歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)

周 洲，李永麗，安世恒，胡建軍

（1.河南科技大學 林學院，河南 洛陽 471003；2.河南農業(yè)大學 植保學院，河南 鄭州 450002；3.中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所，北京 100091）

歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)

周 洲1，李永麗1，安世恒2，胡建軍3

（1.河南科技大學 林學院，河南 洛陽 471003；2.河南農業(yè)大學 植保學院，河南 鄭州 450002；3.中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所，北京 100091）

歐美楊108生產性狀優(yōu)良，是基因工程轉化的理想受體，高效的組培再生系統(tǒng)是轉化工作的基礎。以歐美楊108莖段、葉柄、葉片3種外植體為起始材料，確定了植株再生過程中誘導叢生芽、芽的莖伸長和生根培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)條件，建立了穩(wěn)定高效的再生培養(yǎng)系統(tǒng)。結果表明：基本培養(yǎng)基MS優(yōu)于WPM；最適從生芽誘導培養(yǎng)基為MS + TDZ 0.05 mg/L + 6-BA 0.05 mg/L + NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L，莖段、葉柄、葉片3種外植體叢生芽誘導率分別達 100%、100%和86%。叢生芽需要進行莖伸長誘導的環(huán)節(jié)，莖伸長誘導效率最高是MS +KT 0.5 mg/L+ GA32 mg/L +果糖30 g/L 培養(yǎng)基，莖段和葉柄叢生芽莖伸長誘導最好，誘導培養(yǎng)20 d，得到平均芽長3 cm的有效芽，增殖系數(shù)大于4。抽莖芽轉入生根培養(yǎng)前，須經(jīng)MS基本培養(yǎng)基壯化培養(yǎng)。在1/2 MS + IAA 0.02 mg/L+ IBA 0.02 mg/L + AC3 g/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基上，試管苗生根率可達100%，苗體健壯。歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)為其遺傳轉化奠定了基礎。

歐美楊108；離體培養(yǎng)；芽伸長誘導；芽壯化培養(yǎng)

歐美楊108P.euramericana‘Guariento’具有優(yōu)良的速生性、抗病蟲害能力及材性，可營造工業(yè)和造紙商品林，也適于營造生態(tài)林改善生態(tài)環(huán)境[1,2]。組培再生系統(tǒng)是其種質資源保存利用和基因轉化研究的基礎[3]。楊樹不同品種再生研究表明[4-14]，楊樹品種間組培再生條件區(qū)別明顯。歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)具有應用價值高，筆者選擇葉片、葉柄和莖段3種外植體，反復試驗啟動培養(yǎng)和循環(huán)繼代培養(yǎng)條件，建立其穩(wěn)定高效的組培再生系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)條件

歐美楊108P.euramericana‘Guariento’由中國林業(yè)科學研究院提供。培養(yǎng)溫度 （26 ±1） ℃，光周期16L:8D，光照度 2 000 lx。

1.2 啟動培養(yǎng)

1.2.1 外植體處理

歐美楊108一年生枝條扦插苗，5～7月剪取新生嫩枝，自來水下流動沖洗2 h。超凈工作臺中，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水洗滌1次；再用1 g/L 的HgCl2溶液浸泡4 min，最后用無菌水洗滌5次，獲得除菌外植體。莖段、葉柄剪成1.5 cm左右長度，幼嫩葉片剪3道切口橫向深達主脈，接種于叢生芽誘導培養(yǎng)基上，葉背面向上；每種外植體接種60個。

1.2.2 叢生芽的誘導與分化

基本培養(yǎng)基MS和wpm，添加不同質量濃度的噻苯?。═DZ）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA），最后添加瓊脂5 g/L，蔗糖30 g/L，滅菌前pH值調整至6.0。15d在原接種培養(yǎng)基上繼代1次，30 d 后統(tǒng)計愈傷和叢生芽誘導狀況，統(tǒng)計各處理叢生芽誘導率。

