大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后大鼠額葉神經(jīng)元凋亡和線粒體形態(tài)變化及Drp1、Mfn2表達(dá)的研究

王 璐，鄧文騫

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大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后大鼠額葉神經(jīng)元凋亡和線粒體形態(tài)變化及Drp1、Mfn2表達(dá)的研究

王 璐，鄧文騫

目的：通過觀察一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)以及線粒體融合分裂基因及蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，探討一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)引起大鼠額葉神經(jīng)元凋亡發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。方法：72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組(C組，n=18)，一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)組(E組，n=54)，再根據(jù)運(yùn)動(dòng)后取材時(shí)間的不同將E組分為：即刻組(E0組，n=18)；24h組(E24組，n=18)；48h組(E48組，n=18)。C組常規(guī)飼養(yǎng)，E組進(jìn)行一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)，無負(fù)重游泳4小時(shí)。用透射電鏡觀察額葉神經(jīng)元及神經(jīng)元線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)；用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)；檢測線粒體融合分裂基因Drp1、Mfn2 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：檢測發(fā)現(xiàn)E組大鼠大腦額葉神經(jīng)元發(fā)生了細(xì)胞凋亡，E組各組大鼠AI顯著性高于C組(P<0.01)，E組各時(shí)間點(diǎn)AI比較為：E24>E0> E48，各組間差異均具有顯著性(P<0.05)。一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后各時(shí)間點(diǎn)Drp1和Mfn2 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均高于C組(P<0.05)，其中E24組大鼠大腦額葉Drp1和Mfn2 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)最強(qiáng)(P<0.01)；與E24組比較，E48組大鼠大腦額葉Drp1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)下調(diào)顯著(P<0.05)，而Mfn2 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)下調(diào)不明顯(P>0.05)。結(jié)論：一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)引起大鼠額葉神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)元線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，該異常在運(yùn)動(dòng)后48h內(nèi)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)性變化，機(jī)體可能通過調(diào)節(jié)線粒體融合分裂基因Drp1、Mfn2表達(dá)，影響大鼠額葉線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，從而調(diào)控額葉神經(jīng)元凋亡的發(fā)生和發(fā)展。

額葉；線粒體；游泳運(yùn)動(dòng)；Drp1；Mfn2

0 前言

腦作為機(jī)體中對低氧或缺氧非常敏感的器官，其耗氧量占機(jī)體總耗氧量的23%，當(dāng)?shù)脱趸蛉毖鯐r(shí)，往往對腦造成比較嚴(yán)重的損傷[1]。大量研究表明，不適宜的運(yùn)動(dòng)對機(jī)體產(chǎn)生不良的影響，甚至造成機(jī)體的損傷，如：力竭運(yùn)動(dòng)或極限負(fù)荷運(yùn)動(dòng)造成大鼠大腦發(fā)生缺血缺氧性損傷[2-3]，然而運(yùn)動(dòng)引起損傷的機(jī)制目前尚未十分明了。因此，研究運(yùn)動(dòng)性腦缺血缺氧損傷的應(yīng)答機(jī)制具有十分重要的意義，也成為了運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)。

研究表明，線粒體是一種具有高度動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，線粒體的形態(tài)、數(shù)量和質(zhì)量，在細(xì)胞不同的生命時(shí)相、生理過程和環(huán)境條件下，具有高度可塑性，各種生理刺激都會(huì)調(diào)節(jié)線粒體的自噬[4-5]、分裂與融合[6-9]等。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了作用于線粒體融合的Mfn1/2和觸發(fā)線粒體分裂的Drp1等基因，無論是短時(shí)間運(yùn)動(dòng)還是長期運(yùn)動(dòng)，均會(huì)通過調(diào)節(jié)肌細(xì)胞線粒體分裂融合基因Mfn1/2和Drp1的轉(zhuǎn)錄，對肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的分裂融合產(chǎn)生影響，提高能量代謝耦聯(lián)效率，為適應(yīng)骨骼肌對能量的需求作出應(yīng)答。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)能引起大鼠腦細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2-3]。也有研究表明Drp1對細(xì)胞凋亡存在調(diào)控作用，在凋亡刺激下線粒體總是從網(wǎng)格結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚頪10-11]。那么，腦作為對能量變化以及缺氧低氧極其敏感的器官，在運(yùn)動(dòng)中會(huì)受到能量代謝短缺以及缺血缺氧的雙重影響，線粒體作為腦細(xì)胞主要耗氧和供能的細(xì)胞器，當(dāng)經(jīng)歷一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)刺激后，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)是否會(huì)發(fā)生變化？是否會(huì)涉及線粒體融合與分裂的改變？目前少見報(bào)道。

