菜芙蓉總黃酮純化及其體內(nèi)抗氧化性

仇 燕 ，李俊英，劉 暢，王志新，王申林

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

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菜芙蓉總黃酮純化及其體內(nèi)抗氧化性

仇 燕 ，李俊英，劉 暢，王志新，王申林

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

為研究菜芙蓉總黃酮(TFA)的純化條件及體內(nèi)抗氧化性，采用AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附-洗脫工藝，控制純化條件為上樣液質(zhì)量濃度0.1 g/mL，pH值為3.5，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，解吸液體積與樹脂質(zhì)量比為20∶1(mL/g)。在最優(yōu)純化條件下，黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到48.50%；與正常對照組相比，實驗組小鼠器官指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；小鼠血清和肝組織中MDA含量顯著低于正常對照組(P<0.05)，而CAT，GSH-Px和SOD活性均高于正常對照組且具有明顯的量效關(guān)系。實驗結(jié)果表明，TFA具有良好的體內(nèi)抗氧化效果。

中藥學(xué)其他學(xué)科；菜芙蓉; 總黃酮; 純化; 體內(nèi)抗氧化性

Purification of total flavonoids ofAbelmoschusmanihot(L.)

菜芙蓉(Abelmoschusmanihot(L.)Medic)，為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，主產(chǎn)于河北、河南、甘肅、山東等地。菜芙蓉花具有通淋、消腫、解毒等功效，是中國典籍記載的傳統(tǒng)藥食兩用植物[1]。近年來的研究表明，菜芙蓉花提取物能夠降低由CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷程度[2]，降低脂肪細(xì)胞中甘油三酯的積累[3]，保護(hù)腎小球。植物化學(xué)研究表明，菜芙蓉富含天然黃酮類化合物、還原糖類、鞣酸類及長鏈烴類化合物[4-5]，其中菜芙蓉花中的生物黃酮含量達(dá)干重的5.63%[6]，是目前已報道的黃酮類化合物含量最高的植物，具有很高的開發(fā)價值。過量的活性氧能夠破壞生物大分子(如脂類、DNA及蛋白)，誘發(fā)癌癥、心血管疾病及其他疾病[7-9]。植物類黃酮是天然抗氧化劑，能夠抑制氧化，降低體內(nèi)自由基濃度，螯合金屬離子，阻止脂質(zhì)過氧化[10]?？梢姡缓烊豢寡趸瘎┑氖澄飳τ诰S持身體健康至關(guān)重要，越來越受到人們的關(guān)注。

1 材料與儀器

1.1 試藥與試劑

藥品制備：菜芙蓉花，產(chǎn)自河北井陘縣，于8月到10月早晨盛花時采摘，去掉花托后于2 h內(nèi)進(jìn)行微波干燥。將干燥至恒重的菜芙蓉干花粉碎，過150 μm(100目)篩。用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇于90 ℃回流提取2次[12]，第1次以料液比15∶1(mL/g，下同)提取2 h，第2次以料液比7.5∶1提取1 h，合并抽濾得到濾液。將濾液經(jīng)12 000 r/min離心15 min，真空減壓濃縮，得到粗制的菜芙蓉花總黃酮粗提物浸膏，冷凍干燥后得到菜芙蓉總黃酮粗提物。將此菜芙蓉總黃酮粗提物溶于水，配置成不同濃度的上樣液用于AB-8樹脂吸附。將吸附后的樹脂用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇解吸液解吸，經(jīng)真空減壓濃縮至無醇味后冷凍干燥，得到TFA精制物，用于體內(nèi)抗氧化實驗。

動物分組：試驗選用昆明種健康小鼠(清潔級)，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重20～25 g，雌性。將小鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組；TFA低劑量組(黃酮濃度為40 mg/(kg bw))；TFA中劑量組(黃酮濃度為80 mg/(kg bw)；TFA高劑量組(黃酮濃度為160 mg/(kg bw)。正常對照組灌胃同體積的生理鹽水，試驗組灌胃TFA。每組10只小鼠，連續(xù)灌胃42 d，每5天稱重一次，依據(jù)每次稱重的小鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