1.2.3 叢生芽抽莖生長及壯化

基本培養(yǎng)基MS，分別添加TDZ、激動素（KT）、6 -BA、吲哚丁酸（IBA）、NAA、谷氨酰胺（Gln）、赤霉素（GA3）等植物生長調節(jié)物質，部分組合見表2，另附加葡萄糖、果糖或蔗糖30 g/L，瓊脂5 g/L，滅菌前pH值調整至6.0。20 d 后觀察叢生芽伸長狀況，統(tǒng)計各處理的叢生芽伸長率，對比不同生長調節(jié)物質對試管苗莖伸長的影響。

1.2.4 試管苗的生根

基本培養(yǎng)基MS、1/2 MS或1/4 MS，添加吲哚乙酸（IAA）、IBA、NAA，或附加活性炭（AC），另附加蔗糖30 g/L，瓊脂 5 g/L，滅菌前pH值調整至6.0。每處理接種40個4 cm長的芽，20 d 后統(tǒng)計各處理的生根率、每苗平均生根數(shù)、平均根長。

1.3 循環(huán)繼代培養(yǎng)

1.3.1 外植體處理

歐美楊108高度10 cm的生根組培苗，莖段、葉柄分別剪成1 cm的短段；完全展開的葉片剪3道切口橫向深達主脈，葉背面向上，每處理40個外植體接種在叢生芽誘導培養(yǎng)基上。

1.3.2 叢生芽的誘導

基本培養(yǎng)基MS，附加不同含量TDZ、6-BA、NAA組合見表4，另附加瓊脂5 g/L，蔗糖30 g/L，滅菌前pH值調整至6.0。15 d在原接種培養(yǎng)基上繼代1次，培養(yǎng) 30 d 后并觀察愈傷和叢生芽生長狀況，統(tǒng)計各處理叢生芽誘導率（同1.2.2）。

1.3.3 叢生芽抽莖生長及壯化

基本培養(yǎng)基MS，添加KT、GA3、果糖組合見表5，另附加瓊脂5 g/L，蔗糖30 g/L，滅菌前pH值調整至6.0。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計各處理的叢生芽伸長率和平均芽長（同1.2.3）。

2 結果與分析

2.1 啟動培養(yǎng)

2.1.1 田間來源外植體叢生芽的誘導

當6-BA、TDZ和 NAA 同時存在時，莖段、葉柄和葉片3種外植體均可誘導出叢生芽，而其中任意2種調節(jié)物質的組合，未能誘導產生叢生芽（見表1）。相同植物生長調節(jié)物質組合，MS比WPM上的外植體叢生芽誘導率高；經(jīng)過30 d培養(yǎng)，外植體更綠。在MS + TDZ 0.05 mg/L+6-BA 0.05 mg/L+ NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上，接種7 d后，莖段、葉柄外植體切口發(fā)紅膨大，切面中部向外凸起，形成綠色愈傷組織；接種15 d后，愈傷組織開始出現(xiàn)密集的叢生芽，芽誘導率分別達95%和90%。每隔15 d在原培養(yǎng)基上繼代一次，30 d后，叢生芽葉片長度1 cm左右，但沒有莖（見圖 1a、b）。葉片外植體接種10 d后，主葉脈切口處形成的白色愈傷，20 d后出現(xiàn)叢生芽（見圖1c），叢生芽較莖段、葉柄外植體上密度小，叢生芽誘導率10%。

2.1.2 叢生芽誘導莖伸長及壯化培養(yǎng)