有研究發(fā)現(xiàn)，Mfn1/2的表達(dá)在急性運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)內(nèi)顯著上調(diào)趨勢[12]，也有研究報(bào)道，Mfn1/2 mRNA表達(dá)在一次性遞增負(fù)荷急性運(yùn)動(dòng)后，恢復(fù)期出現(xiàn)了類似于超量恢復(fù)的時(shí)相性變化[13]。本實(shí)驗(yàn)建立SD大鼠一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)模型，通過觀察48h內(nèi)大鼠額葉線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)展變化，檢測大鼠額葉神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展，觀察線粒體融合分裂相關(guān)因子Drp1、Mfn2的表達(dá)情況，探討一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后48h內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化對腦細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

6周齡的SPF級雄性SD大鼠72只，體重(226±21)g。大鼠購于成都市達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-24。使用許可證號：SCXK(川)2013-34，動(dòng)物批號：20150328。飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼料，環(huán)境溫度22℃左右，相對濕度50%-70%。將大鼠隨機(jī)分組，分為空白對照組(C組，n=18)，大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)組(E組)，再根據(jù)一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后取材時(shí)間的不同(即刻、24h和48h)，將大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組分為：大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)即刻組(E0組，n=18)，大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)24h組(E24組，n=18)，和大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)48h組(E48組，n=18)。

1.2 實(shí)驗(yàn)造模

C組：常規(guī)飼養(yǎng)；E組：前3天進(jìn)行無負(fù)重10min適應(yīng)性游泳，休息一天后，進(jìn)行一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方式為無負(fù)重游泳，水溫31±1℃，如大鼠沉入水底則撈出休息5分鐘后繼續(xù)，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為4h。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材

根據(jù)后期實(shí)驗(yàn)方法的不同要求，采用分別為斷頭處死取材和灌注取材兩種取材方法。斷頭處死取材：E組進(jìn)行一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)。各組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行斷頭處死，處死后迅速破壞其頭蓋骨取出大腦組織，剝離出額葉部分，隨即放入液氮中冷凍保存，備用。灌注取材：大鼠按2.3ml/kg體重腹腔注射剛配制的2%的戊巴比妥鈉，進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，各組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行4%多聚甲醛灌注，6只進(jìn)行2.5%戊二醛灌注。隨后剝離出大腦額葉分別放入裝有4%多聚甲醛固定液和2.5%戊二醛固定液的小瓶中浸泡固定，4℃冰箱貯存，備用。C組大鼠按以上方法提前一天取材。

1.4 TUNEL法檢測方法

從4℃冰箱中取出蠟塊，制成4μm額狀切片，每個(gè)額葉標(biāo)本取4張切片。脫蠟去水；用Proteinase K工作液處理標(biāo)本；封閉液中室溫封閉10min；加100μl TdT酶反應(yīng)液避光，放入37℃孵箱60min；用SSC終止反應(yīng)；用0.3%H2O2/PBS封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性；加100μl Streptavidin-HRP工作液避光，放入37℃孵箱60min；加90μl DAB顯色液顯色；不復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，拍照。

TUNEL法結(jié)果判斷方法：整個(gè)細(xì)胞核被標(biāo)記為黃褐色的細(xì)胞，或者是胞漿中整個(gè)凋亡小體被標(biāo)記為黃褐色的細(xì)胞，則可視為凋亡細(xì)胞。選取每張切片5-10個(gè)視野，在400倍鏡下，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的100個(gè)細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞和凋亡小體數(shù)目，取其平均值作為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.5 透射電鏡檢測方法

取出2.5%戊二醛固定大鼠額葉標(biāo)本，將制備好的標(biāo)本電鏡切片用，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，然后用透射電鏡進(jìn)行觀察、拍片。透射電鏡檢測于四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科電鏡室完成。

