α-分泌酶在自主運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP與Aβ42中的作用研究

余 鋒，徐 波，季 瀏

?

α-分泌酶在自主運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP與Aβ42中的作用研究

余 鋒1，徐 波2，季 瀏2

目的：探討α-分泌酶在16周自主跑輪運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP水解與Aβ42生成中的作用。方法：24只C57系A(chǔ)PP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為自主跑輪運(yùn)動(dòng)組(TE，n=12)和對(duì)照組(TC，n=12)；同時(shí)選取C57系野生型小鼠24只，隨機(jī)分為自主跑輪運(yùn)動(dòng)組(E，n=12)和對(duì)照組(C，n=12)。TE組和E組小鼠從3月齡開(kāi)始，除給予正常飲食、飲水外，給予16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)，TC組和C組小鼠給予正常飲食、飲水，不運(yùn)動(dòng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠海馬α-分泌酶家族的3種主要成員ADAM9、ADAM10和ADAM17 mRNA表達(dá)水平，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠海馬APP、ADAM10和Aβ42蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1)16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)極顯著性上調(diào)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，同時(shí)顯著性上調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；2)16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)顯著上調(diào)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM17 mRNA表達(dá)水平(P<0.05)；3)16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)顯著性下調(diào)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP(P<0.05)和Aβ42(P<0.05)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)可通過(guò)促進(jìn)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬α-分泌酶基因表達(dá)進(jìn)而降低轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP的水平，并抑制APP水解產(chǎn)生Aβ42的水平。

自主跑輪運(yùn)動(dòng)；阿爾茨海默??；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；海馬；α-分泌酶；β-淀粉樣前體蛋白；β-淀粉樣蛋白42

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進(jìn)行性記憶受損和認(rèn)知功能下降的神經(jīng)退行性疾病。AD主要病理特征是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NTFs)，以及神經(jīng)細(xì)胞的減少和腦組織的萎縮等[7]。其中，神經(jīng)細(xì)胞外Aβ異常沉積形成老年斑是導(dǎo)致AD的主要原因之一。

腦內(nèi)Aβ多肽具有極其強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，能誘導(dǎo)腦組織的免疫炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞的異常凋亡、氧化應(yīng)激損傷以及誘導(dǎo)鈣離子穩(wěn)態(tài)。其機(jī)理可能是Aβ易于和神經(jīng)細(xì)胞膜、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)受體結(jié)合，阻礙細(xì)胞膜的物質(zhì)運(yùn)輸[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，外周血中的Aβ可穿越受損的血腦屏障，直接對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[19]。Song等[32]的研究顯示，納摩爾濃度的Aβ即可結(jié)合于神經(jīng)細(xì)胞膜上。Aβ的神經(jīng)毒性還可誘導(dǎo)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)，ROS可導(dǎo)致自由基增加，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加劇，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致鈣離子的大量?jī)?nèi)流，激活鈣依賴性酶的反應(yīng)，這一系列反應(yīng)導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)代謝機(jī)制的紊亂，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的功能損害[11，16]。此外，Aβ還可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的缺失，有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可通過(guò)誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的異常凋亡[28]。Aβ還可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝障礙，Aβ可直接損害細(xì)胞膜，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流和鈣離子超載的發(fā)生，促使細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，導(dǎo)致線粒體的能量供應(yīng)系統(tǒng)功能紊亂[35]，致使神經(jīng)細(xì)胞異常死亡和神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變。

過(guò)去數(shù)十年中，研究者在AD的預(yù)防和治療領(lǐng)域展開(kāi)了大量的研究。在體育科學(xué)領(lǐng)域，運(yùn)動(dòng)干預(yù)被證明可有效預(yù)防和緩解AD的發(fā)病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在改善AD病理機(jī)制方面非常有效，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo)腦內(nèi)Aβ沉積水平的降低[5,20,25,26]，運(yùn)動(dòng)可抑制腦內(nèi)tau蛋白的異常磷酸化進(jìn)程[6,23,24]，運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化功能[14,24,37]、緩解神經(jīng)細(xì)胞死亡的發(fā)生[18,33,34]和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17,26]等，這些均是降低AD風(fēng)險(xiǎn)的重要機(jī)制。因此，運(yùn)動(dòng)干預(yù)在AD病理調(diào)節(jié)中的作用值得進(jìn)一步探討。本研究擬探討α-分泌酶在16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP水解及Aβ42生成中的作用，闡釋自主運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積的可能分子機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

