神經(jīng)生長因子與軟骨缺損修復(fù)及結(jié)構(gòu)重建的關(guān)系*

王玉林， 劉有才， 杜天文， 施萬義， 趙繼軍， 趙尚軍， 尹飛翔， 賀 敏

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科四病區(qū)，內(nèi)蒙古包頭 014010)

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神經(jīng)生長因子與軟骨缺損修復(fù)及結(jié)構(gòu)重建的關(guān)系*

王玉林， 劉有才， 杜天文， 施萬義， 趙繼軍， 趙尚軍， 尹飛翔， 賀 敏

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科四病區(qū)，內(nèi)蒙古包頭 014010)

目的：探討神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)與軟骨缺損修復(fù)及結(jié)構(gòu)重建的關(guān)系。方法：取健康新西蘭大白兔16只，手術(shù)制備膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，在股骨髁間關(guān)節(jié)面制造直徑4 mm、深3 mm的骨軟骨缺損，將骨缺損家兔模型隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入NGF，1次/周，共注射4次；對照組不注入NGF，缺損空置。分別于術(shù)后第4周、第8周和第12周分別處死一批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取材，進(jìn)行大體結(jié)構(gòu)觀察和組織學(xué)觀察。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周軟骨缺損處呈纖維連接修復(fù)，8周軟骨缺損處部分軟骨修復(fù)，12周軟骨缺損處軟骨呈結(jié)節(jié)狀修復(fù)。結(jié)論：在家兔軟骨缺損的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射NGF，修復(fù)軟骨缺損，具有一定的治療效果。

神經(jīng)生長因子；軟骨缺損；透明軟骨

修復(fù)缺損的關(guān)節(jié)軟骨在骨科是一個(gè)比較難處理的問題，預(yù)后效果差，也成了近幾年來基礎(chǔ)和臨床研究關(guān)注的焦點(diǎn)。關(guān)節(jié)軟骨損傷大多伴有軟骨下骨損傷，目前通過關(guān)節(jié)鏡下單純采用磨削、馬賽克技術(shù)、軟骨細(xì)胞治療等手段都未達(dá)到理想的效果。以往人們的修復(fù)重點(diǎn)研究都在軟骨上，沒有考慮到軟骨下骨，如果損傷較深，軟骨的修復(fù)主要以纖維軟骨修復(fù)為主，修復(fù)后的關(guān)節(jié)軟骨退變比較嚴(yán)重，關(guān)節(jié)軟骨本身比較薄，修復(fù)能力差，運(yùn)用支架結(jié)構(gòu)固定比較困難，且缺乏材料。本研究于2015年12月至2016年5月采用家兔關(guān)節(jié)制造關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，進(jìn)行神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，觀察該方法能否有效促進(jìn)缺損軟骨的修復(fù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇16只健康成年家兔，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，購自包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，每籠1只，自由飲水和活動(dòng)。動(dòng)物房室溫19～24 ℃，濕度(50.2±5.4)%。正常晝夜節(jié)律。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?家兔分籠飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，腹部注射10 %水合氯醛(1.25 mL/kg)麻醉，仰臥位固定于自制木板上，頭偏向?qū)?cè)，用約束帶固定四肢，顯露出手術(shù)部位，手術(shù)區(qū)域剪毛，用酒精消毒。取家兔后肢雙側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)入路，切開關(guān)節(jié)周圍組織進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，取膝關(guān)節(jié)伸直位將髕骨推向內(nèi)側(cè)，然后屈曲膝關(guān)節(jié)，顯露股骨髁，在左右兩側(cè)用直徑4.0 mm骨科環(huán)鉆頭按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在股骨的關(guān)節(jié)面中心造成全厚關(guān)節(jié)軟骨缺損，深度以點(diǎn)狀出血為止，約3 mm。用鹽水沖洗后逐層關(guān)閉切口。待家兔完全蘇醒后放入籠中，常規(guī)分籠飼養(yǎng)。術(shù)后3 d內(nèi)，以青霉素80萬U肌肉注射預(yù)防感染，同時(shí)用碘伏清潔創(chuàng)口，2次/d。將16只家兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組8只，實(shí)驗(yàn)組(16膝)：用微量注射器將NGF(注射用鼠神經(jīng)生長因子，武漢海特生物制藥股份有限公司)注入關(guān)節(jié)腔，20μg/次，1次/周，共4次。對照組(16膝)為空白對照，對骨缺損區(qū)不做任何處理。

1.3 標(biāo)本制作 分別于術(shù)后第4周、第8周、第12周采用空氣栓塞(耳緣靜脈注射5 mL空氣)分批處死家兔。處死后立刻解剖膝關(guān)節(jié)，暴露軟骨缺損修復(fù)區(qū)域，用生理鹽水沖洗干凈，切開關(guān)節(jié)囊，顯露關(guān)節(jié)，先制作大體標(biāo)本，觀察并攝像。然后用刀片取股骨內(nèi)髁軟骨缺損修復(fù)區(qū)及其周圍的組織塊，4 ℃條件下固定24 h，脫鈣，對標(biāo)本進(jìn)行修整后用石蠟包埋，用數(shù)碼照像機(jī)對缺損區(qū)的修復(fù)狀況拍攝記錄，然后行HE染色和甲苯胺藍(lán)染色。