叢生芽需誘導莖伸長誘導的環(huán)節(jié)，才能形成有效的再生芽，此過程需更換與叢生芽誘導組分不同的培養(yǎng)基。外植體初始誘導出的叢生芽，在原叢生芽誘導培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；或在叢生芽誘導培養(yǎng)基中再添加GA3；或用IBA代替NAA；或降低細胞分裂素6-BA、TDZ或生長素NAA的含量；或僅有生長素IBA存在，叢生芽的莖均不能伸長生長；隨著培養(yǎng)時間的延長，叢生芽逐漸黃化，甚至褐化死亡。MS培養(yǎng)基附加KT和GA3，能夠較好地誘導叢生芽莖伸長生長。培養(yǎng)基為MS+ KT 0.5 mg/L + GA32 mg/L +果糖 30 g/L時，莖伸長誘導最好，莖段外植體來源的叢生芽伸長率達100 %，第14天芽高度平均3 cm，每外植體平均有4個抽莖芽（見表2）。在莖伸長誘導培養(yǎng)基MS + KT 0.25 mg/L+ GA31 mg/L +果糖30 g/L中，培養(yǎng)14 d后，莖伸長的有效芽平均高2 cm，每外植體平均有3個芽，芽長度稍短；培養(yǎng)基為MS + KT 1 mg/L + GA34 mg/L + 果糖 30 g/L時，培養(yǎng)14 d后，每個外植體平均有3個芽，有效的再生芽平均高3 cm，抽莖芽數(shù)量稍少。莖伸長誘導后得到的芽的莖、葉細弱（見圖 2a、b）；將原外植體攜帶此細弱的芽轉移到MS基本培養(yǎng)基上，可使莖、葉器官逐漸增粗增大，使有效芽木質化程度加深（見圖 2c）。

表1 不同質量濃度的植物生長調節(jié)劑組合對歐美楊108叢生芽誘導的影響Table 1 Effect of different hormone concentration on bud induction of P.euramericana ‘Guariento’

圖1 歐美楊108田間外植體的叢生芽的誘導Fig.1 Shoots induction on different explants from fi eld cultures of P.euramericana ‘Guariento’

表2 不同質量濃度的植物生長調節(jié)劑組合對歐美楊108莖段叢生芽伸長的影響Table 2 Effect of different hormone concentration on enlongation of adventitious shoots from stem xplants of P.euramericana ‘Guariento’

2.1.3 試管苗的生根

圖2 歐美楊108叢生芽的伸長及壯化培養(yǎng)Fig.2 Adventitious shoots enlongation and shoot strengthening of P.euramericana ‘Guariento’

選擇高4～5 cm、莖健壯的無根苗用以生根。植物生長調節(jié)物質不同，試管苗生根差別較大（見表3），在培養(yǎng)基中添加IAA和IBA，生根率高。其中在1/2MS + IAA 0.02 g/L +IBA 0.02 g/L+ AC 3 g/L培養(yǎng)基中生根最好，生根率100%；生根培養(yǎng)7 d后，莖基部長出紅色凸起根點；20 d后生根4條以上，根長度4 cm左右；主根粗壯，側根豐富（見圖 3）。

表3 不同培養(yǎng)基中歐美楊108芽生根Table 3 Shoots rooting of P.euramericana ‘Guariento’ in different culture mediums

圖3 歐美楊108試管苗生根Fig.3 Shoot rooting of P.euramericana ‘Guariento’

2.2 循環(huán)繼代培養(yǎng)

2.2.1 無菌苗外植體誘導叢生芽

TDZ、6-BA和NAA共同存在，且質量濃度在0.025～0.10 mg/L范圍內，全部莖段和葉柄外植體可誘導出叢生芽，葉片外植體叢生芽誘導率較低，誘導率可達86%（見表4）。在MS+TDZ 0.05 mg/L+ 6-BA 0.05 mg/L + NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上，接種5 d后，莖段、葉柄和葉片切口就觀察到綠色愈傷組織形成，15 d左右開始出現(xiàn)大量叢生芽，叢生芽無莖（見圖 4），30 d后叢生芽葉片長為1 cm。TDZ、6-BA和NAA質量濃度在0.025 mg/L或0.10 mg/L時，外植體形成的愈傷體積稍小，叢生芽密度也低。

