶-3發(fā)生磷酸化，使其活性受到抑制，最終導(dǎo)致“β-catenin/TGF-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物”及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子激活，介導(dǎo)EMT過程[15]。筆者在本實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)IRI術(shù)后7d腎臟纖維化尚不明顯時腎組織β-catenin即有增高，隨著時間延長，IRI術(shù)后14d β-catenin增高更加顯著，提示腎缺血再灌注致腎纖維化過程中Wnt/β-catenin信號通路激活，且早于腎間質(zhì)纖維化出現(xiàn)之前，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路有可能在IRI所致腎小管間質(zhì)纖維化病程中發(fā)揮重要作用。

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Expression of Wnt/β-catenin signaling pathway in chronic renal tubulointerstitial fibrosis induced by ischemia reperfusion injury in rats

Min Yali,Huang Jian,Yang Jing,Liu Chang,Yu Qian

(Department of Nephrology,Guiyang First People′s Hospital,Guiyang,Guizhou 550002China)

Objective To observe the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway in chronic renal tubulointerstitial fibrosis induced by ischemia reperfusion injury (IRI)in rat model.Methods SD rats were divided into three groups:sham group,IRI 7d group and IRI 14d group.Ischemia reperfusion injury in the rats of two IRI groups was made.The left renal artery was isolated,and the left renal artery was clamped with non invasive blood vessel in IRI group,and the left renal artery was removed after 35min.The sham group did not clamp the left renal artery.IRI 7d group and IRI 14d group were removed at sixth day and thirteenth day after surgery respectively.The rats were sacrificed at fourteenth day and seventh day respectively.Renal function were compared among the three groups of rats.The protein expression of β-catenin,fibronectin,α-SMA were detected by Western blot.The location of β-catenin was detected by immunohistochemistry,and the content of collagen was detected by biochemical staining.The pathological changes of the three groups were observed and compared by Masson staining.Results Compared with the rats of sham group and IRI 7d group,the protein expressin of Fibronectin,α-SMA and the level of collagen increased significantly in the rats of IRI 14d group.There was tubuloinsterstitial fibrosis in Masson staining in IRI 14d group.Compared with the sham group,the expression of β-catenin increased in the rats of IRI 7d group and increased more obviously in IRI 14d group.Conclusion Wnt/β-catenin signaling pathway may plays an importment role during the pathologic process of renal tubuloinsterstitial fibrosis induced by IRI.

Wnt/β-catenin signaling pathway；ischemia reperfusion injury；renal tubulointerstitial fibrosis

閔亞麗(1972-),副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腎小管間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究。

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.004

R692.5

A

1671-8348(2016)29-4044-03

2016-02-20

2016-04-27)