試劑：AB-8 大孔吸附樹脂，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、金絲桃苷、槲皮素、楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所提供；谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、超氧化物歧化酶測試盒、過氧化氫酶測試盒、丙二醛測試盒，全部購于南京建成生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠提供；Avanti J-26貝克曼高速離心機(jī)，美國貝克曼公司提供；UV-2000分光光度計，尤尼柯(上海)有限公司提供；Waters1525高效液相色譜儀(配有Waters2998二極管陣列檢測器和Breeze2色譜工作站)，美國Waters公司提供；SpectraMax plus384光吸收酶標(biāo)儀，美國美谷分子公司提供。

2 試驗方法

2.1 AB-8 大孔吸附樹脂吸附條件的優(yōu)化

用蒸餾水將菜芙蓉粗提物B溶解，配制成不同濃度的上樣液。稱取2 g預(yù)處理后并抽干的濕樹脂，置于10 mL不同濃度的上樣液中，于28 ℃，55 r/min 恒溫?fù)u床振蕩吸附12 h后過濾，將濾液用蒸餾水定容至10 mL，測定濾液中菜芙蓉總黃酮濃度。分別考察上樣液質(zhì)量濃度(0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 g/mL)和pH值(1, 1.5, 3.5, 5.5, 7.5)對 AB-8大孔吸附樹脂吸附TFA的影響。

2.2 AB-8大孔吸附樹脂解吸附條件的優(yōu)化

稱取2 g預(yù)處理后并抽干的濕樹脂，分別置于pH值為3.5、質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的上樣液中，振蕩吸附12 h后過濾，用蒸餾水沖洗數(shù)次直至與Al(NO3)3反應(yīng)無熒光顯示。再加入30 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇解吸液，于28 ℃，55 r/min恒溫?fù)u床振蕩解吸附4 h后過濾。將濾液用原乙醇定容至30 mL，測定濾液中菜芙蓉總黃酮的濃度。分別考察解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%, 60%,70%, 80%, 90%)及解吸液乙醇體積與樹脂質(zhì)量比(5∶1, 10∶1, 15∶1, 20∶1, 25∶1 mL/g)對解吸TFA的影響。

2.3 菜芙蓉總黃酮吸附率和解吸率的測定

參照文獻(xiàn)[13],測定黃酮濃度。于508 nm 處測定吸光度, 通過最小二乘法作線性回歸, 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=14.154x-0.001 1(x為蘆丁質(zhì)量濃度，y為吸光度), 相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

取一定體積的待測液樣，放入10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇水溶液補(bǔ)加至5 mL，按上述方法測定吸光度值，重復(fù)3次取平均值，由回歸方程計算總黃酮含量。吸附量(Q)、吸附率(A)、解吸率(D)按式(1)—式(3)計算：

(1)

(2)

(3)

式中：m為樹脂質(zhì)量，g；C1，C2，C3分別為上樣液、濾液和洗脫液的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1，V2，V3分別為上樣液、濾液和洗脫液的體積，mL。

2.4 高效液相色譜法檢測菜芙蓉總黃酮

取一定量的原料液及在最佳純化條件下試驗得到的洗脫液。將原料液和洗脫液分別冷凍干燥后，取一定量凍干品用甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾后經(jīng)高效液相色譜儀分析，以金絲桃苷為標(biāo)準(zhǔn)品。色譜條件如下：色譜柱為Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μL)；流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液；洗脫程序為0～40 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%～15%；40～60 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為15%～40%；檢測波長為360 nm；柱溫為室溫；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；理論塔板數(shù)不低于3 000。