購(gòu)自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模式研究所的3 月齡C57系A(chǔ)PPswe/ PSEN1dE9(APP/PS1)轉(zhuǎn)基因雄性小鼠24 只(體重19.56±1.48 g)和正常野生型C57系小鼠24 只(體重20.24±1.02 g)。各組小鼠每籠1只，獨(dú)立飼養(yǎng)。小鼠飼料購(gòu)自上海斯萊康公司，給予其自由飲水和飲食飼養(yǎng)。環(huán)境溫度控制在22℃～24℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%，自然光照。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照華東師范大學(xué)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)章程》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)章程》飼養(yǎng)和對(duì)待實(shí)驗(yàn)小鼠。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

丹參多酚酸鹽聯(lián)合地爾硫卓治療不穩(wěn)定型心絞痛的療效及對(duì)血清基質(zhì)蛋白酶-9和髓過(guò)氧化物酶水平的影響……………………… 魏曉娟 常榮 李衛(wèi) 等（4）442

隨機(jī)將APP/PS1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠24只分為自主跑輪運(yùn)動(dòng)組(TE，n=12)和對(duì)照組(TC，n=12)，隨機(jī)將野生型C57BL/6 小鼠24只也分為自主跑輪運(yùn)動(dòng)組(E，n=12)和對(duì)照組(C，n=12)。其中，TE 組和E 組小鼠除給予正常飲食和飲水之外，為其提供16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)，具體操作參考Adlard等[5]研究進(jìn)行。通過(guò)安裝在籠蓋上的電子計(jì)數(shù)器記錄小鼠每天的跑輪圈數(shù)，根據(jù)跑輪的直徑計(jì)算跑輪的周長(zhǎng)，再通過(guò)跑輪圈數(shù)與跑輪周長(zhǎng)的乘積計(jì)算小鼠每天的跑動(dòng)距離，作為小鼠每天的運(yùn)動(dòng)量參考值并統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)組小鼠每4天的跑輪平均距離(圖1)。

圖1 本研究E組和TE組小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)的平均距離折線圖Figure 1. The Average Running Distance of Group E and Group TE

1.2.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 實(shí)驗(yàn)

冰上取海馬組織約20 mg，按照Invitrogen Trizol法提取總RNA，采用Toyobo Fsq101反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA(15℃，5 min； 37℃，15 min；85℃， 5 min)，ABI Step One型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)相關(guān)基因相對(duì)含量，熒光染料為T(mén)oyobo QPK201 SYBR GREEN。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟參照Yu等[37]研究進(jìn)行。各目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見(jiàn)表1(引物設(shè)計(jì)與合成均由上海生工生物工程有限公司提供合成服務(wù))。

1.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)

另取海馬組織約20 mg，冰上剪碎放入研磨管中，按照Beyotime P0013 Western及RAP裂解液說(shuō)明書(shū)加入0.5 ml裂解液(含1 mM PMSF)，OMINI Bead Ruptor型磁珠勻漿機(jī)勻漿，14 000 g離心15 min，取上清轉(zhuǎn)入離心管，BCA法測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行蛋白變性。采用8%分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；使用5%脫脂奶粉封閉，一抗于4℃環(huán)境孵育12 h，TBST緩沖液清洗后，HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育2 h，Millipore ECL超敏試劑盒顯影，Alpha FC2型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行冷光掃膜。實(shí)驗(yàn)所用抗體購(gòu)于CST和Abcam公司，使用Flour Chem FC2軟件對(duì)所捕捉圖像進(jìn)行灰度值分析，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照LEEM等[24]的研究。

表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)基因引物序列表(5’- 3’)一覽表Table 1 Gene Primer Sequences for Real-time RT-PCR (5’- 3’)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad繪圖分析軟件以及Excel 2007辦公軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01 為具有極顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)ADAMs(ADAM9、ADAM10和ADAM17) mRNA表達(dá)水平，通過(guò)Western blot法檢測(cè)了APP、ADAM10和Aβ42的蛋白表達(dá)水平。

