PI3K/Akt信號通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VCAM-1表達(dá)*

賈圣男，史家欣，李小民△，陳曉兵

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院:1.急診內(nèi)科；2.呼吸內(nèi)科,江蘇連云港 222000)

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論著·基礎(chǔ)研究

PI3K/Akt信號通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VCAM-1表達(dá)*

賈圣男1，史家欣2，李小民1△，陳曉兵1

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院:1.急診內(nèi)科；2.呼吸內(nèi)科,江蘇連云港 222000)

目的 探討PI3K/Akt信號通路是否調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)及機制。方法 脂多糖(LPS)10μg/mL刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)0、6、12、24h，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測VCAM-1蛋白表達(dá)，刺激0、4、8、12h 行RT-PCR檢測VCAM-1mRNA；LPS(10μg/mL，后同)刺激HUVEC 0、30、60、120min后，Western blot檢測PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)表達(dá)；PI3K抑制劑LY294002(10、50μmol/L)、Akt抑制劑A6730(2、10μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1h后LPS刺激12h,Western blot檢測VCAM-1蛋白表達(dá)，刺激8h行RT-PCR檢測VCAM-1mRNA;加或不加抑制劑， LPS刺激8h加入放線菌素D抑制轉(zhuǎn)錄，于0、1、2、3、4h收細(xì)胞行RT-PCR檢測VCAM-1mRNA，計算mRNA半衰期。結(jié)果 LPS刺激HUVEC(6、12、24h)后VCAM-1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，12h達(dá)峰值，VCAM-1mRNA在刺激后也增加(P<0.05)，8h達(dá)峰值；LPS刺激HUVEC后p-PI3K、p-Akt增加，p-PI3K在刺激30min達(dá)峰值(P<0.05)，以后逐漸下降，120min與0h接近(P>0.05)，p-Akt在刺激30min明顯增加，60min達(dá)峰值，120min仍高于0h(P<0.05)；LY294002下調(diào)了p-Akt表達(dá)(P<0.05)，同時降低VCAM-1蛋白、mRNA合成(P<0.05)；Akt抑制劑也抑制VCAM-1蛋白、mRNA(P<0.05)；PI3K、Akt抑制劑均不影響VCAM-1mRNA穩(wěn)定性(P>0.05)。結(jié)論 PI3K/Akt信號途徑在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VCAM-1表達(dá)。

PI3K/Akt信號通路；脂多糖；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管細(xì)胞黏附分子

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，按病情嚴(yán)重程度可分為膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克，臨床表現(xiàn)為器官功能障礙和(或)液體治療無法逆轉(zhuǎn)的低血壓[1]。隨著人口的老齡化、腫瘤發(fā)病率的上升，由慢性阻塞性肺疾病、肺炎及惡病質(zhì)引起的膿毒癥發(fā)病率在不斷升高，每年全球新增數(shù)百萬膿毒癥患者，其中，超過1/4的患者死亡[2]。革蘭陰性細(xì)菌胞壁脂多糖(lipopolysacc haride，LPS)是其主要致病成分。LPS通過與細(xì)胞表面Toll樣受體(TLR)相關(guān)受體結(jié)合，激活絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及轉(zhuǎn)錄因子，最終促進(jìn)炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等的表達(dá)[3-4]。而循環(huán)中的LPS還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VCAM-1， VCAM-1不僅能夠調(diào)節(jié)鈣黏素黏附功能、內(nèi)皮屏障功能及血管的通透性[5]，還可以介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的聚集、浸潤，到達(dá)炎性局部清除病原體，以及進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，促進(jìn)炎癥因子大量釋放，導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)放大[6]。而PI3K/Akt信號通路是否能夠調(diào)控VCAM-1的表達(dá)尚不完全清楚。因此，本研究擬探討炎性刺激LPS作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)后是否通過PI3K/Akt(蛋白激酶B)調(diào)控VCAM-1表達(dá)，來進(jìn)一步研究其調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC(中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)，RPMI1640培養(yǎng)基(凱基，中國)，胎牛血清(維森特，南美)，LPS(Sigma，L4391)，PI3K(P85)、Akt、Akt磷酸化蛋白(ser473)、LY294002均購自美國CST公司，PI3K磷酸化蛋白(p-p85)(Abcam，美國)，PI3K抑制劑LY294002、Akt特異性抑制劑A6730均購自Sigma公司，β-actin抗體(碧云天，中國)，VCAM-1抗體(武漢三鷹，中國)，Primescript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TAKARA，RR047A)，PCR master mix(捷瑞，中國)，BCIP/NBT顯色試劑盒、配膠試劑盒、蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購自中國碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素)，在5%CO2、37℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVEC，胰酶消化法傳代、凍存細(xì)胞，實驗用第2～6代，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組 取生長狀態(tài)良好，傳代3～6代，一定程度融合的細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗分組為正常對照組(正常培養(yǎng)液孵育)、LPS組(完全培養(yǎng)基中加入10μg/mL LPS孵育，作用6、12、24h)、PI3K抑制劑組(不同濃度LY294002預(yù)處理1h，加入LPS刺激8、12h)、Akt抑制劑組(不同濃度A6730預(yù)處理1h，LPS作用8、12h)、放線菌素D(ActD)對照組(LPS刺激8h，加入ActD，作用0、1、2、3、4h)、PI3K抑制劑+ActD組(10μmol/L LY294002預(yù)處理1h，LPS刺激8h，加入ActD，作用0、1、2、3、4h)、Akt抑制劑+ ActD組(2μmol/L A6730預(yù)處理1h，LPS刺激8h，加入ActD，作用0、1、2、3、4h)，分別收集各組細(xì)胞用于檢測。