2.5 小鼠肝和血清中CAT，SOD ，MDA及 GSH-Px的測定

將各組小鼠于第42天末次給藥后禁食12 h，從其眼眶取血，3 500 r/min離心15 min，分離血清，在24 h內(nèi)檢測血清的CAT，SOD，MDA及GSH-Px活性。解剖小鼠，迅速取出脾、腎、肝、心，用4 ℃ 生理鹽水沖凈表面殘血，濾紙吸干水分，稱重，計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

取1.0 g 肝組織，剪碎后置于玻璃勻漿器中，加9倍4 ℃生理鹽水，制成10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的肝組織勻漿，于4 000 r/min離心10 min。取上清液測定肝臟的CAT，SOD，MDA及GSH-Px活性，分別嚴(yán)格按試劑盒操作程序測定。

2.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以(x±s)表示，用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，并進(jìn)行Duncan多重比較分析。

3 試驗結(jié)果

3.1 上樣液質(zhì)量濃度和pH值對AB-8大孔吸附樹脂吸附黃酮的影響

由圖1可知，隨著上樣液中菜芙蓉花總黃酮質(zhì)量濃度的增加，AB-8樹脂吸附量逐漸上升，而吸附率卻不斷下降。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為0.2 g/mL時，AB-8大孔吸附樹脂的吸附量最高為40.19 mg/g，吸附率為71.02%，而后隨著上樣液濃度的增加，樹脂吸附量、吸附率均呈下降趨勢。這可能是由于高質(zhì)量濃度的上樣液中含多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多，這些雜質(zhì)與黃酮類化合物競爭AB-8樹脂的吸附位點(diǎn)，導(dǎo)致吸附率降低，并且高質(zhì)量濃度上樣液條件下由于樹脂吸附飽和，故而對總黃酮的吸附量也降低。因此，選擇上樣液粗提物的質(zhì)量濃度為0.2 g/mL較為適宜。

由圖2可知，pH值在3.5時，吸附率最高達(dá)89.74%；而當(dāng)pH值為7.5時，吸附率迅速下降到56.67%。這是因為黃酮類化合物含有較多的酚羥基，呈弱酸性，酸性條件下可使其保持分子狀態(tài)，有利于AB-8大孔吸附樹脂對其吸附。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，pH值在1～1.5時的上樣液顏色變化明顯，與駱黨委等[14]報道一致，所以選取上樣液最佳pH 值為3.5。

圖1 上樣液質(zhì)量濃度對AB-8大孔樹脂 吸附總黃酮的影響Fig.1 Effects of sample solution concerntration on AB-8 maroporous resin absorbing total flavonoids

圖2 pH值對AB-8大孔樹脂吸附總 黃酮的影響Fig.2 Effects of pH value on AB-8 maroporous resin absorbing total flavonoids

3.2 解吸液體積分?jǐn)?shù)、體積與樹脂質(zhì)量比對AB-8樹脂解吸總黃酮的影響

由圖3可知，解吸率隨著解吸液體積分?jǐn)?shù)的增大而增大。當(dāng)解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，解吸液體積分?jǐn)?shù)與解吸率呈顯著的正相關(guān)；當(dāng)解吸液體積分?jǐn)?shù)為70%時，解吸率為89.39%；解吸液濃度繼續(xù)增大時，解吸率增加不顯著(P>0.05)，因此選擇解吸液的適宜體積分?jǐn)?shù)為70%。

由圖4可知，隨著解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比增大，解吸率不斷上升。當(dāng)解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比為5∶1～20∶1時，解吸率隨著解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比的上升而增大；當(dāng)解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比為20∶1 時，解吸率為92.42%；進(jìn)一步增大解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比，解析率增加緩慢，故選擇20∶1為最佳解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比。

圖3 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8大孔 樹脂解吸總黃酮的影響Fig.3 Effects of alcohol concerntration on AB-8 maroporous resin desorbing total flavonoids

