納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1凋亡的影響*

馬淑云，高尚風(fēng)，吳勝軍，張少華，陳 蕊，王 莉，徐 銳

(1．西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，西安 710077；2．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061；3．西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研科，西安 710077)

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論著·基礎(chǔ)研究

納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1凋亡的影響*

馬淑云1，高尚風(fēng)2，吳勝軍1，張少華1，陳 蕊1，王 莉3，徐 銳3

(1．西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，西安 710077；2．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061；3．西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研科，西安 710077)

目的 探討納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1的凋亡作用。方法 0.6μmol/L濃度的納米雄黃作用于COC1細(xì)胞，于不同時(shí)間收集的細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3的mRNA的表達(dá)水平，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 0.6μmol/L濃度的納米雄黃作用于COC1細(xì)胞48h后出現(xiàn)顯著的凋亡形態(tài)改變；納米雄黃顯著的促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并隨著納米雄黃處理COC1細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率顯著性增加(P<0.05)；隨著納米雄黃處理間的延長(zhǎng)COC1細(xì)胞中的Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 納米雄黃對(duì)COC1細(xì)胞有顯著的促凋亡作用，其作用機(jī)制可能與升高Bax和Caspase-3的表達(dá)和降低Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

納米雄黃；COC1細(xì)胞；Bax；Bcl-2；Caspase-3

目前，因卵巢癌而死亡的女性排在所有女性惡性腫瘤的首位。近年來(lái)臨床醫(yī)生對(duì)卵巢癌的治療主要是采用以鉑類化療藥物為基礎(chǔ)的化療，但隨著卵巢惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物出現(xiàn)不同程度的耐藥性，使以鉑類化療藥物為基礎(chǔ)的化療效果十分不理想[1]。雄黃是我國(guó)中醫(yī)藥常用的一種含有砷的化合物，有學(xué)者研究表明雄黃對(duì)白血病有顯著的療效[2-3]。采用納米技術(shù)處理得到的納米雄黃相對(duì)于雄黃具有溶解性高、毒性降低的特點(diǎn)。然而，關(guān)于雄黃抑制卵巢癌惡性腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用機(jī)制尚不清楚。有研究表明Bax、Bcl-2和Caspase-3在組織細(xì)胞的增殖和凋亡的過(guò)程中起著非常重要的要用[4-5]。因此，本文觀察納米雄黃作用卵巢癌細(xì)胞COC1后，觀察COC1的凋亡作用和Bax、Bcl-2和Caspas-3表達(dá)水平的變化，以探究雄黃抑制卵巢癌惡性腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用機(jī)制，為尋找到有效治療卵巢癌的新藥物提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人黏液性卵巢惡性腫瘤細(xì)胞株COC1由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室友情提供，COC1細(xì)胞采用半鐵壁懸浮培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 PRMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公司)，Bax、Bcl-2和Caspas-3抗體(美國(guó)Biowoelde公司)，二抗(美國(guó)Rockland公司)，雄黃(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科友情提供)。精細(xì)研磨機(jī)(山東龍脈科技公司)，光子相關(guān)納米激光粒度分析儀(濟(jì)南微納顆粒儀器公司)，垂直電泳槽(瑞典Hoefer Amersham Biosciences公司)，酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson 公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)共分為平行對(duì)照組和納米雄黃組。平行對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，無(wú)藥物干預(yù)；納米雄黃組常規(guī)培養(yǎng)，用納米雄黃濃度為0.6μmol/l小牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48、72h后收COC1卵巢惡性腫瘤細(xì)胞。

1.3.2 納米雄黃的制備 將西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科提供的雄黃采用精細(xì)研磨機(jī)進(jìn)行研磨，研磨之后采用光子相關(guān)納米激光粒度分析儀測(cè)定研磨后的雄黃顆粒的粒徑分布和尺寸的大小。以研磨后的雄黃顆粒平均粒徑小于或等于72.79nm作為研磨合格的標(biāo)準(zhǔn)。將研磨處理好的納米雄黃用不含有小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌溶解，經(jīng)原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)濃度為62.4μmol/L，作為儲(chǔ)備納米雄黃液。在使用的過(guò)程中用含有10%濃度的小牛血清的培養(yǎng)基稀釋配制。

1.3.3 COC1細(xì)胞培養(yǎng)和納米雄黃處理 對(duì)COC1卵巢惡性腫瘤細(xì)胞采用半貼壁懸浮培養(yǎng)，將COC1細(xì)胞在含有10%濃度小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用含有10%體積濃度的小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)納米雄黃儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋以配制工作液，配制的納米雄黃的工作液濃度為0.6μmol/L。當(dāng)0.6μmol/L濃度的納米雄黃與COC1卵巢惡性腫瘤細(xì)胞作用24、48和72h后收集COC1卵巢惡性腫瘤細(xì)胞。