2.2.2 不同外植體來源的叢生芽伸長差異

在MS + KT 0.25 mg/L + GA31 mg/L+果糖 30 g/L培養(yǎng)基上，叢生芽誘導莖伸長效果最好，可形成數(shù)量較多的有效芽（見圖 5）；但不同外植體來源的叢生芽莖，伸長誘導效率差異明顯（見表5）。莖段和葉柄外植體上的叢生芽莖伸長誘導率100%，葉片外植體上的叢生芽莖伸長誘導率為80%。莖段外植體來源的叢生芽，莖伸長誘導20 d后，每個外植體形成有效芽平均6.3個，芽平均長度4.5 cm，莖伸長誘導效率顯著高于葉柄和葉片外植體。

表4 不同質量濃度的植物生長調節(jié)劑組合對歐美楊108組培苗外植體叢生芽誘導的影響Table 4 Effect of different hormone concentration on shoot induction from tissue-culture plantlet explants of P.euramericana ‘Guariento’

圖4 歐美楊108無菌苗外植體叢生芽的誘導Fig.4 Shoots induction from different explants from tissue culture plantlets of P.euramericana ‘Guariento’

表5 歐美楊108不同外植體叢生芽伸長?Table 5 Difference on adventitious shoots enlongation for explants of P.euramericana ‘Guariento’

圖5 歐美楊108不同外植體的叢生芽莖伸長誘導Fig.5 Adventitious shoots enlongation form different explants of tissue cultured plantlets of P.euramericana ‘Guariento’

3 結論與討論

3.1 TDZ、6-BA和NAA配合誘導叢生芽

在培養(yǎng)條件相同的情況下，TDZ 0.05 mg/L、6-BA 0.05 mg/L 和 NAA 0.05 mg/L 共同配合，歐美楊108叢生芽誘導率最高；但是相同質量濃度的TDZ、6-BA 和 NAA，任何2種配合均不能誘導成芽。在河北楊和新疆楊[8]，以及在‘2001’楊[11]及銀中楊[15]再生過程中，均發(fā)現(xiàn)TDZ對叢生芽分化有重要影響，較低質量濃度的TDZ有利于分化。在歐美楊108叢生芽誘導過程中，6-BA和NAA的配合也非常關鍵，同時也要求存在低質量濃度的TDZ。

3.2 叢生芽需莖伸長誘導環(huán)節(jié)

歐美楊108叢生芽形成后，必須更換培養(yǎng)基，才能促使芽進一步生長，誘導叢生芽和誘導莖伸長所用培養(yǎng)基不同。在KT 0.5 mg/L和GA32 mg/L條件下，輔以30 g/L的果糖碳源培養(yǎng)基上，歐美楊108叢生芽莖伸長誘導效率最高，3種外植體來源的叢生芽均可得到很好伸長。在楊樹許多品種的組織培養(yǎng)中，叢生芽形成后，并非必須誘導莖伸長培養(yǎng)環(huán)節(jié)。白楊派來源的楊樹，往往不用更換培養(yǎng)基，叢生芽的莖葉便繼續(xù)生長[5]；而黑楊派來源的楊樹，往往需更換培養(yǎng)基，減少原莖伸長培養(yǎng)基中細胞分裂素含量，叢生芽方可進一步生長[6]。

本試驗中，叢生芽接種在莖伸長誘導培養(yǎng)基上，GA3含量在2～4 g/L范圍內，均能夠誘導莖伸長。一般認為，GA3對試管苗的增殖和伸長有顯著效果，但是GA3會抑制根原基和芽原基分化，必須在愈傷組織分化后，才能加入GA3[9]。碳源是果糖時，歐美楊108叢生芽莖伸長效率最高，張小蘋[16]也發(fā)現(xiàn)果糖對桑樹叢生芽莖伸長效率更好，不同器官對于不同碳源利用能力差異是原因之所在。