圖4 解吸液體積與樹脂質(zhì)量比對AB-8 大孔樹脂解吸總黃酮的影響Fig.4 Effects of volume-to-mass ratio on AB-8 maroporous resin desorbing total flavonoids

3.3 高效液相色譜測定純化前后TFA

金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品A的保留時間為42.7 min，其他5種物質(zhì)均有黃酮特征吸收峰。由純化前粗提物B和純化后精制物C的液相色譜圖(圖5)可知：雜質(zhì)大大減少(箭頭所示)，黃酮類化合物特征峰面積提高，AB-8大孔樹脂對菜芙蓉粗提物中黃酮類物質(zhì)有一定的富集作用。AB-8大孔樹脂純化3次試驗分別得到精制物，采用高效液相色譜法，菜芙蓉總黃酮純度分別為50.70%，46.54%，48.27%(以金絲桃苷計)，取其平均值為48.50%，RSD值為4.30%，是純化前粗提物總黃酮純度(8.71%±0.34%)的5.57倍，達(dá)到了純化總黃酮的目的，可用于后續(xù)體內(nèi)抗氧化性試驗。

圖5 HPLC檢測菜芙蓉黃酮類化合物Fig.5 Determination of total flavonoids compounds by HPLC

3.4 菜芙蓉總黃酮體內(nèi)抗氧化性研究

3.4.1 TFA對小鼠臟器指數(shù)的影響

內(nèi)臟器官的大小在一定程度上能夠反映出黃酮對于小鼠生長的影響，臟器指數(shù)可以在一定程度上反映出小鼠的發(fā)育情況。對小鼠脾、腎、肝和心臟的臟器指數(shù)進(jìn)行分析，見表1。由表1可知，與對照組相比，菜芙蓉高、中、低3個劑量組的小鼠器官指數(shù)均有變化，但無統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P>0.05)，這表明低、中、高劑量TFA均未對小鼠的器官造成損傷性的影響。

表1 TFA對小鼠臟器指數(shù)的影響 (n=10)

注：同列數(shù)據(jù)無肩標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)。

3.4.2 TFA對小鼠血清和肝臟中MDA含量，CAT，SOD及GSH-Px活力的影響

TFA對小鼠血清和肝臟中MDA含量的影響見表2，小鼠血清和肝臟中MDA生成量均隨著TFA濃度的增加而逐漸下降。血清和肝臟中正常對照組與試驗組MDA含量差異顯著(P<0.05)，表明TFA能一定程度抑制小鼠血清和肝臟中MDA的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化程度，且在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量效應(yīng)關(guān)系。

TFA對小鼠血清和肝臟中CAT，SOD和GSH-Px活力的研究(見表2)表明，各個試驗組中小鼠血清和肝臟中CAT，SOD和GSH-Px活力均高于對照組，且隨著TFA濃度的增大而加大，表現(xiàn)為一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。與正常對照組相比，中、高劑量組小鼠肝臟CAT活力顯著增加(P<0.05)。 小鼠血清 TFA各劑量組SOD活力均顯著高于正常對照組(P<0.05)，肝臟中的高劑量組SOD活力顯著高于對照組(P<0.05)，這表明適當(dāng)劑量的TFA能提高小鼠血清和肝臟中的SOD活性，對小鼠體內(nèi)自由基具有抑制作用；中、高劑量組血清和肝臟GSH-Px活力顯著高于正常對照組(P<0.05)。

表2 TFA在小鼠血清和肝臟中的抗氧化活性

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)有不同英文小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有相同字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