1.3.4 COC1細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分析 使用FITC-Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)對(duì)COC1細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟為：收集兩株生長(zhǎng)周期處于對(duì)數(shù)期的COC1細(xì)胞，將COC1的細(xì)胞濃度稀釋為1×106個(gè)/瓶于50mL的培養(yǎng)瓶中，加入適當(dāng)量的納米雄黃溶液，配制成0.6μmol/L濃度的工作液。分別培養(yǎng)24、48、72h，收集COC1細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，參照ITC-Annexin V-PI雙染試劑盒上的說(shuō)明，加入相應(yīng)的試劑，低溫避光30min，加入結(jié)合液之后在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)COC1細(xì)胞的凋亡。

1.3.5 COC1細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平的檢測(cè) 使用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)COC1細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。主要步驟為：收集經(jīng)過(guò)0.6μmol/L濃度納米雄黃工作液處理了24、48、72h后COC1細(xì)胞，使用裂解強(qiáng)度中等的RIPA裂解液對(duì)收集的COC1細(xì)胞進(jìn)行裂解以提取COC1細(xì)胞的總蛋白，使用BCA對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行蛋白定量，加入適量的上樣緩沖液，取每孔60～80μg蛋白在10%的分離膠中對(duì)總蛋白進(jìn)行電泳分離，將電泳分離后的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，在1∶1000的Bax、Bcl-2和Caspase-3抗體和1∶400的β-actin 抗體中4℃條件下孵育過(guò)夜，PBST洗膜3次，每次10min，在1∶3000的二抗中孵育1h，PBST洗膜3次，每次10min，在目的蛋白出涂布ECL發(fā)光試劑，在暗室中曝光，用Autogel 圖像分析軟件對(duì)曝光的條帶進(jìn)行分析，比較目的蛋白和β-actin的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 COC1細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 收集不同時(shí)間的COC1細(xì)胞，以400r/min離心10min，收集離心后的細(xì)胞，按照RNA提取試劑的操作說(shuō)明提取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞中的RNA，檢測(cè)提取的RNA水平和純度；參照RT-PCR操作說(shuō)明檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)COC1細(xì)胞中的Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1凋亡細(xì)胞形態(tài)的影響 卵巢癌細(xì)胞COC1經(jīng)過(guò)0.6μmol/L濃度的納米雄黃處理24h后，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)的改變。但此時(shí)的細(xì)胞是圓形，細(xì)胞的體積沒(méi)有出現(xiàn)顯著縮小，胞核和胞質(zhì)的邊界還未完全分清，多數(shù)的COC1細(xì)胞僅能觀察到深色的細(xì)胞核；處理48h后COC1細(xì)胞凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)為非圓形，體積開(kāi)始顯著的縮小，胞質(zhì)和胞核的邊界分清。而在相同的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，未被納米雄黃處理的COC1細(xì)胞仍然呈現(xiàn)為半貼壁生長(zhǎng)，COC1細(xì)胞的體積大，觀察不到明顯的細(xì)胞核形態(tài)，細(xì)胞核呈現(xiàn)為均勻性的淡染，沒(méi)有特異性的染色,見(jiàn)圖1。

2.2 兩組卵巢癌細(xì)胞COC1凋亡率比較 納米雄黃組干預(yù)24、4872h的凋亡率顯著高于平行對(duì)照組干預(yù)相同時(shí)間的凋亡率(P<0.05)；納米雄黃組中干預(yù)72和48h的凋亡率顯著高于干預(yù)24h的凋亡率(P<0.05)；納米雄黃組中干預(yù)72h的凋亡率顯著高于干預(yù)48h的凋亡率(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組卵巢癌細(xì)胞COC1凋亡率比較(%)

2.3 納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1中Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表達(dá)的影響 納米雄黃組COC1細(xì)胞中的Bax mRNA和Caspase-3mRNA表達(dá)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05)；COC1細(xì)胞中的Bcl-2mRNA表達(dá)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

*:P<0.05，與干預(yù)24h比較；#:P<0.05，與干預(yù)48h比較

2.4 納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 納米雄黃組COC1細(xì)胞中的Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05)；COC1細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