1.2.3 Western blot檢測VCAM-1、PI3K、Akt、磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)的表達(dá) 將HUVEC細(xì)胞用冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，細(xì)胞刮刮下，1.0mL PBS懸浮，收集于1.5mL EP管中，2000r/min，棄上清液，根據(jù)沉淀量加入含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，劇烈震蕩1min，冰上放置10min，如此重復(fù)3次。待細(xì)胞充分裂解后，在12000r/min，4℃條件下離心15min，分離出總蛋白后用BCA法測定蛋白濃度。按體積加入蛋白上樣緩沖液，混勻后用沸水煮10min。按每孔50μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別于1∶100人源的VCAM-1單克隆抗體、1∶1000人源PI3K(p85)抗體、Akt抗體、p-Akt抗體，1∶500人源p-PI3K抗體和1∶3000人源β-actin抗體中4℃過夜，洗膜，再以1∶500稀釋的AP標(biāo)記的山羊抗兔孵育2h，BCIP/NBT法顯色。各目的蛋白的表達(dá)量用蛋白的A值與β-actin的A值的比值半定量表示，Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.4 RT-PCR檢測VCAM-1mRNA的表達(dá) Trizol試劑提取各組總RNA，測定RNA濃度，取2μg，應(yīng)用 Primescript RT reagent Kit With gDNA Eraser進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照PCR master mix試劑說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，PCR所用的引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。VCAM-1mRNA：上游引物5′-CCC TTG ACC GGC TGG AGA TT-3′，下游引物5′-TGG GGG CAA CAT TGA CAT AAA GTG-3′;GAPDH mRNA：上游引物5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′，下游引物5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′。RT-PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 1min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s循環(huán)35次，得到cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)下拍照，利用Image J軟件分析DNA條帶灰度，目的RNA相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 LPS誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá) LPS組刺激HUVEC 6、12、24h后VCAM-1表達(dá)明顯升高，在刺激12h達(dá)高峰，隨后下降，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

*：P<0.05，與正常對照組比較

2.2 LPS刺激HUVEC后激活PI3K/Akt信號分子 LPS刺激HUVEC 30、60、120min，PI3K、Akt總蛋白與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2A、2B。p-PI3K在30min明顯高于正常對照組(P<0.05)，60min較前降低，但仍高于正常對照組(P<0.05)，120min與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2C。p-Akt在細(xì)胞刺激30min明顯增多，60min進(jìn)一步增加，120min下降，但仍高于正常對照組(P<0.05)，見圖2D。