2.1 各組小鼠海馬ADAMs mRNA表達(dá)水平的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組小鼠相比，TC組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達(dá)水平極顯著性上調(diào)(P<0.01)，ADAM17和ADAM9 mRNA表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異；與TC組小鼠相比，TE組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)極顯著性上調(diào)(P<0.01)，ADAM17 mRNA表達(dá)水平亦顯著性上調(diào)(P<0.05)，ADAM9 mRNA表達(dá)水平較有上調(diào)趨勢(shì)，但不具有顯著性差異；與E組小鼠相比，TE組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達(dá)水平顯著性下調(diào)(P<0.05)，ADAM17 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)極顯著性下調(diào)(P<0.01)，ADAM9 mRNA表達(dá)水平不具有顯著性差異；與C組小鼠相比，E組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達(dá)水平顯著性上調(diào)(P<0.05)，ADAM17 mRNA表達(dá)水平上調(diào)幅度具有極顯著性差異(P<0.01)，ADAM9 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，但無(wú)顯著性差異(表2，圖2)。

表2 各組小鼠海馬ADAMs相對(duì)于GAPDH的mRNA表達(dá)水平一覽表Table 2 mRNA Expression of ADAMs to GAPDH in the Hippocampus of Four Groups

2.2 各組小鼠海馬ADAM10、APP和Aβ42蛋白表達(dá)水平的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組小鼠相比，TC組小鼠海馬ADAM10蛋白表達(dá)水平顯著性下調(diào)(P<0.05)，APP蛋白、Aβ42蛋白表達(dá)水平極顯著性上調(diào)(P<0.01)；與TC組小鼠相比，TE組小鼠海馬ADAM10的蛋白表達(dá)水平顯著性上調(diào)(P<0.05)，APP蛋白、Aβ42蛋白表達(dá)水平顯著性下調(diào)(P<0.05)；與E組小鼠相比，TE組小鼠海馬的ADAM10的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，但兩組之間不具有顯著性差異，而APP蛋白、Aβ42蛋白水平則極顯著性上調(diào)(P<0.01)；與C組小鼠相比，E組小鼠海馬的ADAM10蛋白水平雖上調(diào)，但兩組并無(wú)顯著差異，APP和Aβ42蛋白表達(dá)水平均有下調(diào)趨勢(shì)，但兩組之間亦無(wú)顯著性差異(表3，圖3)。

表3 各組小鼠海馬ADAM10、APP和Aβ42相對(duì)于GAPDH的蛋白表達(dá)水平一覽表Table 3 Protein Expression of ADAM10,APP and Aβ42 to GAPDH in the Hippocampus of Four Groups

圖3 各組小鼠海馬ADAM10、APP和Aβ42相對(duì)于GAPDH的蛋白表達(dá)水平示意圖Figure 3. Protein Expression of ADAM10,APP and Aβ42 to GAPDH in the Hippocampus of four Groups

3 討論

本研究證實(shí)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)APP和Aβ42的表達(dá)水平較野生型小鼠均顯著增加，而抑制APP水解產(chǎn)生Aβ的α-分泌酶的表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明該轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)α-分泌酶在APP非淀粉樣蛋白水解途徑中的作用可能被抑制，APP水解傾向于淀粉樣蛋白產(chǎn)生途徑，導(dǎo)致Aβ沉積的增加。而經(jīng)過(guò)16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組小鼠較轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠，其海馬內(nèi)APP和Aβ42的表達(dá)水平均得到顯著性下調(diào)，且α-分泌酶3種亞型中的2種(ADAM10和ADAM17)得到顯著性上調(diào)。因此，自主跑輪運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)上調(diào)α-分泌酶的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)APP的非淀粉蛋白水解途徑，抑制APP的淀粉樣蛋白水解途徑，減少了海馬Aβ的沉積。

3.1 自主跑輪運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP蛋白表達(dá)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠海馬APP的蛋白表達(dá)水平顯著性高于野生型對(duì)照組小鼠，說(shuō)明本研究所采用的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠成功的模擬AD病理特征，即AD腦內(nèi)APP基因的過(guò)表達(dá)特性。兩組轉(zhuǎn)基因小鼠相比較，則發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬APP蛋白表達(dá)水平被顯著性下調(diào)，說(shuō)明本研究中所采用的16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)能夠有效地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)過(guò)表達(dá)的APP水平。而通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組小鼠和野生型運(yùn)動(dòng)組小鼠的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠在APP的蛋白表達(dá)水平上仍然存在極顯著性的差異，說(shuō)明16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)未能逆轉(zhuǎn)APP基因的過(guò)表達(dá)狀態(tài)，但在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因組小鼠間，運(yùn)動(dòng)可下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)干預(yù)可能在一定范圍內(nèi)抵御由于APP基因過(guò)表達(dá)而導(dǎo)致的APP的蛋白水平的上調(diào)。對(duì)兩個(gè)野生型組小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬APP的蛋白水平較對(duì)照組低，但二者之間不具有顯著性差異，說(shuō)明野生型小鼠海馬APP的基礎(chǔ)蛋白表達(dá)水平較低，可經(jīng)過(guò)正常的非淀粉樣蛋白途徑降解而使其維持在較低的水平，而自主跑輪運(yùn)動(dòng)對(duì)野生型小鼠海馬正常水平APP表達(dá)的調(diào)節(jié)不如對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)過(guò)度表達(dá)的APP蛋白調(diào)節(jié)的敏感性高。