1.6 Real-Time PCR 檢測方法

取部分液氮保存額葉組織，按60-100 mg/ml Trizol劑量加入Trizol提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測定RNA含量、純度；采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；采用Thermo Scientific SYBR-Green PCR mix進(jìn)行Real-time PCR。引物序列：Drp1(擴(kuò)增長度222bp)上游：5′-gtg ggaagagct cag tgctggaaa gc-3′，下游：5′-ctt gtcgaattt catcaaaatctgtgtaaa g-3′；Mfn2(擴(kuò)增長度135 bp)上游：5′-gat gtcaccacg gag ctg ga-3′，下游：5′-aga gacgctcactcactt tg-3′；β-actin(擴(kuò)增長度200bp)上游：5′-cac ccgcgagtacaacct tc-3′，下游：5′-ccc ata ccc accatcaca cc-3′。待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，觀察溶解曲線是否為單一峰，以確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；查看Drp1、Mfn2和β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率E是否接近1。用Bio-Rad CFX Manager system自動(dòng)處理分析出數(shù)據(jù)，采用2-△△CT(Livak)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)Ct值，計(jì)算Drp1、Mfn2基因的相對表達(dá)量。

1.7 Western blotting 檢測方法

取部分液氮保存的額葉組織，80μl的裂解液(1mlRIPA裂解液+10μlPMSF溶液)中(蛋白裂解液購自北京百泰克生物試劑公司)，加入4mg組織樣本，混合后加到玻璃勻漿管中充分勻漿至組織塊完全碎裂，再用超聲破膜，大約10s，然后靜止于冰上40min，使其充分裂解。放入到4℃低溫離心機(jī)中14 000rcf離心5min，取上清，分裝于EP管中，-80℃保存，待用。

采用碧云天BCA 蛋白定量試劑盒定量檢測各標(biāo)本總蛋白濃度和胞漿蛋白濃度。各標(biāo)本取20 μg總蛋白加入上樣緩沖液后于熱板上煮10min，隨后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，X 線膠片曝光進(jìn)行免疫印記信號檢測。Western blotting所用抗體：鼠單克隆一抗(英國Abcam公司)，山羊抗大鼠lgG/辣根酶(英國Abcam公司)。電泳結(jié)果采用Quantity One 圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式進(jìn)行表示，用T檢驗(yàn)組間差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異性，用P<0.01表示非常顯著性差異，用P<0.05表示顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 TUNEL法結(jié)果

2.1.1 TUNEL法染色結(jié)果

在400倍光鏡下觀察各組大鼠額葉TUNEL法切片：與C組相比較，E組各時(shí)相的額葉中，均可見多數(shù)神經(jīng)元胞核和胞漿中凋亡小體被標(biāo)記呈黃褐色，而C組幾乎沒有；E組組內(nèi)各時(shí)相比較發(fā)現(xiàn)，以24h這個(gè)時(shí)相的額葉中，胞核和胞漿中凋亡小體被標(biāo)記呈黃褐色的凋亡神經(jīng)元最多，48h時(shí)胞核和胞漿中凋亡小體被標(biāo)記呈黃褐色凋亡神經(jīng)元有所減少(見圖1)。

2.1.2 細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)檢測結(jié)果

與C組比較：E0組和E24組大鼠額葉的AI非常顯著性上調(diào)(P<0.01，P<0.01)；E48組大鼠額葉的AI顯著性上調(diào)(P<0.05)。

E組內(nèi)各時(shí)相比較：E24組大鼠額葉的AI較E0組顯著升高(P<0.05)，E48組較E0組和E24組顯著下降(P<0.05，P<0.05)。(圖2)

圖1 各組大鼠額葉TUNEL法染色結(jié)果(×40)

Figure 1 The TUNEL results of rats’ loubus fromatis in groups(×40)

注：圖中整個(gè)細(xì)胞核被標(biāo)記，或者是胞漿中整個(gè)凋亡小體被標(biāo)記呈黃褐色的細(xì)胞為TUNEL法的陽性反應(yīng)，即為凋亡細(xì)胞；1-C組；2-E0組；3-E24組；4-E48組。

圖2 各組大鼠額葉AI比較示意圖

Figure 2 The AIof rats’ loubus fromatis in groups

注：▲P<0.01，與C組比較；#P<0.05，與C組比較；★P<0.05，與E0；☆P<0.05，與E24比較。(下同)