2.3 PI3K抑制劑LY294002抑制p-Akt、VCAM-1蛋白表達(dá)，Akt抑制劑A6730抑制VCAM-1蛋白合成 LY294002不同濃度(10、50μmol/L)均明顯降低 p-Akt表達(dá)，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且50μmol/L LY294002明顯低于10μmol/L LY294002，見圖3A。同時LY294002(10、50μmol/L)、A6730(2、10μmol/L)均可減少炎癥因子VCAM-1合成，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，加入高濃度抑制劑VCAM-1蛋白水平明顯低于低濃度抑制劑(P<0.05)，見圖3B、3C。

2.4 LPS刺激及PI3K抑制劑LY294002、Akt抑制劑A6730對HUVEC表達(dá) LPS刺激HUVEC 4、8、12h，4h后VCAM-1mRNA明顯增多，8h達(dá)高峰，12h較前下降，但仍高于正常對照組(P<0.05)，見圖4A。LY294002(10、50μmol/L)減低VCAM-1mRNA合成，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；加入50μmol/L LY294002的VCAM-1mRNA明顯低于10μmol/L LY294002(P<0.05)，見圖4B。 A6730(2、10μmol/L)可明顯降低LPS刺激的HUVEC表達(dá)VCAM-1mRNA，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；加入2μmol/L A6730的VCAM-1mRNA含量明顯高于10μmol/L A6730(P<0.05)。

2.5 PI3K、Akt對VCAM-1mRNA穩(wěn)定性的影響 設(shè)定0h量為100%，其他時間點值為與0h的比值，應(yīng)用GraphPad Prism軟件one phase decay程序測定不同處理組之間mRNA的半衰期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑組、Akt抑制劑組VCAM-1的半衰期分別為160、157min，與正常對照組(169min)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5D、5E。

A：PI3K總蛋白的表達(dá)；B：Akt總蛋白的表達(dá)；C：p-PI3K變化；D：p-Akt變化；*：P<0.05，與正常對照組比較

A：p-Akt表達(dá)變化 0h無LPS刺激，1h為LPS刺激1h，LY29400210、50μmol/L為不同濃度LY294002預(yù)處理1h后LPS刺激1h；B：VCAM-1蛋白表達(dá)變化。0h無LPS刺激，12h為LPS刺激12h，LY29400210、50μmol/L為不同濃度LY294002預(yù)處理1h后LPS刺激12h；C：Akt抑制劑A6730對VCAM-1表達(dá)的影響，處理方式同B；*：P<0.05，與正常對照組比較；#：P<0.05，與LPS刺激12h比較

A：RT-PCR檢測VCAM-1mRNA；B：10、50μmol/L不同濃度LY294002預(yù)處理1h后LPS刺激8h，RT-PCR測VCAM-1mRNA的變化；C：Akt抑制劑A6730對VCAM-1mRNA的影響；*：P<0.05，與正常對照組比較；#：P<0.05，與LPS刺激8h比較

A：LPS刺激8h加入ActD(ActD 5μg/mL)于0、1、2、3、4h收集細(xì)胞，RT-PCR檢查；B：PI3K抑制劑對VCAM-1mRNA穩(wěn)定性的影響LY294002(10μmol/L)預(yù)處理1h后LPS刺激8h，后續(xù)處理同上；C：Akt抑制劑對VCAM-1mRNA穩(wěn)定性的影響A6730(2μmol/L) 預(yù)處理1h后LPS刺激8h，后續(xù)過程同A；D、E：利用GraphPad計算出的不同處理條件下VCAM-1mRNA的半衰期。