有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦內(nèi)APP基因過(guò)度表達(dá)而超出其正常降解水平時(shí)，傾向于產(chǎn)生更多的Aβ沉積，同時(shí)可導(dǎo)致APP通過(guò)多個(gè)途徑產(chǎn)生Aβ[10]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APP的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)元的病變，如致使神經(jīng)細(xì)胞的死亡，同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦認(rèn)知功能的損害以及腦內(nèi)出現(xiàn)大量淀粉樣斑塊物質(zhì)的沉積[29]。還有研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)APP的過(guò)度表達(dá)可能是其經(jīng)異常途徑水解和Aβ沉積產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致AD發(fā)病的重要因素[15]。

本研究所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是過(guò)度表達(dá)APP基因的小鼠，檢測(cè)結(jié)果充分證實(shí)其腦內(nèi)APP基因被過(guò)度表達(dá)。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)干預(yù)能夠有效地抑制其腦內(nèi)的APP蛋白表達(dá)水平，比前也有類似的報(bào)道，如Wolf等[36]采用APP-23轉(zhuǎn)基因AD小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，將該轉(zhuǎn)基因小鼠置于帶有跑輪的豐富環(huán)境干預(yù)實(shí)驗(yàn)中能夠顯著性降低其腦內(nèi)APP的基因表達(dá)水平。徐波等[4]采用D-半乳糖造模AD大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能夠顯著抑制模型組大鼠海馬APP的基因表達(dá)水平。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，5月的長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)雖然未能顯著性降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的APP蛋白表達(dá)水平，但運(yùn)動(dòng)卻顯著性抑制了APP的淀粉樣途徑的水解產(chǎn)物CTFs和sAPPβ的蛋白水平。以上研究均說(shuō)明，運(yùn)動(dòng)能夠抑制AD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)的APP表達(dá)或其水解產(chǎn)物的表達(dá)水平。