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)觀察 (1)術(shù)后4周：大部分實(shí)驗(yàn)組和對照組標(biāo)本缺損區(qū)內(nèi)出現(xiàn)紅色肉芽組織樣物，缺損區(qū)凹陷，填充量<30 %，與周圍軟骨界限比較明顯。(2)術(shù)后8周：實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本缺損區(qū)內(nèi)充填物為白色，質(zhì)地光滑、細(xì)膩，半透明狀,填充修復(fù)約占缺損區(qū)的60 %～70 %，對照組標(biāo)本缺損區(qū)內(nèi)充填物為白色，半透明狀,中間凹陷，填充修復(fù)約占50 % 。(3)術(shù)后12周：實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本缺損區(qū)充填物質(zhì)地更趨均勻一致，平坦，與周圍連接較好，填充修復(fù)>80 %。對照組缺損區(qū)內(nèi)大部分標(biāo)本充填物為白色、半透明狀，少部分標(biāo)本填充修復(fù)占70 %～80 %。

2.2 組織學(xué)檢查

2.2.1 HE染色觀察損傷部位(洞)軟骨的再生情況 (1)術(shù)后4周：對照組標(biāo)本均表現(xiàn)缺損區(qū)未完全充填，優(yōu)勢再生組織為少量纖維組織，與周圍軟骨無相連；實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本均表現(xiàn)缺損區(qū)未完全充填，優(yōu)勢再生組織為纖維組織，與周圍軟骨無相連。(2)術(shù)后8周：對照組標(biāo)本缺損區(qū)修復(fù)組織仍為纖維組織，凹陷，結(jié)構(gòu)不完整，一部分標(biāo)本基底有新骨形成。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本可見修復(fù)組織為少量透明軟骨樣組織，部分標(biāo)本稍凹陷。(3)術(shù)后12周：對照組標(biāo)本的缺損修復(fù)組織為纖維組織，有較好的修復(fù)，其優(yōu)勢組織多為透明樣軟骨，表面光滑、完整，大部分標(biāo)本與周圍軟骨連接較好，部分標(biāo)本仍有部分連接不良，基底部新骨形成良好。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本多為透明樣軟骨，表面光滑、完整，大部分標(biāo)本與周圍軟骨有較好連接，基底部新骨形成良好。

2.2.2 甲苯胺藍(lán)染色 (1)術(shù)后4周：實(shí)驗(yàn)組和對照組可見基質(zhì)異染不明顯。(2)術(shù)后8周：實(shí)驗(yàn)組可見基質(zhì)異染明顯，可見新生軟骨與周圍結(jié)合；對照組缺損底部有少量纖維組織，缺損周圍軟骨有退化。(3)術(shù)后12周：實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本可見新生軟骨組織藍(lán)染，與正常軟骨相平行，軟骨表型明顯；對照組可見軟骨組織藍(lán)染，軟骨表型較差。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷后，自身修復(fù)能力比較差。關(guān)于軟骨缺損修復(fù)，國內(nèi)外進(jìn)行了多方面多角度研究[1,2]，發(fā)現(xiàn)組織工程在軟骨缺損及損傷修復(fù)中效果明顯。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)軟骨缺損如果損傷到軟骨下，早期靠肉芽組織充填，7～10 d后纖維母細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞，新的修復(fù)性軟骨形成大約在損傷后的4～6周。目前臨床上治療軟骨損傷時(shí)，主要采用關(guān)節(jié)鏡下行軟骨下骨鉆孔和微骨折技術(shù)來形成新軟骨組織[3]，軟骨組織修復(fù)不是靠周圍軟骨組織爬行修復(fù)，而是新生血管形成和生長因子的共同作用。NGF促進(jìn)骨折愈合的作用是在研究修復(fù)神經(jīng)損傷的過程中偶然被發(fā)現(xiàn)的，NGF是一種多功能生長因子，在全身廣泛分布。路曉淼等[4]在大鼠骨髄基質(zhì)細(xì)胞分化過程中加入NGF，促進(jìn)骨修復(fù)過程，是成骨誘導(dǎo)的向成骨細(xì)胞分化過程。此外，關(guān)于NGF對山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用研究，證實(shí)了NGF能提高細(xì)胞骨形成的功能[5]。目前，在骨與軟骨損傷修復(fù)的各個(gè)環(huán)節(jié)上，NGF與其它生長因子之間的相互關(guān)系還不甚明了，而明確NGF在軟骨修復(fù)中的作用，將為治療關(guān)節(jié)軟骨缺損提供指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用NGF修復(fù)軟骨缺損，具有一定的治療效果，提示關(guān)節(jié)軟骨缺損后通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射NGF可促進(jìn)軟骨缺損的修復(fù)。

目前僅觀察到12周樣本，而軟骨損傷及缺損到什么時(shí)間能達(dá)到理想的修復(fù)效果，仍需要長時(shí)間、多樣本的實(shí)驗(yàn)研究。隨著人們對NGF生物學(xué)作用機(jī)制研究的不斷深入，必將有助于指導(dǎo)臨床上對軟骨損傷的治療，最大限度地緩解患者的痛苦。

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包頭市社會(huì)發(fā)展科技支撐項(xiàng)目(2015S2004-5-22)

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