*:P<0.05，與干預(yù)24h比較；#:P<0.05，與干預(yù)48h比較

3 討 論

卵巢惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅女性生命安全的一種惡性腫瘤，目前已是女性三大惡性腫瘤之一。目前，對(duì)卵巢癌的治療主要是以鉑類化療藥物為基礎(chǔ)的化療治療，這種治療方法在早期時(shí)可以收到顯著的臨床效果，但隨著卵巢惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)這些化療藥物的耐受性增加，敏感性降低，在后期治療過(guò)程中臨床效果顯著降低，達(dá)不到理想的治療效果。硫化物類的化療藥物患有砷元素，在臨床上除了具有解毒殺蟲(chóng)、燥濕祛痰、截瘧等作用外，還具有治療慢性粒細(xì)胞性白血病等抗腫瘤的作用[6]。目前大多數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，雄黃主要對(duì)血液系統(tǒng)的惡性腫瘤具有抗腫瘤的作用[7]。雄黃抗腫瘤的主要作用機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)：(1)抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖；(2)促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡；(3)抑制實(shí)體腫瘤中的血管新生[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1具有顯著的促凋亡作用，COC1細(xì)胞在0.6μmol/L濃度的納米雄黃的作用下細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生顯著的凋亡變化，并且隨著納米胸花處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化更嚴(yán)重。在本研究中的流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果表明0.6μmol/L納米雄黃對(duì)COC1細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)的作用，并且隨著納米雄黃處理COC1細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，COC1細(xì)胞的凋亡率會(huì)顯著增高，這些結(jié)果表明納米雄黃對(duì)卵巢癌細(xì)胞COC1具有促進(jìn)凋亡的作用。黃嬌娥等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雄黃對(duì)人的肝癌細(xì)胞Bel-7402具有促進(jìn)凋亡的作用。本研究結(jié)果和其研究結(jié)果表明，納米雄黃除了對(duì)血液系統(tǒng)的惡性腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤的作用之外，對(duì)包括卵巢癌在內(nèi)的實(shí)體瘤也具有顯著的抗腫瘤的作用，可以探索雄黃治療包括卵巢癌在內(nèi)的實(shí)體瘤的治療。

隨著對(duì)抗腫瘤藥物機(jī)制研究的深入，醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)多數(shù)的抗腫瘤藥物主要是通過(guò)調(diào)節(jié)促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白水平的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用[11-12]。Bcl-2是機(jī)體中重要的抑制凋亡的基因，通過(guò)編碼相應(yīng)的蛋白來(lái)抑制細(xì)胞色素C從細(xì)胞中線粒體內(nèi)釋放達(dá)到抗凋亡的作用[13]。Bax是機(jī)體中重要的促凋亡基因，通過(guò)編碼相應(yīng)的蛋白達(dá)到促進(jìn)惡性細(xì)胞凋亡的作用[14]。但Bcl-2編碼的凋亡抑制蛋白增多會(huì)與Bax結(jié)合抑制惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡。當(dāng)Bcl-2/Bax比值發(fā)生變化時(shí)會(huì)調(diào)節(jié)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而決定促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。本研究RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，隨著0.6μmol/L濃度的納米雄黃處理卵巢癌細(xì)胞COC1時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著降低。該結(jié)果表明納米雄黃促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞COC1凋亡的作用機(jī)制是通過(guò)將Bcl-2/Bax比值偏向Bax，進(jìn)而促進(jìn)促凋亡因子Caspase-3的表達(dá)量增加，最終達(dá)到促進(jìn)COC1細(xì)胞凋亡的作用。

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Apoptosis induced by nanoparticles in ovarian cancer COC1*

Ma Shuyun1，Gao Shangfeng2，Wu Shengjun1，Zhang Shaohua1， Chen Rui1， Wang Li3,Xu Rui3

(1.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Xi′an Medical College，Xi′an，Shaanxi 710077，China;2.Department of Gynecology and Obstertrics,the First Hospital of Medicine School of Xi′anJiaotong University，Xi′an，Shaanxi 710061，China;3.Research Service Office,the First Affiliated Hospital of Xi′anMedical College，Xi′an，Shaanxi 710077，China)

Objective To explore the apoptosis induced by nanoparticles in ovarian cancer COC1.Methods 0.6μmol/L concentration treated cells COC1,cells were collected at different times.Cell morphology was observed under an inverted microscope,rate of apoptosis were detected by flow cytometry.RT-PCR to detect the mRNA expression of Bax,Bcl-2and Caspase-3in the COC1cells.Western blot to detect the protein expression of Bax,Bcl-2and Caspase-3.Results Significant apoptotic morphological changes nanoparticles 0.6μmol/L concentration appear to COC1cells after 48h;nanoparticles significantly promoted apoptosis and prolonged treatment with nanoparticles COC1cell apoptosis rate significantly increased time (P<0.05);with the extension of nanoparticles COC1cell treatments in the Bax and mRNA and protein expression levels of Caspase-3was significantly increased (P<0.05),mRNA and protein expression levels of Bcl-2was significantly decreased (P<0.05).Conclusion Nanoparticles on COC1cells have significant pro-apoptotic effect.The mechanism of action may be related to increased expression of Bax and Caspase-3,decreased expression of Bcl-2.

nanorealgar;COC1cell;Bax;Bcl-2;Caspase-3

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.003

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012JM4051)。 作者簡(jiǎn)介：馬淑云(1974-),副主任醫(yī)師，在讀博士，主要從事婦科腫瘤方面的研究。

R711.7

A

1671-8348(2016)29-4041-03

2016-02-22

2016-04-09)