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，機體過度放大的炎癥反應(yīng)是膿毒癥的本質(zhì)，其主要致病成分LPS迅速大量激活免疫細(xì)胞，激活MAPKs、PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，合成IL-6、IL-8、IL-12等炎癥因子，最終過度增多的炎癥因子對機體造成損害[3-4]。而PI3K/Akt信號分子作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一組脂質(zhì)激酶，在相關(guān)外部刺激激活跨膜受體后，胞內(nèi)區(qū)可募集PI3K至胞膜，活化后的PI3K將磷脂酰肌醇-2-磷酸(PIP2)磷酸化形成磷脂酰肌醇-3-磷酸(PIP3)，PIP3作為第二信使活化下游蛋白激酶B(PKB/Akt)、磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶(PDPK1)[7]，Akt、PDPK1進(jìn)一步活化糖原合成激酶-3(GSK3)、哺乳動物雷帕霉素靶向的復(fù)合物(mTOR)下游分子[8]，最終激活NF-κB、AP-1、Nrf、STAT等轉(zhuǎn)錄啟動子，促進(jìn)大量合成炎癥因子[9]。而循環(huán)中的LPS也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、MCP-1、VCAM-1等一系列炎性介質(zhì)[10]，其中，VCAM-1不僅介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的聚集、浸潤，到達(dá)炎性局部清除病原體，還可以進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)放大[6]。而信號途徑PI3K/Akt是否可以調(diào)控HUVEC中LPS誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)尚不完全清楚。筆者應(yīng)用LPS刺激培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，LPS刺激HUVEC后可激活PI3K、Akt信號分子，誘導(dǎo)p-PI3K、p-Akt迅速增多，并且也可以增加VCAM-1表達(dá)一直到刺激24h?？梢娫贖UVEC，膿毒癥刺激時也可激活PI3K、Akt信號分子，并上調(diào)促炎介質(zhì)VCAM-1表達(dá)。

在單核巨噬細(xì)胞株THP-1中，LPS刺激可激活PI3K、Akt，p-PI3K、p-Akt表達(dá)增多，伴炎性因子IL-6、IL-10、IL-12表達(dá)增多，應(yīng)用PI3K、Akt抑制劑后炎癥因子表達(dá)下調(diào)[11]。因此，筆者認(rèn)為PI3K/Akt可調(diào)節(jié)上述炎癥因子的合成。同時，本實驗中筆者應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002抑制PI3K活性后不僅降低了LPS誘導(dǎo)的p-Akt蛋白的增加，還可以抑制VCAM-1蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步應(yīng)用Akt抑制劑發(fā)現(xiàn)也降低了LPS 誘導(dǎo)的VCAM-1蛋白增加，這就證明了HUVEC與THP-1細(xì)胞擁有同樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控炎癥介質(zhì)的表達(dá)。為進(jìn)一步明確VCAM-1基因水平的變化，在LPS刺激HUVEC不同時間及PI3K、Akt抑制劑應(yīng)用后行VCAM-1RT-PCR，結(jié)果顯示PI3K/Akt同樣調(diào)控VCAM-1mRNA表達(dá)，這與上述蛋白測定的結(jié)果是一致的。

機體有效適度的免疫應(yīng)答，是外部因素刺激機體后，免疫系統(tǒng)迅速大量合成炎癥因子清除病原體，而后免疫調(diào)節(jié)降低炎癥因子的合成，保持炎癥反應(yīng)的平衡[12]。炎癥因子的調(diào)節(jié)包括轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)基因狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄子、增強子等調(diào)節(jié)由DNA合成RNA的過程，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)是在RNA合成后，通過5′或者3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)相關(guān)序列與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，對RNA進(jìn)行可變剪接、蓋帽、加多聚A尾、調(diào)節(jié)RNA穩(wěn)定性等一系列過程，最終到達(dá)翻譯成為蛋白[13-14]。機體免疫系統(tǒng)被激活后，不僅依靠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式迅速增加炎癥因子合成，還會以轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)方式調(diào)控信使RNA穩(wěn)定性，迅速調(diào)控炎癥因子蛋白的合成增多或減少。而基因3′非翻譯區(qū)的富含AU的序列(ARE)即“AUUUA”序列調(diào)節(jié)，與相關(guān)RNA結(jié)合蛋白結(jié)合后調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性是一種常見轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)形式，如HuR、HuD與之結(jié)合并增加mRNA穩(wěn)定性，而TTP、AUF1與之結(jié)合后加速了mRNA降解，縮短mRNA半衰期[15]。ARE序列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)在炎癥因子的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在人和大鼠骨髓源性的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，AUF1可加速LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-10、TNF mRNA降解，減少炎癥因子蛋白表達(dá)。因此，筆者檢索PUBMED基因庫，發(fā)現(xiàn)在人VCAM-1基因3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)含2個“AUUUA”序列，而PI3K/Akt是否可以通過ARE依賴的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制調(diào)控VCAM-1表達(dá)尚不明確，筆者進(jìn)一步在實驗中測定對照組、PI3K抑制劑組及Akt抑制劑組VCAM-1mRNA半衰期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K、Akt并不顯著改變VCAM-1半衰期。因此，筆者明確了PI3K/Akt可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VCAM-1表達(dá)，而不是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在LPS刺激HUVEC后可激活PI3K/Akt信號通路，p-PI3K、p-Akt迅速增加，并上調(diào)VCAM-1蛋白表達(dá)。應(yīng)用PI3K、Akt抑制劑后發(fā)現(xiàn)二者可以濃度依賴性抑制VCAM-1蛋白表達(dá)，也可以抑制VCAM-1mRNA變化，這與上述蛋白結(jié)果是一致的。進(jìn)一步研究PI3K/Akt對VCAM-1mRNA穩(wěn)定性的影響發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt并不顯著改變VCAM-1mRNA穩(wěn)定性，因此，筆者認(rèn)為PI3K/Akt可以通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)方式調(diào)控LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)，而不是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。然而本實驗由于條件限制，沒能夠進(jìn)一步深入研究PI3K/Akt是通過哪些信號分子調(diào)控VCAM-1表達(dá)，以及本實驗材料是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株，可能與在體細(xì)胞會有不同，還需要進(jìn)一步研究。