4 討 論

上樣液質(zhì)量濃度影響菜芙蓉總黃酮的吸附量和吸附率，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度低于0.2 g/mL時，AB-8大孔吸附樹脂有足夠吸附總黃酮的活性位點(diǎn)，此時總黃酮吸附率會隨著樣品質(zhì)量濃度的增高而上升；隨著上樣液總黃酮質(zhì)量濃度的不斷增大，雜質(zhì)含量增加，會與菜芙蓉黃酮競爭吸附活性位點(diǎn)，導(dǎo)致總黃酮吸附量和吸附率降低。選用AB-8樹脂的粒徑范圍為0.3～1.25 mm，動態(tài)吸附法會隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加發(fā)生多分子層吸附，進(jìn)而降低吸附速度。而本試驗采用靜態(tài)吸附法，在恒溫振蕩的條件下，樹脂表面可充分發(fā)揮吸附作用而避免了此現(xiàn)象的發(fā)生。黃酮類化合物含有酚羥基，呈弱酸性，在酸性條件下可使黃酮類化合物保持分子狀態(tài)，有利于大孔吸附樹脂對其吸附。由于黃酮類化合物與樹脂之間的范德華力隨著2種物質(zhì)的極性越相近而增大，所以隨著解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率不斷上升。AB-8大孔吸附樹脂為弱極性樹脂，其吸附的黃酮極性較小，故乙醇體積分?jǐn)?shù)越高即極性越小則洗脫效果越明顯。采用AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附-洗脫單因素試驗篩選TFA純化條件，最佳純化條件為上樣液質(zhì)量濃度為0.2 g/mL，pH值為3.5，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，解吸液體積與樹脂質(zhì)量比為20∶1(mL/g)。HPLC結(jié)果顯示，純化TFA雜質(zhì)含量大大降低，而黃酮化合物純度提高至48.50%。該方法成本低，易操作，純化效果好。

近年來, 越來越多的中藥被認(rèn)為是外源性的“天然自由基清除劑”，研究人員開展了各種清除自由基的試驗[21]。菜芙蓉總黃酮被證明可以直接清除自由基，本試驗結(jié)果表明它還可以增強(qiáng)內(nèi)源性氧自由基清除酶的活性，為應(yīng)用其在動物體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激作用開發(fā)功能性食品提供了理論依據(jù)。

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Medic and its antioxidant properties in vivo

QIU Yan, LI Junying, LIU Chang, WANG Zhixin, WANG Shenlin

(School of Bioscience & Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

In order to optimize the purification conditions and the antioxidant properties in vivo of total flavonoids fromAbelmoschusmanihot(L.) Medic, AB-8 macroporous resin is used for static adorption and elution. The optimum purification conditions are as follows: Sample solution concerntration of 0.1 g/mL, pH 3.5, 70% ethanol as eluant, 20∶1(mL/g) of eluant volum to resin weight ratio. The results in the optimum purification conditions show that the purity of TFA reaches 48.50%. There are no significant difference in indexes of mice organs between experimental groups and normal control group (P>0.05). MDA content exhibits a significant decrease both in serum and liver of mice (P<0.05). While the level of CAT, GSH-Px and SOD activities in serum and liver are higher in experimental groups than those in normal control group showing dose-response relationship. These results indicate that TFA has good antioxidant properties in vivo.

other disciplines of Chinese materia medica；Abelmoschusmanihot(L.) Medic； total flavonoids(TFA)； purification； antioxidant properties

1008-1542(2016)06-0587-07

10.7535/hbkd.2016yx06010

2016-07-13；

2016-08-13；責(zé)任編輯：張士瑩

河北省自然科學(xué)基金(C2014208084，C2014208137)； 河北省高層次人才資助項目(C2015005013)

仇 燕(1977—)，女，河北石家莊人，副教授，博士，主要從事植物次生代謝物及其生理活性方面的研究。

E-mail:qiuyan2015@126.com

TQ461;Q819;R284.2

A

仇 燕，李俊英，劉 暢，等.菜芙蓉總黃酮純化及其體內(nèi)抗氧化性[J].河北科技大學(xué)學(xué)報,2016,37(6):587-593. QIU Yan, LI Junying, LIU Chang, et al.Purification of total flavonoids ofAbelmoschusmanihot(L.) Medic and its antioxidant properties in vivo[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2016,37(6):587-593.