2.2 大鼠額葉超微結(jié)構(gòu)

通過透射電鏡對大鼠額葉進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)C組大鼠額葉的神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞核大且圓；細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器較豐富，可見線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細(xì)胞器；線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，分布均勻。E0組和E24組大鼠額葉的神經(jīng)元形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則；細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡；細(xì)胞質(zhì)中可見多數(shù)線粒體腫脹變形明顯，嵴結(jié)構(gòu)模糊或斷裂，甚至產(chǎn)生空泡狀，線粒體的完整性遭到破壞(詳見圖 3箭頭所示)。E48組大鼠額葉的神經(jīng)元形態(tài)和細(xì)胞核基本恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和形態(tài)；細(xì)胞質(zhì)較為均勻，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器較豐富，可見線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細(xì)胞器；且線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量較多，分布不太均勻(詳見圖3箭頭所示)。

圖3 各組大鼠額葉神經(jīng)元和線粒體透射電子顯微鏡結(jié)果

Figure 3 The TEM results of rats’ loubus fromatis neurons and mitochondria in groups

2.3 Drp1和Mfn2 mPNA轉(zhuǎn)錄Peal-time PCR檢測結(jié)果

與C組比較：E0組和E24組大鼠額葉的Drp1和Mfn2mRNA轉(zhuǎn)錄水平非常顯著性上調(diào)(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)；E48組大鼠額葉的Drp1和Mfn2mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著性上調(diào)(P<0.05，P<0.05)。

E組內(nèi)各時(shí)相比較：E24組大鼠額葉的Drp1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較E0組顯著升高(P<0.05)，E48組較E0組和E24組顯著下降(P<0.05，P<0.05)。E24組大鼠額葉的Mfn2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在48h內(nèi)維持在一個(gè)較高的水平，各時(shí)間點(diǎn)不具有顯著性差異(P>0.05)。(見圖4)

圖4 各組大鼠額葉Drp1和Mfn2 mRNA

轉(zhuǎn)錄水平比較示意圖

Figure 4 The comparison of Drp1 and Mfn2 mRNA of rats’ loubus fromatis in groups

2.4 Drp1和Mfn2蛋白表達(dá)Western-blotting檢測結(jié)果

與C組比較：E0組和E24組大鼠額葉的Drp1和 Mfn2蛋白表達(dá)水平非常顯著性上調(diào)(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)；E48組大鼠額葉的Drp1和Mfn2蛋白表達(dá)水平顯著性上調(diào)(P<0.05，P<0.05)。

E組內(nèi)各時(shí)相比較：E24組大鼠額葉的Drp1蛋白表達(dá)水平較E0組顯著升高(P<0.05)，E48組較E0組和E24組顯著下降(P<0.05，P<0.05)；而E24組Mfn2的蛋白表達(dá)水平與E0組比較有上升趨勢，但不具有顯著性差異(P>0.05)，E48組較E0組和E24組有所下降，但不具有顯著性差異(P>0.05，P>0.05)。(詳見圖5)

圖5 各組大鼠額葉Drp1和Mfn2蛋白表達(dá)量比較示意圖

Figure 5 The schematic diagram of the express quantity of Drp1 and Mfn2proteinof rats’ loubus fromatis in groups

3 討論

研究表明，適宜的運(yùn)動(dòng)增進(jìn)健康，預(yù)防疾病的發(fā)生發(fā)展，延年益壽；而過度劇烈運(yùn)動(dòng)或力竭運(yùn)動(dòng)，則會(huì)引起機(jī)體不適，甚至造成機(jī)體的損傷。前期研究表明，一次性力竭運(yùn)動(dòng)能引起的大鼠大腦皮質(zhì)和海馬細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害[2-3]，然而其中的機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)對SD大鼠采取4小時(shí)的無負(fù)重大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)，并持續(xù)觀察運(yùn)動(dòng)結(jié)束后48小時(shí)內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化情況。檢測發(fā)現(xiàn)，E組一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后大鼠額葉AI，較C顯著增加(P<0.05)，提示一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)造成了大鼠的額葉損傷。在一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后的3個(gè)時(shí)相：即刻、24h和48h，檢測發(fā)現(xiàn)：AI在24h這個(gè)時(shí)相增加最為顯著。提示：一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)造成的腦損傷存在一定的延遲性，且在48小時(shí)時(shí)逐漸好轉(zhuǎn)。