3.2 自主跑輪運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAMs的影響

α-分泌酶是APP非淀粉樣蛋白水解途徑的重要水解酶，而APP的非淀粉樣蛋白水解是腦內(nèi)APP正常水解的主要途徑。若α-分泌酶活動(dòng)異常，腦內(nèi)APP將不能正常水解，并可能激活其他的異常水解途徑(如β-分泌酶發(fā)揮作用)導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生。α-分泌酶的3個(gè)重要成員ADAM9、ADAM10和ADAM17在APP正常水解中發(fā)揮著不可或缺的作用，三者中，ADAM10可直接發(fā)揮著在APP的α-分泌酶位點(diǎn)降解APP的作用[22]，而ADAM9[21]和ADAM17[31]在α-分泌酶對(duì)APP水解的過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型對(duì)照組小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均顯著性下調(diào)，說(shuō)明APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)ADAM10表達(dá)的減少是APP在腦內(nèi)過(guò)度累積的重要原因之一。對(duì)轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組小鼠和轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠比較發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬ADAM10 mRNA表達(dá)水平和蛋白水平均顯著性上調(diào)，結(jié)合上文所述的自主運(yùn)動(dòng)下調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP的蛋白表達(dá)，說(shuō)明自主運(yùn)動(dòng)可通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM10的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)APP向非淀粉樣蛋白途徑水解，促進(jìn)了APP的正常代謝，減少其過(guò)度積累。對(duì)兩個(gè)野生型組小鼠比較發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬ADAM10 mRNA和蛋白水平均有上調(diào)趨勢(shì)，但均不具有顯著性差異，其原因一方面可能與自主跑輪運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度有關(guān)，可以從野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因組小鼠在跑輪距離(圖1)的差異上進(jìn)行解釋，總體上看，野生型小鼠的運(yùn)動(dòng)量顯著小于轉(zhuǎn)基因組小鼠；另一方面，ADAM10的表達(dá)水平可能與野生型小鼠腦內(nèi)APP生成與水解的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，低水平的APP可能通過(guò)反饋性機(jī)制調(diào)節(jié)ADAM10的表達(dá)量。運(yùn)動(dòng)促進(jìn)ADAM10的表達(dá)也得到了其他研究的證實(shí)，Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，5個(gè)月的長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能夠有效上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的ADAM10蛋白表達(dá)水平?？追避姷萚2]研究發(fā)現(xiàn)，6個(gè)月的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著增強(qiáng)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦ADAM10的活性水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM9 和ADAM17 mRNA表達(dá)水平與野生型小鼠相比均無(wú)顯著性差異；APP/PS1轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬ADAM9和ADAM17 mRNA表達(dá)水平較APP/PS1轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠均上調(diào)，但ADAM9 mRNA表達(dá)水平在兩組間不具有顯著性差異，而運(yùn)動(dòng)卻顯著上調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ADAM17 mRNA的表達(dá)；兩組野生型小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬ADAM9和ADAM17 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組小鼠均上調(diào)，但在ADAM9 mRNA表達(dá)上兩組之間無(wú)顯著性差異，而運(yùn)動(dòng)組小鼠的ADAM17 mRNA的表達(dá)水平極顯著上調(diào)。這提示，自主運(yùn)動(dòng)對(duì)ADAM17的調(diào)節(jié)程度比對(duì)ADAM9的調(diào)節(jié)更顯著，也暗示ADAM17在調(diào)節(jié)APP的非淀粉樣蛋白水解途徑中具有更顯著的效果。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究[37]發(fā)現(xiàn)，8周的有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能夠在促進(jìn)D-半乳糖造模AD大鼠海馬ADAM17 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)的同時(shí)抑制海馬Aβ42水平。由于本研究?jī)H檢測(cè)了各組小鼠海馬ADAM9和ADAM17 mRNA表達(dá)情況，未進(jìn)一步檢測(cè)二者的蛋白表達(dá)情況，自主運(yùn)動(dòng)對(duì)二者mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，可能只在一定程度上說(shuō)明運(yùn)動(dòng)具有促進(jìn)ADAM9和ADAM17在腦內(nèi)表達(dá)的效果，不能完全成為證實(shí)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)二者水平調(diào)節(jié)的確切依據(jù)，還需進(jìn)一步深入研究。

3.3 自主跑輪運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ42的影響

Aβ42是最重要的APP降解產(chǎn)物，它比其他的Aβ產(chǎn)物更加難溶，且較易聚積，一旦在神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成斑塊，便難以清除，是神經(jīng)細(xì)胞外老年斑的最主要成分，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的功能紊亂，損害腦的認(rèn)知功能，導(dǎo)致AD的神經(jīng)病理學(xué)特征。

本研究采用的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是研究Aβ沉積誘發(fā)AD的最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，有研究發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因小鼠在4月齡[27]或6月齡[30]時(shí)即可在海馬內(nèi)檢測(cè)到Aβ沉積。而本研究運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)間在小鼠3～7月齡期間，因此，可驗(yàn)證16周運(yùn)動(dòng)對(duì)該轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ42蛋白表達(dá)顯著增加，說(shuō)明兩種小鼠在Aβ42表達(dá)水平上存在先天性差異，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠已在分子水平上表現(xiàn)出AD病理特征。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可在一定程度上驗(yàn)證前人發(fā)現(xiàn)的該轉(zhuǎn)基因小鼠在6月齡即出現(xiàn)海馬Aβ沉積的結(jié)論。

對(duì)兩組轉(zhuǎn)基因小鼠比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬Aβ42蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠顯著下調(diào)，提示，16周自主跑輪運(yùn)動(dòng)可有效促使轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的Aβ蛋白水平的減少。此前研究發(fā)現(xiàn)，自主跑輪運(yùn)動(dòng)能夠有效下調(diào)AD動(dòng)物腦內(nèi)的Aβ水平，如Adlard等[5]對(duì)TgCRND8轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，Nichol等[26]對(duì)Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，Mesa等[12,13]對(duì)3xTg-AD三轉(zhuǎn)基因小鼠的研究均證實(shí)，自主跑輪運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ水平的下調(diào)。