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PI3K/Akt signaling pathway regulates VCAM-1expression at the transcriptional level*

Jia Shengnan1,Shi Jiaxin2,Li Xiaoming1△,Chen Xiaobing1

(1.Department of Emergency Medicine;2.Department of Respiratory Medicine,Lianyungang HospitalAffiliated to Xuzhou Medical University,Lianyungang,Jiangsu 222000,China)

Objective To explore the effect of PI3K/Akt signaling pathway on lps induced vascular cellular adhesive molecular 1(VCAM-1) expression and its mechanism.Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were treated with lipopolysaccharides(10μg/mL) for 0,6,12,24h,the production of VCAM-1protein was assessed by Western blot.HUVECs were incubated with LPS for 0,4,6,8h for the detection of VCAM-1mRNA by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).HUVECs were incubated with LPS for 0,30,60,120min，the protein expression of PI3K、phoph-PI3K(p-PI3K),Akt and phosphor-Akt(p-Akt) was assessed by Western blot.HUVECs were pretreated with different concentrations of PI3K inhibitor LY294002(10,50μmol/L) or Akt inhibitor A6730(2,10μmol/L) for 1h,then they were incubated with LPS for 12h,the effect of PI3K on VCAM-1protein was detected by Western blot.The effect of PI3K inhibitor(10,50μmol/L) or Akt inhibitor(2,10μmol/L) on the mRNA expression of VCAM-1was measured by RT-PCR.HUVECs were pretreated with or without LY294002(A6730) for 1hour,incubated with LPS for 8h,and then incubated with ActD 5μg/mL for 0,1,2,3,4h,collected the cells for the measure of VCAM-1mRNA by RT-PCR,calculate the half-life of mRNA.Results The expression of VCAM-1protein was significantly increased in LPS stimulated groups(6,12,24h)(all P<0.05),and the peak effect was observed at 12h.The VCAM-1mRNA levels also increased evidently after LPS incubation(all P<0.05) and peaked at 8h.LPS significantly induced p-PI3K and p-Akt,they peaked at 30min(P<0.05) or 60min (P<0.05)respectively，at 120min was higher than at 0h(P<0.05).LY294002reduced p-Akt(all P<0.05)and VCAM-1(all P<0.05)at protein and mRNA levels.A6730alsodeceased VCAM-1protein and mRNA(all P<0.05).LY294002and A6730didn′t affect mRNA half-life of VCAM-1(all P>0.05).Conclusion The PI3K/Akt signaling pathway could transcriptionally regulates lps-induced vascular cellular adhesive molecular expression.

PI3K/Akt signal pathway；lipopolysaccharides；human umbilical vein endothelial cells;vascular cellular adhesive molecular 1

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(81300052)；中國博士后科學(xué)基金(2015M570420)；江蘇省衛(wèi)生和計劃生育委員會資助課題(H201558)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK20130402)；連云港科技局資助項目(SH1401)。 作者簡介：賈圣男(1989-)，碩士，主要從事膿毒癥炎癥器官功能衰竭的基礎(chǔ)及臨床研究?！?/p>

R392.6

A

1671-8348(2016)29-4036-05

2016-03-14

2016-05-18)