近期研究發(fā)現(xiàn)線粒體是具有高度動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，當(dāng)受到外界刺激，易出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)上的異常改變[14]。研究表明在急性低氧和運(yùn)動(dòng)性缺氧條件下，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的染色質(zhì)凝集、邊緣化，線粒體腫脹變形，嵴結(jié)構(gòu)模糊，線粒體的完整性遭到損傷，電子傳遞鏈上的電子漏增加[15-16]；在低氧的環(huán)境下或者是運(yùn)動(dòng)造成運(yùn)動(dòng)性缺氧都會(huì)損傷大鼠大腦神經(jīng)元，甚至影響線粒體的超微結(jié)構(gòu)，造成線粒體電子傳遞鏈結(jié)構(gòu)的不完整，從而使線粒體的呼吸功能下降，導(dǎo)致能量代謝障礙。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞和恢復(fù)，與大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后大鼠額葉神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展趨勢具有一致性。研究表明：線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化深刻影響其功能，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)是其功能可見的外在表現(xiàn)形式，本實(shí)驗(yàn)中一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)破壞了線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，勢必會(huì)影響線粒體的功能，從而造成額葉神經(jīng)元的功能障礙，這提示線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性關(guān)系著細(xì)胞的功能狀況。

線粒體的形態(tài)變化受控于保守的蛋白裝置[17-18]，分別為作用于線粒體外膜融合的Mfn1/2，和作用于線粒體內(nèi)膜融合的OPA1；觸發(fā)線粒體分裂的Fis1和Drp1。近期研究表明，線粒體的形態(tài)變化在不同運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度中做出不同的應(yīng)答反應(yīng)。Cartoni等[12]發(fā)現(xiàn)，一次中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可增加人體骨骼肌線粒體融合基因的轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達(dá)水平。研究表明：急性運(yùn)動(dòng)會(huì)引起線粒體移動(dòng)增加，以滿足運(yùn)動(dòng)中對能量需求的急劇變化；并推測這種移動(dòng)可能是由線粒體分裂與融合mRNA所致，促進(jìn)線粒體網(wǎng)格結(jié)構(gòu)趨于分裂，利于線粒體在細(xì)胞內(nèi)重新分布[19]。Mfn1/2 mRNA表達(dá)水平在運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)顯著上調(diào)[12]。Mfn1/2 mRNA表達(dá)在一次遞增負(fù)荷急性運(yùn)動(dòng)中和運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期，呈現(xiàn)類似超量恢復(fù)的時(shí)相性變化[13]。長期有氧訓(xùn)練可以提高骨骼肌線粒體的氧化磷酸化能力，以及促進(jìn)調(diào)控線粒體形態(tài)變化的Mfn2和Drp1的表達(dá)[20]。漆正堂等[21]研究表明，大強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)可能通過調(diào)控Mfn2、Drp1 mRNA與蛋白表達(dá)水平，影響骨骼肌線粒體的融合與分裂；而長時(shí)間低強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)，可能通過調(diào)控Mfn1 mRNA發(fā)揮類似作用。本研究發(fā)現(xiàn)，一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)上調(diào)Drp1和Mfn2的表達(dá)，使線粒體分裂融合增加，以滿足運(yùn)動(dòng)中機(jī)體對能量的需求和對運(yùn)動(dòng)性低氧的適應(yīng)；然而Drp1的表達(dá)過度增加，則會(huì)使線粒體分裂融合平衡紊亂，導(dǎo)致線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，引發(fā)功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)E24組Drp1的表達(dá)上調(diào)非常顯著，從而打破了線粒體分裂融合的平衡。同時(shí)，研究表明Drp1對細(xì)胞凋亡的有調(diào)控作用，在凋亡刺激下線粒體總是從網(wǎng)格結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚頪10]。線粒體的分裂是在細(xì)胞凋亡過程中不斷發(fā)生的事件[11]。也有研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡是分裂事件引發(fā)的下游事件[22]。推測，一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可能是通過核基因上調(diào)Drp1的表達(dá)所引起的。