3.3 Ac和壯化培養(yǎng)對生根的重要性

一般認為Ac的作用是通過吸附而發(fā)揮，有效吸附有害物質。在培養(yǎng)基中加入Ac，對許多植物的組培生長均表現(xiàn)出促進作用[17]，并提供了黑暗的生長環(huán)境有助根的形成[18-19]；但也有研究發(fā)現(xiàn)，Ac對楊樹的組培生根有害[10]。在歐美楊108試驗中，設置了Ac梯度，比較其對歐美楊108生根的作用。結果表明，適量的Ac能對其生根起到促進作用，在3 g/L時最有利，不但有助于歐美楊108根系的增粗和伸長，而且防止褐化產生。

對歐美楊108來說，芽的壯化對生根非常重要。經(jīng)誘導莖伸長形成的歐美楊108有效芽，經(jīng)MS壯化培養(yǎng)后，木質化程度加深，莖增粗，葉片增大，誘導生根很容易；如果不經(jīng)壯化培養(yǎng)，則生根困難，苗成活率低。一般從愈傷組織上誘導出的叢生芽較小，長勢不良，如果直接讓其生根，生根率也低，則不易成活，故及時進行壯化培養(yǎng)是有效提高生根率的措施。有研究發(fā)現(xiàn)，部分楊樹品種形成的芽可直接生根，無需壯化。如中黑防楊叢生芽長至0.5 cm左右時，切下轉入莖伸長培養(yǎng)基中，21 d后叢生芽長成無根苗；將苗進行生根培養(yǎng)，基部14 d左右長出白色小根，95%的苗20 d后可長出l～2 cm粗壯的根[7]。歐美楊108同屬于黑楊派，品種間組培生根差別是明顯的，這種差異的原因有待進一步研究。

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Effective tissue culture system forPopulus euramericana‘Guariento’

ZHOU Zhou1, LI Yong-li1, AN Shi-heng2, HU Jian-jun3
(1.College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China;2.College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;3.Research Institute of Forestry, Chinese Academe of Forestry, Beijing 100091, China)

Production behaviors ofP.euramericana‘Guariento’ show that it is a superior variety, so it is a good recipient material for gene transformation.Stem, petiole and leaf were cultured as the initiation explants developing from tender branches outdoor to investigate the micropropagation.The key factors affecting the growth ofP.euramericana‘Guariento’in vitroand the optimal tissue culture conditions for it were ascertained.The optimum basic culture medium was MS.Cultured explants on MS + TDZ 0.05 mg/L +6-BA 0.05 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+ Sucrose 30 g/L was the best way of inducement and differentiation, with inducement rate 100%,100% and 86% for stem, petiole and leaf from tissue culture plantlets.For elongation of the induced buds, the suitable culture medium was MS + KT 0.5 mg/L+ GA32 mg/L+ Fructose 30 g/L.More than 4 shoots about 3 cm high were elongated from the induced buds after 20 days.The optimal subculture medium and root inducement culture medium for shoot were 1/2 MS + IAA 0.02 mg/L + IBA 0.02 mg/L +AC3 g/L+ Sucrose 30 g/L, and the rooting rate was 100%.The high frequency regeneration system forP.euramericana‘Guariento’in vitroprovides a basis for gene modi fi cation in this study.

Populus euramericana‘Guariento’;in vitroculture; shoot elongation induction; shoots strengthen culture

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.001

http: //qks.csuft.edu.cn

A

1673-923X(2016)07-0001-06

2015-03-10

國家自然科學基金項目（U1204324）；河南省科技攻關重點項目（132102110037）

周 洲，副教授，博士；E-mail：zhouzhouhaust@163.com

周 洲，李永麗，安世恒，等.歐美楊108高效組培再生系統(tǒng)[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016, 36(7): 1-6.

[本文編校：吳 毅]