對(duì)轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)組小鼠和野生型運(yùn)動(dòng)組小鼠的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠海馬Aβ42蛋白表達(dá)水平存在極顯著性差異。基于先前的研究基礎(chǔ)，Aβ42是AD腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積的主要組成部分，其在轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的基礎(chǔ)水平可能較高，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)能夠在一定范圍內(nèi)抑制Aβ42的表達(dá)水平，但由于Aβ42難溶且易于聚積而沉積形成斑塊的特性在一定程度上可能會(huì)抵消運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)其抑制性作用。提示，16周的跑輪運(yùn)動(dòng)能夠在一定程度上下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ42的蛋白表達(dá)水平，但運(yùn)動(dòng)干預(yù)并不能使其水平降低至野生型小鼠的水平。

對(duì)兩個(gè)野生型組小鼠的比較發(fā)現(xiàn)，Aβ42蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，提示，野生型小鼠腦內(nèi)Aβ代謝處于產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，腦內(nèi)Aβ的基礎(chǔ)水平較低，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)正常水平Aβ的調(diào)節(jié)作用較弱，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)對(duì)腦內(nèi)正常水平的Aβ不具有明顯的調(diào)節(jié)作用；也說(shuō)明，野生型小鼠腦內(nèi)APP可能主要是在α-分泌酶的作用下經(jīng)非淀粉樣蛋白途徑水解，α-分泌酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制了β-分泌酶的功能，致使腦內(nèi)Aβ蛋白處于較低的水平。

有不少研究發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)也能夠下調(diào)AD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)的Aβ水平，如Cho等[8]對(duì)NSE/PS2m轉(zhuǎn)基因AD小鼠的研究，Um等[33]對(duì)NSE/APPswe轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，Um等[34]對(duì)NSE/PS2m轉(zhuǎn)基因AD小鼠的研究，Kang等[18]對(duì)PS2轉(zhuǎn)基因小鼠的研究等均證實(shí)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可抑制轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)Aβ水平。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[37]也發(fā)現(xiàn)，8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)抑制了D-半乳糖造模AD大鼠海馬Aβ42的表達(dá)。綜合本研究結(jié)果與先前研究結(jié)論可以發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是自主跑輪運(yùn)動(dòng)還是跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)均能不同程度的抑制AD腦內(nèi)的Aβ水平。

4 結(jié)論

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP和Aβ42的蛋白表達(dá)水平較同月齡野生型小鼠顯著性增加，其海馬的α-分泌酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。16周的自主跑輪運(yùn)動(dòng)能夠顯著性下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬APP和Aβ42的蛋白表達(dá)水平，上調(diào)α-分泌酶主要家族成員的mRNA和蛋白表達(dá)水平。推測(cè)自主跑輪運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)提高轉(zhuǎn)基因小鼠海馬α-分泌酶的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)海馬APP的表達(dá)，抑制海馬Aβ的沉積。

[1]戴雪伶,姜招峰.阿爾茨海默氏病中β-淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性及其治療策略[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,(8):1577-1579.

[2]孔繁軍,周婷,王賀成,等.規(guī)律性運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生,2013,13(3):232-234.

[3]劉文娟,戴雪伶,姜招峰.β-淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性及其防治策略[J].生命科學(xué),2011,(10):1022-1026.

[4]徐波,余鋒,張憲亮,等.跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)D-半乳糖阿爾茨海默病大鼠海馬β-淀粉樣前體蛋白和Tau蛋白基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2014,(11):1010-1015.

[5]ADLARD P A,PERREAU V M,POP V,etal.Voluntary exercise decreases amyloid load in a transgenic model of Alzheimer's disease[J].J Neurosci,2005,25(17):4217-4221.

[6]BELARBI K,BURNOUF S,FERNANDEZ-GOMEZ F J,etal.Beneficial effects of exercise in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease-like Tau pathology[J].Neurobiol Dis,2011,43(2):486-494.

[7]BLENNOW K,DE LEON M J,ZETTERBERG H.Alzheimer’s Disease[C].2006:387-403.

[8]CHO J Y,HWANG D Y,KANG T S,etal.Use of NSE/PS2m-transgenic mice in the study of the protective effect of exercise on Alzheimer's disease[J].J Sports Sci,2003,21(11):943-951.

[9]DEUSS M,REISS K,HARTMANN D.Part-time alpha-secretases:The functional biology of ADAM 9,10 and 17[J].Curr Alzheimer Res,2008,5(2):187-201.

[10]DU J T,YU C H,ZHOU L X,etal.Phosphorylation modulates the local conformation and self-aggregation ability of a peptide from the fourth tau microtubule-binding repeat[J].FEBS J,2007,274(19):5012-5020.