而運(yùn)動(dòng)結(jié)束后48h內(nèi)Mfn2表達(dá)一直保持在一個(gè)較高的水平，特別是E48組Mfn2表達(dá)下降不顯著，有效緩解了細(xì)胞凋亡的繼續(xù)發(fā)生，促進(jìn)了線粒體的自我修復(fù)。推測運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)了Mfn2表達(dá)的增加，一方面是線粒體網(wǎng)格化程度增加，加強(qiáng)了線粒體與線粒體之間的交流，提高線粒體能量代謝效率，有利于能量和信息在不同線粒體中傳遞，線粒體內(nèi)容物及mtDNA交換互補(bǔ)[23]，另一方面，Mfn1/2的高表達(dá)有利于抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[24]。

4 結(jié)論

一次性大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后48h內(nèi)，機(jī)體通過調(diào)節(jié)線粒體融合分裂基因Drp1、Mfn2 mRNA和蛋白表達(dá)，影響大鼠額葉線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，從而調(diào)控額葉神經(jīng)元凋亡過程的發(fā)生發(fā)展；融合分裂基因Drp1、Mfn2還可能與大負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后腦組織能量代謝調(diào)節(jié)及腦缺氧耐受過程有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(編輯 孫君志)

Research onthe Frontal Neurons Apoptosis of Rats and the Mitochondrial Morphology and Expression of Drp1, Mfn2 after Overload Swimming

WANG Lu,DENG Wenqian

Objective: This study was designed to discuss the relationship between cell apoptosis of the frontal lobe induced by one-time overload exercise and the changes of mitochondrial morphology in rats,as well as the expression of Drp1、Mfn2, which are associated with mitochondrial fusion and division. Methods:48 male SD rats were randomly divided into control group(group C,n=18),one-time overload exercise group(group E,n=54). Group E was divided again into different groups based on time(immediately,24h and 48h),named group E0,E24 and E48, with 18 rats in each group.Group E: carried out one-time exhaustive swimming for 4 hours.The morphological structure of the loubusfromatis neurons and mitochondria were observed by using transmission electron microscopy, the apoptosis index (AI) detected by TUNEL method, and the mRNA and protein level of Drp1 and Mfn2 detected.Results:the rats’ frontal lobe neurons and mitochondrial appeared irregular after one-time overload exercise,but this exception returned to normal in 48hours. There was a significant reduction of AI in group E, when compared with group C(P<0.01).When compared with the AI at different time points in group E,we can see that E24>E0>E48(P<0.05). The transcription and protein expression of Drp1 and Mfn2 were significantly increased after one-time exhaustive exercise, when compared with group C(P<0.05).The Drp1 transcription and protein expression of group E48 decreased significantly (P<0.05),and the Mfn2 transcription and protein expression decreased slighter (P>0.05), when compared with group E24.Conclusion: Suggest that one-time overload movement cause an abnormal mitochondria morphology and induce cell apoptosis of the loubus fromatis. But in 48 hours tissue damage of the loubus fromatis can be reduced, or even recovery. The expression of Drp1 and the loubus fromatis cell apoptosis induced by exhaustion exercise were closely related. However, the increased expression of Mfn2 could ameliorate the development of the loubus fromatis cells apoptosis caused by exhaustion movement.

FrontalLobe;Mitochondrion;Swimming;Drp1;Mfn2

G804.7 Document code：A Article ID：1001-9154(2016)04-0076-06

四川省體育局項(xiàng)目“線粒體形態(tài)變化與細(xì)胞凋亡在大鼠極限負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中的相關(guān)性研究”(13STK18)；四川省教育廳項(xiàng)目“線粒體形態(tài)功能在大鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)后動(dòng)態(tài)變化的研究”(14ZB0262)；成都體育學(xué)院青年基金項(xiàng)目“線粒體自噬在運(yùn)動(dòng)預(yù)處理減輕一次性力竭運(yùn)動(dòng)引起的大鼠大腦損傷的作用”(15YJQN07)。

王璐，講師，研究方向：運(yùn)動(dòng)與健康。E-mail：21379183@qq.com。

成都體育學(xué)院，四川 成都 610041 Chengdu Sports Institute，Chengdu 610041，China

2016-02-14

2016-05-11

G804.7

A

1001-9154(2016)04-0076-06