[11]ESCH F S,KEIM P S,BEATTIE E C,etal.Cleavage of amyloid beta peptide during constitutive processing of its precursor[J].Sci,1990,248(4959):1122-1124.

[12]GARCIA-MESA Y,GIMENEZ-LLORT L,LOPEZ L C,etal.Melatonin plus physical exercise are highly neuroprotective in the 3xTg-AD mouse[J].Neurobiol Aging,2012,33(6):1113-1124.

[13]GARCIA-MESA Y,LOPEZ-RAMOS J C,GIMENEZ-LLORT L,etal.Physical exercise protects against Alzheimer's disease in 3xTg-AD mice[J].J Alzheimers Dis,2011,24(3):421-454.

[14]GIMENEZ-LLORT L,GARCIA Y,BUCCIERI K,etal.Gender-specific neuroimmunoendocrine response to treadmill exercise in 3xTg-AD mice[J].Int J Alzheimers Dis,2010,(3):128354.

[15]GOTZ J,CHEN F,VAN DORPE J,etal.Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils[J].Sci,2001,293(5534):1491-1495.

[16]HALLIWELL B,GUTTERIDGE J M.The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases[J].Mol Aspects Med,1985,8(2):89-193.

[17]HERRING A,DONATH A,YARMOLENKO M,etal.Exercise during pregnancy mitigates Alzheimer-like pathology in mouse offspring[J].FASEB J,2012,26(1):117-128.

[18]KANG E B,KWON I S,KOO J H,etal.Treadmill exercise represses neuronal cell death and inflammation during Abeta-induced ER stress by regulating unfolded protein response in aged presenilin 2 mutant mice[J].Apoptosis,2013,18(11):1332-1347.

[19]KAZEMI K,MOGHADDAM H A,GREBE R,etal.A neonatal atlas template for spatial normalization of whole-brain magnetic resonance images of newborns:preliminary results[J].Neuroimage,2007,37(2):463-473.

[20]KE H C,HUANG H J,LIANG K C,etal.Selective improvement of cognitive function in adult and aged APP/PS1 transgenic mice by continuous non-shock treadmill exercise[J].Brain Res,2011,1403:1-11.

[21]KOIKE H,TOMIOKA S,SORIMACHI H,etal.Membrane-anchored metalloprotease MDC9 has an alpha-secretase activity responsible for processing the amyloid precursor protein[J].Biochem J,1999,343(2):371-375.

[22]LAMMICH S,KOJRO E,POSTINA R,etal.Constitutive and regulated alpha-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by a disintegrin metalloprotease[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(7):3922-3927.

[23]LEEM Y H,LIM H J,SHIM S B,etal.Repression of tau hyperphosphorylation by chronic endurance exercise in aged transgenic mouse model of tauopathies[J].J Neurosci Res,2009,87(11):2561-2570.

[24]LEEM Y H,LEE Y I,SON H J,etal.Chronic exercise ameliorates the neuroinflammation in mice carrying NSE/htau23[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,406(3):359-365.

[25]LIU H L,ZHAO G,ZHANG H,etal.Long-term treadmill exercise inhibits the progression of Alzheimer's disease-like neuropathology in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice[J].Behav Brain Res,2013,256:261-272.

[26]NICHOL K E,POON W W,PARACHIKOVA A I,etal.Exercise alters the immune profile in Tg2576 Alzheimer mice toward a response coincident with improved cognitive performance and decreased amyloid[J].J Neuroinflamm,2008,5:13.

[27]PERIN E C,SILVA G V,VELA D C,etal.Human hepatocyte growth factor (VM202) gene therapy via transendocardial injection in a pig model of chronic myocardial ischemia[J].J Card Fail,2011,17(7):601-611.

[28]QIN W,PENG Y,KSIEZAK-REDING H,etal.Inhibition of cyclooxygenase as potential novel therapeutic strategy in N141I presenilin-2 familial Alzheimer's disease[J].Mol Psychiatry,2006,11(2):172-181.

[29]RAPOPORT M,FERREIRA A.PD98059 prevents neurite degeneration induced by fibrillar beta-amyloid in mature hippocampal neurons[J].J Neurochem,2000,74(1):125-133.

[30]SAVONENKO A,XU G M,MELNIKOVA T,etal.Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease:relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities[J].Neurobiol Dis,2005,18(3):602-617.

[31]SLACK B E,MA L K,SEAH C C.Constitutive shedding of the amyloid precursor protein ectodomain is up-regulated by tumour necrosis factor-alpha converting enzyme[J].Biochem J,2001,357(3):787-794.

[32]SONG Y,MULLER B,BURMAN C,etal.A model-aided segmentation in urethra identification based on an atlas human autopsy image for intensity modulated radiation therapy[J].Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc,2007:3532-3535.

[33]UM H S,KANG E B,LEEM Y H,etal.Exercise training acts as a therapeutic strategy for reduction of the pathogenic phenotypes for Alzheimer's disease in an NSE/APPsw-transgenic model[J].Int J Mol Med,2008,22(4):529-539.

[34]UM H S,KANG E B,KOO J H,etal.Treadmill exercise represses neuronal cell death in an aged transgenic mouse model of Alzheimer's disease[J].Neurosci Res,2011,69(2):161-173.

[35]VERRI M,PASTORIS O,DOSSENA M,etal.Mitochondrial alterations,oxidative stress and neuroinflammation in Alzheimer's disease[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2012,25(2):345-353.

[36]WOLF S A,KRONENBERG G,LEHMANN K,etal.Cognitive and physical activity differently modulate disease progression in the amyloid precursor protein (APP)-23 model of Alzheimer's disease[J].Biol Psychiatry,2006,60(12):1314-1323.

[37]YU F,XU B,SONG C,etal.Treadmill exercise slows cognitive deficits in aging rats by antioxidation and inhibition of amyloid production[J].Neuroreport,2013,24(6):342-347.

Research on Effect of α-secretase on Regulating Hippocampal APP and Aβ42 in APP/PS1 Transgenic Mice of Alzheimer’s disease after Voluntary Wheel Running

YU Feng1,XU Bo2,JI Liu2

Objective:To observe the effect of α-secretase on the hippocampal APP cleaving and Aβ42 deposition in transgenic mice of Alzheimer’s disease (AD) after 16 weeks voluntary wheel running.Methods:24 male APP/PS1 transgenic mice of line C57 that expresses human mutant APP and PS1 in the brain were chosen and divided into wheel running group (TE,n=12) and control group (TC，n=12).Meanwhile,24 male wild-type mice in line C57 were chose and divided into wheel running group (E,n=12) and control group (C，n=12).Mice in group TE and group E were subjected to wheel running with ad libitum access to food and water for 16 weeks from 3 months of age.Mice in group TC and group C were subjected to food and water ad libitum,without exercise.Real-time RT-PCR was used to detect mRNA level of the main member of α-secretase,ADAM9,ADAM10 and ADAM17.Western blot was used to detect protein level of APP,ADAM10 and Aβ42.Results:(1)16 weeks wheel running significantly up-regulated the expression of ADAM10 mRNA (P<0.01) and ADAM10 protein (P<0.05) in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.(2)16 weeks wheel running significantly up-regulated the expression of ADAM17 mRNA (P<0.05) in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.(3) 16 weeks wheel running significantly decreased the protein expression of APP (P<0.05) and Aβ42 (P<0.05) in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.Conclusion:16 weeks wheel running decreased the level of APP and its production Aβ42 by promoting the gene expression of α-secretase in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice.

voluntarywheelrunning;Alzheimer’sdisease;APP/PS1transgenicmice;hippocampus;α-secretase;APP;Aβ42

2015-10-21；

2016-06-05

青少年P(guān)OWER工程協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(44801400/011);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371204)。

余鋒(1983-)，男，河南信陽(yáng)人，講師，博士，主要研究方向?yàn)槟X健康的運(yùn)動(dòng)干預(yù)，Tel：(0517)83525585，E-mail：yfyf005@163.com；徐波(1963-)，男，山東萊陽(yáng)人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)轶w育運(yùn)動(dòng)與身心健康、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)，Tel：(021)54342612，E-mail:bxu@tyxx.ecnu.edu.cn；季瀏(1961-)，男，江蘇泰興人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)榍嗌倌牦w質(zhì)健康評(píng)價(jià)、體育課程與教學(xué)、體育心理學(xué)，Tel：(021)54345131，E-mail:lji@tyxx.ecnu.edu.cn。

1.淮陰師范學(xué)院，江蘇 淮安 223300;2.華東師范大學(xué) “青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241 1.Huaiyin Normal University,Huaian,223300,China;2.East China Normal University,Shanghai 200241,China.

G804.2

A

10.16469/j.css.201607006